Name: detection of phytophthora capsici in irrigation water using loop-mediated isothermal amplification
Uploaded: 2020-06-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification at JoVE.com

Detta arbete fick ekonomiskt stöd från Georgia Commodity Commission for Vegetables projekt-ID# FP00016659. Författarna tackar Dr Pingsheng Ji, University of Georgia och Dr Anne Dorrance, Ohio State University för att ge rena kulturer av Phytophthora spp. Vi tackar också Li Wang och Deloris Veney för deras tekniska hjälp under hela studien.

1. På plats upptäckt av Phytophthora capsici från bevattningsvatten med hjälp av bärbara loop-medierad isotermisk förstärkning
<ol><li>Ställa in pumpen och filtret<ol>
<li>Sätt fast en filtreringskolv på ett rör som är anslutet till en handpump så att när pumpen är aktiverad kommer luft att dras in genom mynningen på filtreringskolven.</li>
		<li>Montera Buchnertratten i gummiproppen på filtreringskolvens mynning och passa in den lämpligt stora filterpappret i Buchnertratten så att luft dras...

<ol>
	<li>Hong, C., Moorman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+pathogens+in+irrigation+water:+challenges+and+opportunities.">Plant pathogens in irrigation water: challenges and opportunities.</a> Critical Reviews in Plant Sciences. 24 (3), 189-208 (2005).</li><li>Malkawi, H. I., Mohammad, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology,+Genetics,+Morphology,+&amp;+Microorganisms,+E.+o.+Survival+and+accumulation+of+microorganisms+in+soils+irrigated+with+secondary+treated+wastewater.">Physiology, Genetics, Morphology, &amp; Microorganisms, E. o. Survival and accumulation of microorganisms in soils irrigated with secondary treated wastewater.</a> Journal of Basic Microbiology. 43 (1), 47-55 (2003).</li><li>Bush, E. A., Hong, C., Stromberg, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+of+Phytophthora+and+Pythium+spp.+in+components+of+a+recycling+irrigation+system.">Fluctuations of Phytophthora and Pythium spp. in components of a recycling irrigation system.</a> Plant Disease. 87 (12), 1500-1506 (2003).</li><li>Ghimire, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+diversity+of+Phytophthora+species+in+nursery+irrigation+reservoir+adopting+water+recycling+system+during+winter+months.">Distribution and diversity of Phytophthora species in nursery irrigation reservoir adopting water recycling system during winter months.</a> Journal of Phytopathology. 159 (11-12), 713-719 (2011).</li><li>Hausbeck, M. K., Lamour, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytophthora+capsici+on+vegetable+crops:+research+progress+and+management+challenges.">Phytophthora capsici on vegetable crops: research progress and management challenges.</a> Plant Disease. 88 (12), 1292-1303 (2004).</li><li>Gevens, A., Donahoo, R., Lamour, K., Hausbeck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Phytophthora+capsici+from+Michigan+surface+irrigation+water.">Characterization of Phytophthora capsici from Michigan surface irrigation water.</a> Phytopathology. 97 (4), 421-428 (2007).</li><li>Thomson, S., Allen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+Phytophthora+species+and+other+potential+plant+pathogens+in+recycled+irrigation+water.">Occurrence of Phytophthora species and other potential plant pathogens in recycled irrigation water.</a> Plant Disease Reporter. 58 (10), 945-949 (1974).</li><li>Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oomycete+broad-host-range+pathogen+Phytophthora+capsici.">The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsici.</a> Journal of Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).</li><li>Sanogo, S., Ji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+management+in+relation+to+control+of+Phytophthora+capsici+in+vegetable+crops.">Water management in relation to control of Phytophthora capsici in vegetable crops.</a> Agricultural Water Management. 129, 113-119 (2013).</li><li>Zhang, Z., Li, Y., Fan, H., Wang, Y., Zheng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+detection+of+Phytophthora+capsici+in+infected+plant+tissues,+soil+and+water.">Molecular detection of Phytophthora capsici in infected plant tissues, soil and water.</a> Plant Pathology. 55 (6), 770-775 (2006).</li><li>Trout, C., Ristaino, J., Madritch, M., Wangsomboondee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+Phytophthora+infestans+in+late+blight-infected+potato+and+tomato+using+PCR.">Rapid detection of Phytophthora infestans in late blight-infected potato and tomato using PCR.</a> Plant Disease. 81 (9), 1042-1048 (1997).</li><li>Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+advanced+techniques+for+detecting+plant+diseases.">A review of advanced techniques for detecting plant diseases.</a> Commputers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+improved+isolation+approach+and+simple+sequence+repeat+markers+to+characterize+Phytophthora+capsici+populations+in+irrigation+ponds+in+southern+Georgia.">Development of an improved isolation approach and simple sequence repeat markers to characterize Phytophthora capsici populations in irrigation ponds in southern Georgia.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5467-5473 (2009).</li><li>Ali-Shtayeh, M., MacDonald, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+Phytophthora+species+in+irrigation+water+in+the+Nablus+area+(West+Bank+of+Jordan).">Occurrence of Phytophthora species in irrigation water in the Nablus area (West Bank of Jordan).