Name: detection of phytophthora capsici in irrigation water using loop-mediated isothermal amplification
Uploaded: 2020-06-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification at JoVE.com

Эта работа получила финансовую поддержку Грузинской товарной комиссии по овощам проекта ID' FP00016659. Авторы благодарят д-р Pingsheng Цзи, Университет Джорджии и д-р Энн Дорранс, Университет штата Огайо за предоставление чистой культуры Phytophthora spp. Мы также благодарим Ли Ван и Делорис Вени за их техническую помощь на протяжении всего исследования.

1. Обнаружение фитофторы капсиди из оросительной воды с использованием портативного опосредованного петлей изотермального усиления
<ol><li>Настройка насоса и фильтра<ol>
<li>Прикрепите фильтруя колбу к трубке, которая подключена к ручной насос, так что, когда насос активирован, воздух...

<ol>
	<li>Hong, C., Moorman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+pathogens+in+irrigation+water:+challenges+and+opportunities.">Plant pathogens in irrigation water: challenges and opportunities.</a> Critical Reviews in Plant Sciences. 24 (3), 189-208 (2005).</li><li>Malkawi, H. I., Mohammad, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology,+Genetics,+Morphology,+&amp;+Microorganisms,+E.+o.+Survival+and+accumulation+of+microorganisms+in+soils+irrigated+with+secondary+treated+wastewater.">Physiology, Genetics, Morphology, &amp; Microorganisms, E. o. Survival and accumulation of microorganisms in soils irrigated with secondary treated wastewater.</a> Journal of Basic Microbiology. 43 (1), 47-55 (2003).</li><li>Bush, E. A., Hong, C., Stromberg, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+of+Phytophthora+and+Pythium+spp.+in+components+of+a+recycling+irrigation+system.">Fluctuations of Phytophthora and Pythium spp. in components of a recycling irrigation system.</a> Plant Disease. 87 (12), 1500-1506 (2003).</li><li>Ghimire, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+diversity+of+Phytophthora+species+in+nursery+irrigation+reservoir+adopting+water+recycling+system+during+winter+months.">Distribution and diversity of Phytophthora species in nursery irrigation reservoir adopting water recycling system during winter months.</a> Journal of Phytopathology. 159 (11-12), 713-719 (2011).</li><li>Hausbeck, M. K., Lamour, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytophthora+capsici+on+vegetable+crops:+research+progress+and+management+challenges.">Phytophthora capsici on vegetable crops: research progress and management challenges.</a> Plant Disease. 88 (12), 1292-1303 (2004).</li><li>Gevens, A., Donahoo, R., Lamour, K., Hausbeck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Phytophthora+capsici+from+Michigan+surface+irrigation+water.">Characterization of Phytophthora capsici from Michigan surface irrigation water.</a> Phytopathology. 97 (4), 421-428 (2007).</li><li>Thomson, S., Allen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+Phytophthora+species+and+other+potential+plant+pathogens+in+recycled+irrigation+water.">Occurrence of Phytophthora species and other potential plant pathogens in recycled irrigation water.</a> Plant Disease Reporter. 58 (10), 945-949 (1974).</li><li>Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oomycete+broad-host-range+pathogen+Phytophthora+capsici.">The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsici.</a> Journal of Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).</li><li>Sanogo, S., Ji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+management+in+relation+to+control+of+Phytophthora+capsici+in+vegetable+crops.">Water management in relation to control of Phytophthora capsici in vegetable crops.</a> Agricultural Water Management. 129, 113-119 (2013).</li><li>Zhang, Z., Li, Y., Fan, H., Wang, Y., Zheng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+detection+of+Phytophthora+capsici+in+infected+plant+tissues,+soil+and+water.">Molecular detection of Phytophthora capsici in infected plant tissues, soil and water.</a> Plant Pathology. 55 (6), 770-775 (2006).</li><li>Trout, C., Ristaino, J., Madritch, M., Wangsomboondee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+Phytophthora+infestans+in+late+blight-infected+potato+and+tomato+using+PCR.">Rapid detection of Phytophthora infestans in late blight-infected potato and tomato using PCR.</a> Plant Disease. 81 (9), 1042-1048 (1997).</li><li>Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+advanced+techniques+for+detecting+plant+diseases.">A review of advanced techniques for detecting plant diseases.</a> Commputers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+improved+isolation+approach+and+simple+sequence+repeat+markers+to+characterize+Phytophthora+capsici+populations+in+irrigation+ponds+in+southern+Georgia.">Development of an improved isolation approach and simple sequence repeat markers to characterize Phytophthora capsici populations in irrigation ponds in southern Georgia.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5467-5473 (2009).</li><li>Ali-Shtayeh, M., MacDonald, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+Phytophthora+species+in+irrigation+water+in+the+Nablus+area+(West+Bank+of+Jordan).">Occurrence of Phytophthora species in irrigation water in the Nablus area (West Bank of Jordan).</a> Phytopathologia Mediterranea. , 143-150 (1991).</li><li>Pringsh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+serological+and+culture+plate+methods+for+detecting+species+of+Phytophthora,+Pythium,+and+Rhizoctonia+in+ornamental+plants.">Comparison of serological and culture plate methods for detecting species of Phytophthora, Pythium, and Rhizoctonia in ornamental plants.</a> Plant Disease. 74 (9), 655 (1990).</li><li>Stewart-Wade, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+pathogens+in+recycled+irrigation+water+in+commercial+plant+nurseries+and+greenhouses:+their+detection+and+management.">Plant pathogens in recycled irrigation water in commercial plant nurseries and greenhouses: their detection and management.</a> Irrigation Science. 29 (4), 267-297 (2011).</li><li>Aragaki, M., Uchida, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+distinctions+between+Phytophthora+capsici+and+P.+tropicalis+sp.+nov.">Morphological distinctions between Phytophthora capsici and P. tropicalis sp. nov.</a> Mycologia. 93 (1), 137-145 (2001).</li><li>Tomlinson, J., Boonham, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+LAMP+for+detection+of+plant+pathogens.">Potential of LAMP for detection of plant pathogens.</a> CAB Reviews Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources. 3 (066), 1-7 (2008).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR-based+assay+for+distinguishing+between+A1+and+A2+mating+types+of+Phytophthora+capsici.">A PCR-based assay for distinguishing between A1 and A2 mating types of Phytophthora capsici.</a> Journal of the American Society for Horticultural Science. 142 (4), 260-264 (2017).</li><li>Dong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+assay+for+sensitive+and+rapid+detection+of+Phytophthora+capsici.">Loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Phytophthora capsici.</a> Canadian Journal of Plant Pathology. 37 (4), 485-494 (2015).</li><li>Khan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+the+LAMP+assay+and+PCR-based+assays+for+the+rapid+detection+of+Alternaria+solani.">Comparative evaluation of the LAMP assay and PCR-based assays for the rapid detection of Alternaria solani.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2089 (2018).</li><li>Sowmya, N., Thakur, M., Manonmani, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+DNA+extraction+method+for+the+detection+of+enterotoxigenic+Staphylococcus+aureus+directly+from+food+samples:+comparison+of+PCR+and+LAMP+methods.">Rapid and simple DNA extraction method for the detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus directly from food samples: comparison of PCR and LAMP methods.</a> Journal of Applied Microbiology. 113 (1), 106-113 (2012).</li><li>Waliullah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+different+molecular+and+serological+methods+for+detection+of+Xylella+fastidiosa+in+blueberry.">Comparative analysis of different molecular and serological methods for detection of Xylella fastidiosa in blueberry.</a> PLOS ONE. 14 (9), 0221903 (2019).</li><li>B&#246;hm, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantitative+PCR:+DNA+determination+in+isolated+spores+of+the+mycorrhizal+fungus+Glomus+mosseae+and+monitoring+of+Phytophthora+infestans+and+Phytophthora+citricola+in+their+respective+host+plants.">Real-time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants.</a> Journal of Phytopathology. 147, 409-416 (1999).</li><li>Klimczak, L., Prell, H. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mitochondrial+DNA+of+the+oomycetous+fungus+Phytophthora+infestans.">Isolation and characterization of mitochondrial DNA of the oomycetous fungus Phytophthora infestans.</a> Current Genetics. 8 (4), 323-326 (1984).</li><li>Ghimire, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Phytophthora+species+in+a+run-off+water+retention+basin+at+a+commercial+nursery+in+plant+hardiness+zones+7+b+of+Virginia+in+winter.">Detection of Phytophthora species in a run-off water retention basin at a commercial nursery in plant hardiness zones 7 b of Virginia in winter.</a> Phytopathology. 96 (6), (2006).</li><li>Feng, W., Hieno, A., Kusunoki, M., Suga, H., Kageyama, K. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LAMP+detection+of+four+plant-pathogenic+oomycetes+and+its+application+in+lettuce+fields.">LAMP detection of four plant-pathogenic oomycetes and its application in lettuce fields.</a> Plant Disease. 103 (2), 298-307 (2019).</li><li>Aglietti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+loop-mediated+isothermal+amplification:+an+early-warning+tool+for+quarantine+plant+pathogen+detection.">Real-time loop-mediated isothermal amplification: an early-warning tool for quarantine plant pathogen detection.</a> AMB Express. 9 (1), 50 (2019).</li><li>Almasi, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+colorimetric+loop-mediated+isothermal+amplification+assay+for+the+visual+detection+of+Fusarium+oxysporum+f.+sp.+melonis.">Development of a colorimetric loop-mediated isothermal amplification assay for the visual detection of Fusarium oxysporum f. sp. melonis.</a> Horticultural Plant Journal. 5 (3), 129-136 (2019).</li><li>Gill, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+Pythium+from+irrigation+ponds.">Pathogenic Pythium from irrigation ponds.</a> Plant Disease Reporter. 54 (12), 1077-1079 (1970).</li></ol>