</a> Phytopathologia Mediterranea. , 143-150 (1991).</li><li>Pringsh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+serological+and+culture+plate+methods+for+detecting+species+of+Phytophthora,+Pythium,+and+Rhizoctonia+in+ornamental+plants.">Comparison of serological and culture plate methods for detecting species of Phytophthora, Pythium, and Rhizoctonia in ornamental plants.</a> Plant Disease. 74 (9), 655 (1990).</li><li>Stewart-Wade, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+pathogens+in+recycled+irrigation+water+in+commercial+plant+nurseries+and+greenhouses:+their+detection+and+management.">Plant pathogens in recycled irrigation water in commercial plant nurseries and greenhouses: their detection and management.</a> Irrigation Science. 29 (4), 267-297 (2011).</li><li>Aragaki, M., Uchida, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+distinctions+between+Phytophthora+capsici+and+P.+tropicalis+sp.+nov.">Morphological distinctions between Phytophthora capsici and P. tropicalis sp. nov.</a> Mycologia. 93 (1), 137-145 (2001).</li><li>Tomlinson, J., Boonham, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+LAMP+for+detection+of+plant+pathogens.">Potential of LAMP for detection of plant pathogens.</a> CAB Reviews Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources. 3 (066), 1-7 (2008).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR-based+assay+for+distinguishing+between+A1+and+A2+mating+types+of+Phytophthora+capsici.">A PCR-based assay for distinguishing between A1 and A2 mating types of Phytophthora capsici.</a> Journal of the American Society for Horticultural Science. 142 (4), 260-264 (2017).</li><li>Dong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+assay+for+sensitive+and+rapid+detection+of+Phytophthora+capsici.">Loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Phytophthora capsici.</a> Canadian Journal of Plant Pathology. 37 (4), 485-494 (2015).</li><li>Khan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+the+LAMP+assay+and+PCR-based+assays+for+the+rapid+detection+of+Alternaria+solani.">Comparative evaluation of the LAMP assay and PCR-based assays for the rapid detection of Alternaria solani.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2089 (2018).</li><li>Sowmya, N., Thakur, M., Manonmani, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+DNA+extraction+method+for+the+detection+of+enterotoxigenic+Staphylococcus+aureus+directly+from+food+samples:+comparison+of+PCR+and+LAMP+methods.">Rapid and simple DNA extraction method for the detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus directly from food samples: comparison of PCR and LAMP methods.</a> Journal of Applied Microbiology. 113 (1), 106-113 (2012).</li><li>Waliullah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+different+molecular+and+serological+methods+for+detection+of+Xylella+fastidiosa+in+blueberry.">Comparative analysis of different molecular and serological methods for detection of Xylella fastidiosa in blueberry.</a> PLOS ONE. 14 (9), 0221903 (2019).</li><li>B&#246;hm, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantitative+PCR:+DNA+determination+in+isolated+spores+of+the+mycorrhizal+fungus+Glomus+mosseae+and+monitoring+of+Phytophthora+infestans+and+Phytophthora+citricola+in+their+respective+host+plants.">Real-time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants.</a> Journal of Phytopathology. 147, 409-416 (1999).</li><li>Klimczak, L., Prell, H. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mitochondrial+DNA+of+the+oomycetous+fungus+Phytophthora+infestans.">Isolation and characterization of mitochondrial DNA of the oomycetous fungus Phytophthora infestans.</a> Current Genetics. 8 (4), 323-326 (1984).</li><li>Ghimire, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Phytophthora+species+in+a+run-off+water+retention+basin+at+a+commercial+nursery+in+plant+hardiness+zones+7+b+of+Virginia+in+winter.">Detection of Phytophthora species in a run-off water retention basin at a commercial nursery in plant hardiness zones 7 b of Virginia in winter.</a> Phytopathology. 96 (6), (2006).</li><li>Feng, W., Hieno, A., Kusunoki, M., Suga, H., Kageyama, K. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LAMP+detection+of+four+plant-pathogenic+oomycetes+and+its+application+in+lettuce+fields.">LAMP detection of four plant-pathogenic oomycetes and its application in lettuce fields.</a> Plant Disease. 103 (2), 298-307 (2019).</li><li>Aglietti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+loop-mediated+isothermal+amplification:+an+early-warning+tool+for+quarantine+plant+pathogen+detection.">Real-time loop-mediated isothermal amplification: an early-warning tool for quarantine plant pathogen detection.</a> AMB Express. 9 (1), 50 (2019).</li><li>Almasi, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+colorimetric+loop-mediated+isothermal+amplification+assay+for+the+visual+detection+of+Fusarium+oxysporum+f.+sp.+melonis.">Development of a colorimetric loop-mediated isothermal amplification assay for the visual detection of Fusarium oxysporum f. sp. melonis.</a> Horticultural Plant Journal. 5 (3), 129-136 (2019).</li><li>Gill, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+Pythium+from+irrigation+ponds.">Pathogenic Pythium from irrigation ponds.</a> Plant Disease Reporter. 54 (12), 1077-1079 (1970).</li></ol>

Testningen av bevattningsvatten för fytopatogener är ett avgörande steg för odlare som använder bevattningsdammar och återvunnet vatten27. Bevattning dammar ger en reservoar och grogrund för ett antal fytopatogener som överskott bevattningsvatten riktas från fältet till dammen som bär med sig några patogener som kan ha varitnärvarande 16,27. Den traditionella metoden för detektering av en växt patogener i en stor vattenkäll...

Återvinning av vatten i gårdar och plantskolor blir allt populärare på grund av de ökade vattenkostnaderna och miljöhänserna bakom vattenanvändningen. Många bevattningsmetoder har utvecklats för odlare för att minska spridningen och förekomsten av växtsjukdom. Oavsett källan till vattnet (bevattning eller nederbörd), avrinning genereras, och många vegetabiliska och plantskola odlare har en damm för att samla in och återvinna avrinning1. Detta skapar en reservoar för eventuella patogen ansamling gynnar spridningen av patogener när det återvunna vattnet används för att bevattna grödor2,3,4. Oomycete växt patogener särskilt dra nytta av denna praxis som zoosporer kommer att ackumuleras i vatten och den primära dispersiva sporen är självmotila men kräver ytvatten5,6,7. Phytophthora capsici är en oomycete patogen som påverkar ett betydande antal solanaceous och cucurbit grödor på olika sätt8. Ofta är symptomen dämpning-off av plantor, rot och krona röta; dock i grödor som gurka, squash, melon, pumpa, vattenmelon, aubergine och peppar, kan hela skördar gå förlorade på grund av fruktröta9. Även om det finns kända metoder för att upptäcka denna växt patogen, de flesta kräver en infektion har redan ägt rum som är för sent för någon förebyggande fungicider att ha en betydande effekt10.
Den traditionella metoden för att testa bevattningsvatten för detektion och diagnos av riktade mikroorganismer är en föråldrad strategi när hastighet och känslighet är avgörande för framgång och lönsam växtodling11,12. Växtvävnad som är mottagliga för den riktade patogenen (t.ex. aubergine för P. capsici) är fäst vid en modifierad fälla som är upphängd i en bevattningsdamm under längre tid innan den tas bort och inspekteras för infektion. Prover från växtvävnaden pläteras sedan på semiselektiva medier (PARPH) och inkuberas för odlingstillväxt, därefter utförs morfologisk identifiering med hjälp av ett sammansatt mikroskop13. Det finns andra liknande detektionsmetoder för andra växtpatogener som använder selektiva medier och plätering av små mängder förorenat vatten före sub-culturing14,15. Dessa metoder kräver allt från 2 till 6 veckor, flera omgångar av sub-culturing att isolera organismen, och erfarenhet på Phytophthora diagnostik för att kunna känna igen de viktigaste morfologiska tecken av varje art. Dessa traditionella metoder fungerar inte bra för detektion av bevattningsvatten förorenat av P. capsici på grund av faktorer som inblandning av andra mikroorganismer som också finns i vattenkällorna. Vissa snabbväxande mikroorganismer som Pythium spp. och vattenburna bakterier kan växa över på plattan vilket gör P. capsici omöjlig att upptäcka16,17.
Syftet med denna studie var att utveckla en känslig och specifik molekylär metod som kan användas i både fält- och laboratoriemiljöer för att upptäcka P. capsici zoospores i bevattningsvatten. Protokollet omfattar utvecklingen av en roman loop-medierad isotermisk förstärkning (LAMP) primer uppsättning kunna särskilt amplifiera P. capsici, baserat på en 1121-bas par (bp) fragment av P. capsici18,19. En tidigare utvecklad LAMP-primer från Dong et al. (2015) användes i jämförelse med den analys som utvecklades för denna studie20.