Тестирование оросительной воды для фитопатогенов является важным шагом для производителей, использующих ирригационные пруды и переработанную воду27. Ирригационные пруды обеспечивают водохранилище и питательную пластырь для ряда фитопатогенов, так как избыточная оросит...

Переработка воды на фермах и в детских садах становится все более популярной в связи с ростом цен на воду и экологическими проблемами, связанными с использованием воды. Для производителей было разработано множество методов орошения для сокращения распространения и возникновения болезней растений. Независимо от источника воды (орошения или осадков), сток генерируется, и многие овощеводы и питомники имеют пруд для сбора и переработки стока1. Это создает резервуар для возможного накопления патогенов в пользу распространения патогенных микроорганизмов, когда переработанная вода используется дляорошения сельскохозяйственных культур 2,,3,,4. Oomycete растительных патогенов особенно извлечь выгоду из этойпрактики,как зооспоры будут накапливаться в воде и первичной диспергаторной споры является самодвижительным, нотребует поверхностных вод 5,6,7. Phytophthora capsici является патогеном oomycete, который влияет на значительное количество соланацезных и cucurbit культур по-разному8. Часто симптомы демпфирования-офф саженцев, корнеплодов и коронки гнили; однако, в таких культурах, как огурец, тыква, дыня, тыква, арбуз, баклажаны и перец, целые урожаи могут быть потеряны из-за фруктовойгнили 9. Хотя Есть известные методы обнаружения этого патогена растений, большинство требуют инфекции уже имели место, которое слишком поздно для любых профилактических фунгицидов, чтобы иметь значительныйэффект 10.
Традиционный метод проверки оросительной воды для выявления и диагностики целевых микроорганизмов является устаревшим подходом, когда скорость и чувствительность имеют решающее значение для успеха иприбыльного производства сельскохозяйственных культур 11,,12. Ткань растений, восприимчивая к целевому патогену (например, баклажаны для P. capsici) крепится к модифицированной ловушке, которая приостанавливается в оросительном пруду в течение длительного периода времени, прежде чем быть удалены и проверены на инфекцию. Образцы из растительной ткани затем помылись на полу селективных средств массовой информации (PARPH) и инкубируется для роста культуры, то морфологическая идентификация выполняется с помощьюсоединения микроскопа 13. Есть и другие аналогичные методы обнаружения для других патогенных микроорганизмов растений с использованием селективных средств массовой информации и покрытие небольшое количество загрязненнойводы до суб-культа 14,15. Эти методы требуют от 2 до 6 недель, несколько раундов суб-культирования, чтобы изолировать организм, и опыт по фитофторы диагностики, чтобы иметь возможность распознавать ключевые морфологические символы каждого вида. Эти традиционные методы не работают хорошо для обнаружения оросительной воды, загрязненной P. capsici из-за таких факторов, как вмешательство других микроорганизмов, которые также присутствуют в источниках воды. Некоторые быстрорастущие микроорганизмы, такие как Pythium spp. и бактерии, передающие воду, могут разрастаться на пластине, делая P. capsici необнаружимым16,,17.
Целью данного исследования была разработка чувствительного и специфического молекулярного метода, который может быть использован как в полевых, так и в лабораторных условиях для обнаружения зооспоров P. capsici в оросительной воде. Протокол включает в себя разработку нового цикла опосредованного изотермального усиления (LAMP) грунтовки набор, способный специально усилить P. capsici, на основе 1121-базовой пары (bp) фрагмент P. capsici18,19. Ранее разработанная грунтовка LAMP от Dong et al. (2015) была использована по сравнению с анализом, который был разработан для этого исследования20.
Анализ LAMP является относительно новой формой молекулярного обнаружения, которая была продемонстрирована как более быстрая, чувствительная и специфичная, чем обычная полимераза цепная реакция (PCR)21. В целом, обычные анализы ПЦР не могут обнаружить менее 500 копий (1,25 пг/ОЛ); в отличие от этого, предыдущие исследования показали, что чувствительность LAMP может быть от 10 до 1000 раз выше, чем обычные ПЦР и может легко обнаружить даже 1 fg/L геномнойДНК 22,23. Кроме того, анализ может быть проведен быстро (часто в 30 мин) и на месте (в поле) с помощью портативного нагревательного блока для усиления и колоритетрического красителя, который меняет цвет для положительного образца (удаление необходимости электрофореза). В этом исследовании мы сравнили чувствительность анализов ПЦР и LAMP с помощью метода извлечения фильтра. Предлагаемый метод обнаружения позволяет исследователям и агентам расширения легко обнаружить наличие спор P. capsici из различных источников воды менее чем за два часа. Анализ оказался более чувствительным, чем обычные ПЦР и был проверен на месте, обнаружив наличие патогена в оросительной воде, используемой производителем. Этот метод обнаружения позволит производителям оценить наличие и плотность популяции патогена в различных источниках воды, которые используются для орошения, предотвращая разрушительные вспышки и экономические потери.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose gel powder</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C997J85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buchner funnel</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>JBF003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBX24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTAB solution</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>786-565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Flask</td>
			<td>United</td>
			<td>FHFL1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>FPR009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Green 10000X</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>B003B68 (1/EA)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genie III</td>
			<td>OptiGene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand pump</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1163B06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso-amyl Alcohol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP1150-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAVA LAMP master mix</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>30086-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bead DNA extraction</td>
			<td>Genesig</td>
			<td>genesigEASY-EK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Separator</td>
			<td>Genesig</td>
			<td>genesigEASY-MR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PVP40-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Mini Centrifuge</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>C1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Gel Doc</td>
			<td>Analytik Jena</td>
			<td>849-00502-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warmstart Colorimetric Dye</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>E1800m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704489EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% isopropanol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A451-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of phytophthora capsici in irrigation water using loop-mediated isothermal amplification

Phytophthora capsici является разрушительным патогеном oomycete, который влияет на многие важные соланацеозные и кукурбитовые культуры, ежегодно причиняющие значительные экономические потери в производстве овощей. Phytophthora capsici является почвенной и постоянной проблемой на овощных полях из-за его долгожил структур выживания (oospores и chlamydospores), которые сопротивляются выветривания и деградации. Основным методом рассеивания является производство зооспоров, которые являются одноклеточные, флагеллированные споры, которые могут плавать через тонкие пленки воды, присутствующие на поверхностях или в заполненных водой пор почвы и может накапливаться в лужах и прудах. Таким образом, ирригационные пруды могут быть источником патогена и первоначальными точками вспышек болезней. Обнаружение P. capsici в оросительной воде трудно использовать традиционные методы, основанные на культуре, потому что другие микроорганизмы, присутствующие в окружающей среде, такие как Pythium spp., обычно перерастают P. capsici, что делает его необнаружимым. Чтобы определить наличие спор P. capsici в источниках воды (оросительная вода, сток и т.д.), мы разработали ручной насос на основе фильтровальной бумаги (8-10 мкм) метод, который захватывает споры патогена (zoospores) и позже используется для усиления ДНК патогена через новый цикл опосредованного изотермального усиления (LAMP) анализ, предназначенный для конкретного усиления P. capsici. Этот метод может усилить и обнаружить ДНК из концентрации, как низко как 1,2 х10 2 зооспоров / мл, что в 40 раз более чувствительны, чем обычные ПЦР. При тестировании близко связанных видов не было получено перекрестного усиления. LAMP также была выполнена с помощью цветометрического LAMP мастер смеси красителя, отображение результатов, которые могут быть прочитаны невооруженным глазом для быстрого обнаружения на месте. Этот протокол может быть адаптирован к другим патогенным микроорганизмам, которые обитают, накапливаются или рассредоточены через загрязненные ирригационные системы.