LAMP-analysen är en relativt ny form av molekylär detektion som har visat sig vara snabbare, känsligare och specifika än konventionell polymeraskedjereaktion (PCR)21. I allmänhet kan konventionella PCR-analyser inte upptäcka under 500 kopior (1,25 pg/μL); däremot har tidigare studier visat att LYKTS känslighet kan vara 10 till 1 000 gånger högre än konventionell PCR och lätt kan upptäcka även 1 fg/μL av genomiskt DNA22,23. Dessutom kan analysen utföras snabbt (ofta i 30 min) och på plats (i fält) genom att använda en bärbar värmeblock för förstärkning och ett kolorimetriskt färgämne som ändrar färg för ett positivt prov (ta bort behovet av elektrofores). I denna studie jämförde vi känsligheten hos PCR- och LAMP-analyser med hjälp av en filterutsugsmetod. Den föreslagna detektionsmetoden gör det möjligt för forskare och utvidgningsmedel att enkelt upptäcka förekomsten av P. capsici sporer från olika vattenkällor på mindre än två timmar. Analysen är bevisat att vara mer känslig än konventionella PCR och validerades in situ genom att upptäcka förekomsten av patogenen i bevattningsvattnet som används av en odlare. Denna detektionsmetod kommer att göra det möjligt för odlarna att uppskatta patogenens förekomst och populationstäthet i olika vattenkällor som används för bevattning, vilket förhindrar förödande utbrott och ekonomiska förluster.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose gel powder</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C997J85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buchner funnel</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>JBF003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBX24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTAB solution</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>786-565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Flask</td>
			<td>United</td>
			<td>FHFL1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>FPR009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Green 10000X</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>B003B68 (1/EA)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genie III</td>
			<td>OptiGene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand pump</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1163B06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso-amyl Alcohol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP1150-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAVA LAMP master mix</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>30086-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bead DNA extraction</td>
			<td>Genesig</td>
			<td>genesigEASY-EK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Separator</td>
			<td>Genesig</td>
			<td>genesigEASY-MR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PVP40-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Mini Centrifuge</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>C1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Gel Doc</td>
			<td>Analytik Jena</td>
			<td>849-00502-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warmstart Colorimetric Dye</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>E1800m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704489EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% isopropanol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A451-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of phytophthora capsici in irrigation water using loop-mediated isothermal amplification