Оптимизация метода LAMP В этом исследовании, мы обнаружили наличие Phytophthora capsici в оросительной воде с помощью портативной петли опосредованного изотермального усиления (LAMP) анализ. Во-первых, предлагаемый анализ LAMP был оптимизирован путем тестирования различных концентра...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification at JoVE.com

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

Мы разработали метод обнаружения Phytophthora capsici zoospores в источниках воды с помощью метода извлечения ДНК фильтровальной бумаги в сочетании с циклом опосредованного изотермального усиления (LAMP) анализ, который может быть проанализирован в полевых условиях или в лаборатории.

Обнаружение фитофторы капсиди в оросительной воде с помощью loop-Mediated Isothermal Amplification

Phytophthora capsici is a devastating oomycete pathogen that affects many important solanaceous and cucurbit crops causing significant economic losses in ...

Обнаружение фитопатогенов является важным шагом в управлении болезнями растений. Этот протокол обеспечивает метод быстрого обнаружения загрязнения оросительных вод из-за общего патогена истребителя, передающихся через воду. Используя этот метод, специфический патоген, такой как phytophthora capcici, может быть обработан и быстро обнаружен из нашего большого объема оросительной воды, оставаясь на месте.Демонстрация процедуры будет Оуэн Хадсон, студент мастеров из моей лаборатории, и Sumyya Waliullah, постдокторант исследователь из лаборатории Dr.Pingxi G, чтобы создать насос и фильтр для на месте Phytophthora capcici обнаружения в оросительной воде. Прикрепите фильтровальную колбу к трубке, подключенной к ручной насосу, и прикрепите воронку бухнера в резиновую пробку во рту фильтруя колбы. Затем поместить соответствующий размер кусок фильтровальной бумаги с 15 микрон удержания размера в воронку.Для получения проб воды собирают оросительную воду из целевого источника. Вода может иметь небольшое количество мусора, но не значительные осадки или почвы. Медленно залить от 50 до 1000 миллилитров испытательной воды над фильтровальной бумагой внутри воронки при использовании ручного насоса для создания всасывания тянуть воду через воронку.Когда вся вода была отфильтровата, используйте типсы, чтобы удалить фильтровальную бумагу из воронки. И использовать стерильные ножницы, чтобы разрезать бумагу на мелкие кусочки. Погрузите от восьми до 12 кусков бумаги в 400 микролитров буфера извлечения в 1,5 миллилитровую трубку в течение пяти минут инкубации при комнатной температуре.Vortex или иным образом агитировать бумагу в течение 10 секунд раз в минуту. В конце инкубации используйте типсы, чтобы удалить бумагу с как можно меньшего буфера. И повторите лицензию со следующим набором фильтровальной бумаги штук.Для извлечения ДНК из образцов фильтровальной бумаги добавлено 20 микролитров протеиназы K и 10 микролитров по 10 нанограмм на микролитер РНК в образец тоже и инкубировать раствор при комнатной температуре в течение 15 минут с вихрем или тряской каждые три минуты. В конце инкубации добавьте 500 микролитров магнитных бусин в буфер связывания с образцом и хорошо перемешайте, встряхивая. После пяти минут при комнатной температуре, поместите трубку и магнитный сепаратор стойку в течение двух минут, прежде чем удалить и отказаться от супернатанта.Снимите трубку с магнитного сепаратора и энергично повторно приостановите бисер в 500 микролитров буфера стирки. Через 30 секунд вернуть трубку к магниту и подождать две минуты, прежде чем отказаться от супернатанта. Повторите стирку с 500 микролитров мыть буфера тоже и 500 микролитров 80% этанола, как только что продемонстрировали.И воздух диск магнитных гранул шарика в течение 15 минут при комнатной температуре. В конце инкубации повторно приостановить бисер в 50 микролитров элеватора элюционного буфера с пипеткой в течение одной минуты, прежде чем поместить трубку обратно на магнит в течение двух минут, чтобы сбор супернатанта. После подготовки смеси LAMP грунтовки, как указано в таблице, добавить на 2,5 микролитров грунтовки смесь 12,5 микролитров лавы LAMP mastermix один микролитр извлеченной ДНК и девять микролитров двойной дистиллированной воды в трубку ПЦР и создать один положительный и один отрицательный контроль.инкубировать все образцы в 64 градусов по Цельсию тепла блог в течение 45 минут или джинна три инструмента усиления в конце инкубации, нагрузка из пяти микролитров каждого усиленный образец на 1%agarose гель и изображение в результате полосы на ультрафиолетовой машины изображения. Если был использован калорийный краситель, просмотрите изменение цвета, чтобы определить результаты как положительные или отрицательные. Если использовался портативный инструмент усиления, просмотрите график усиления на экране, чтобы определить результаты.Оптическое время для запуска анализа LAMP при 64 градусах составляет 45 минут, так как самые низкие концентрации, которые были положительными для обнаружения, не усиливаются до 40 минут, в то время как более высокие концентрации усиливаются на 20 минут. Усиление может быть подтверждено на 1%agarose гель помечены нуклеиновой кислоты пятно. Как показано на примере обычных ПЦР в 40 раз менее чувствительны, чем LAMP.Обнаружение 4,8 раза от 10 до третьего зооспора на миллилитр концентрации на самом низком уровне. В ходе этого анализа были взяты пробы воды из семи прудов, используемых для коммерческого производства овощей в округе Тифт, штат Джорджия. Три из которых продемонстрировали положительные результаты LAMP.Однако, когда образцы были протестированы обычным пЦР, зооспоры были обнаружены только в одном из трех положительных образцов. В этой таблице суммируются различия между методами обнаружения с использованием таких переменных, как чувствительность, время, необходимая подготовка, материалы и стоимость. LAMP является наименее дорогим методом среди проверенных методов, а также является самым быстрым, требуя всего от 30 до 60 минут для усиления по сравнению с обычным усилением ПЦР.Использование этого протокола ДНК, извлеченной из тесно связанных патогенов семян UMI, не приводит ни к обнаружению ни одного из образцов, подтверждая специфичность грунтовок. Убедитесь в том, чтобы не залить образец воды слишком быстро и быть осторожным при добавлении извлеченной ДНК в трубы LAMP, чтобы ограничить загрязнение. После того, как другие патогенные микроорганизмы, передающихся через воду, разработали свои специфические наборы грунтовки, методы фильтрации и ламповой кислоты могут быть адаптированы для других патогенных микроорганизмов.