Phytophthora capsici är en förödande oomycete patogen som påverkar många viktiga solanaceous och cucurbit grödor orsakar betydande ekonomiska förluster i vegetabilisk produktion årligen. Phytophthora capsici är jordburen och ett ihållande problem i vegetabiliska fält på grund av dess långlivade överlevnadsstrukturer (oosporer och chlamydospores) som motstår vittring och nedbrytning. Den huvudsakliga metoden för spridning är genom produktion av zoosporer, som är encelliga, flagellerade sporer som kan simma genom tunna filmer av vatten som finns på ytor eller i vattenfyllda jordpor och kan ackumuleras i pölar och dammar. Därför kan bevattningsdammar vara en källa till patogenen och initiala punkter av sjukdomsutbrott. Detektion av P. capsici i bevattningsvatten är svårt med traditionella odlingsbaserade metoder eftersom andra mikroorganismer som finns i miljön, såsom Pythium spp., vanligtvis överväxt P. capsici gör det omöjlig att upptäcka. För att bestämma förekomsten av P. capsici sporer i vattenkällor (bevattningsvatten, avrinning, etc.), utvecklade vi en handpump-baserade filterpapper (8-10 μm) metod som fångar patogenens sporer (zoosporer) och används senare för att förstärka patogenens DNA genom en roman loop-medierad isotermisk förstärkning (LAMP) analys som utformats för specifik förstärkning av Pici mössor. Denna metod kan förstärka och upptäcka DNA från en koncentration så låg som 1,2 x 102 zoospores/mL, vilket är 40 gånger känsligare än konventionella PCR. Ingen korsförstärkning erhölls vid testning av närbesläktade arter. LAMP utfördes också med hjälp av en kolorimetrisk LAMP master mix färgämne, visar resultat som kunde läsas med blotta ögat för på plats snabb upptäckt. Detta protokoll skulle kunna anpassas till andra patogener som finns, ackumuleras eller sprids via förorenade bevattningssystem.

Optimering av LAMP-metoden I denna studie upptäckte vi förekomsten av Phytophthora capsici i bevattningsvatten med hjälp av en bärbar loop-medierad isotermisk förstärkning (LAMP) analys. Först optimerades den föreslagna LAMP-analysen genom att testa olika LAMP primer-koncentrationer [F3, B3 (0.1–0.5 μM vardera); LF, LB (0,5–1,0 μM vardera) och FIP, BIP (0,8–2,4 μM vardera)], varaktigheter (30–70 min), och temperaturer (55–70 °C). Den slutliga LAMP primermixen som använd...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification at JoVE.com

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

Vi utvecklat en metod för att upptäcka Phytophthora capsici zoosporer i vattenkällor med hjälp av ett filter papper DNA extraktion metod tillsammans med en loop-medierad isotermisk förstärkning (LAMP) analys som kan analyseras i fält eller i labbet.

Detektion av Phytophthora capsici i Irrigation Water med hjälp av Loop-medierad Isotermisk Förstärkning

Phytophthora capsici is a devastating oomycete pathogen that affects many important solanaceous and cucurbit crops causing significant economic losses in ...

Phytopathogen upptäckt är ett avgörande steg i växtsjukdom förvaltning. Detta protokoll ger en snabb detektionsmetod för bevattning vatten förorening på grund av en gemensam vattenburna fighter patogen. Med hjälp av denna teknik, specifik patogen, såsom Phytophthora capcici, kan bearbetas och snabbt detekteras från vår stora volym av bevattningsvatten medan de finns kvar på plats.Demonstrera förfarandet kommer att Owen Hudson, en Masters student från mitt laboratorium, och Sumyya Waliullah, en PostDoctoral forskare från Dr.Pingxi G: s laboratorium för att inrätta en pump och filter för på plats Phytophthora capcici upptäckt i bevattningsvatten. Fäst en filtreringskolv på ett rör som är anslutet till en handpump och monterad Buchnertratt i gummiproppen i filtreringskolvens mynning. Sedan passar en lämpligt stor bit av filterpapper med en 15 mikron retention storlek i tratten.För att få vattenprover samla bevattningsvatten från den riktade källan. Vattnet kan ha små mängder skräp, men inte betydande sediment eller jord. Häll långsamt mellan 50 till 1000 milliliter testvatten över filterpapperet inuti tratten medan du använder handpumpen för att skapa ett sug för att dra vattnet genom tratten.När allt vatten har filtrerats, använd forceps för att ta bort filterpapperet från tratten. Och använd steril sax för att skära papperet i små bitar. Submerge åtta till 12 papperslappar i 400 mikroliter av utsugningsbuffert i ett 1,5 milliliter rör för en fem minuters inkubering vid rumstemperatur.Vortex eller på annat sätt agitera papperet i 10 sekunder en gång varje minut. I slutet av inkubationen använder du forceps för att avlägsna papperet med så lite buffert som möjligt. Och upprepa licensen med nästa uppsättning filterpapper bitar.För DNA-extraktion från filterpappersproverna tillsatt 20 mikroliter av proteinas K och 10 mikroliter på 10 nanogram per mikroliter RNAs till provet också och inkubera lösningen vid rumstemperatur i 15 minuter med virvel eller skakning var tredje minut. I slutet av inkubationen, tillsätt 500 mikroliter av magnetiska pärlor i bindningsbuffert till provet och blanda väl genom skakning. Placera röret och den magnetiska separatorställningen efter fem minuter i rumstemperatur i två minuter innan du tar bort och kasserar supernatanten.Ta bort röret från den magnetiska separatorn och kraftigt åter upphäva pärlorna i 500 mikroliter av tvätt buffert. Efter 30 sekunder tillbaka röret till magneten och vänta två minuter innan du kasserar supernatanten. Upprepa tvätten med 500 mikroliter av tvättbuffert också och 500 mikroliter av 80%etanol som just visats.Och luft driva den magnetiska pärla pelleten i 15 minuter vid rumstemperatur. Vid slutet av inkuberingen åter uppdragning av pärlorna i 50 mikroliter av elueringsbuffert med pipettering i en minut innan du placerar tillbaka röret på magneten i två minuter för att tillåta insamling av supernatanten. Efter att ha förberett LAMP primer mix som anges i tabellen, lägga till på 2,5 mikroliter primer mix 12,5 mikroliter av en lava LAMP mastermix en mikroliter av extraherade DNA och nio mikroliter av dubbel destillerat vatten till en PCR röret och ställa in en positiv och en negativ kontroll.inkubera alla prover i en 64 grader Celsius värme blogg i 45 minuter eller genie tre förstärkningsinstrument i slutet av inkubationen, en belastning på fem mikroliter av varje förstärkt prov på en 1%agaros gel och bild de resulterande banden på en ultraviolett bildbehandling maskin. Om ett calorimetriskt färgämne användes, visa färgförändringen för att bestämma resultaten som positiva eller negativa. Om ett portabelt förstärkningsinstrument användes, visa förstärkningsgrafen på skärmen för att bestämma resultaten.Den optiska tiden för att köra LAMP-analysen vid 64 grader är 45 minuter, eftersom de lägsta koncentrationerna som var positiva för detektion förstärks inte förrän 40 minuter, medan högre koncentrationer förstärks vid 20 minuter. Amplifiering kan bekräftas på en 1%agaros gel märkt med en Nucleic syra fläck. Som illustrerat konventionell PCR är 40 gånger mindre känslig än LAMP.Upptäcka 4,8 gånger 10 till den tredje zoosporer per milliliter koncentrationer på den lägsta. I denna analys samlades vattenprover in från sju dammar som användes för kommersiell grönsaksproduktion i Tift County, Georgia. Tre av vilka visat positiva LAMP resultat.När proverna testades av konventionella PCR dock zoosporer upptäcktes i endast en av de tre positiva prover. I den här tabellen sammanfattas skillnaderna mellan detektionsmetoder med hjälp av sådana variabler som känslighet, tid, obligatorisk förberedelse, material och kostnad. LAMP är den minst dyra metoden bland de testade metoderna, och är också den snabbaste, kräver endast 30 till 60 minuter för förstärkning jämfört med konventionell PCR förstärkning.Med hjälp av detta protokoll DNA extraheras från närliggande UMI utsäde patogener resulterar i ingen detektion för någon av proverna, bekräftar specificiteten hos primers. Se till att inte hälla provet vatten för snabbt och var försiktig när du lägger extraherade DNA till LAMP rören för att begränsa kontaminering. När andra vattenburna patogener har fått sina specifika primeruppsättningar utvecklade kan metoderna för filtrering och lampsyra anpassas för andra patogener.

Research

JoVE Journal

Environment

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

Kolorimetrisk Pappersbaserade Upptäckt av<em&gt; Escherichia coli</em&gt;,<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp.., Och<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Från stora volymer av jordbruks Vatten

This protocol describes rapid colorimetric detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from large volumes (10 L) of ...

Laboratory-determined Phosphorus Flux from