Research

JoVE Journal

Environment

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

Колориметрический бумажной основе Обнаружение<em&gt; Кишечная палочка</em&gt;,<em&gt; Сальмонелла</em&gt; SPP., И<em&gt; листерий</em&gt; Из больших объемов воды для сельского хозяйства

This protocol describes rapid colorimetric detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from large volumes (10 L) of ...

Laboratory-determined Phosphorus Flux from Lake Sediments as a Measure of Internal Phosphorus Loading

Лабораторно-определяется Фосфор поток от озерных отложениях в качестве меры внутреннего фосфора Загрузка

Eutrophication is a water quality issue in lakes worldwide, and there is a critical need to identify and control nutrient sources. Internal phosphorus (P) ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Method 1615 Измерение энтеровирус и Норовирус Происшествия в воде культуры и RT-КПЦР. I. Сбор образцов вирусов

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) Fluorometry

A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated WATER-PAM Fluorometry

Малый объем биопроб для оценки бактериального / фитопланктона Сотрудничество культуры с использованием воды, импульсно-модулированные по амплитуде (вода-PAM) флюорометрия

Conventional methods for experimental manipulation of microalgae have employed large volumes of culture (20 ml to 5 L), so that the culture can be ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Метод 1615 Измерение энтеровирус и Норовирус Происшествия в воде культуры и РТ-КПЦР. Часть III. Обнаружение Вирус РТ-КПЦР

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

Дуплексной связи с цифровой ПЦР-анализ для одновременного Количественное определение<em&gt; Enterococcus SPP.</em&gt; И человеческая Фекальные-ассоциированный HF183 Marker в водах

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

Скрининг на эндокринную активность в воде с использованием коммерчески доступного<em&gt; In Vitro</em&gt; Трансактивационную Биотесты

In vitro transactivation bioassays have shown promise as water quality monitoring tools, however their adoption and widespread application has been ...

A Simple Planting Technique for Re-establishing Trees Where Frequent Inundation Occurs

Простая посадка техника для воссоздания деревьев, где происходит частое затопление

Many of the Everglades tree islands have lost elevation over the past century and most of their trees have died such that they are now covered with ...

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Биоиндикация тестирования потока среды пригодности для молодых пресноводных жемчужное мидии с использованием методов экспозиции в Situ

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol ...

Optimized Procedure for Determining the Adsorption of Phosphonates onto Granular Ferric Hydroxide using a Miniaturized Phosphorus Determination Method

Оптимизированная процедура определения адсорбции фосфонаты на гранулированный гидроокисью железа с помощью миниатюрных метод определения фосфора

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric ...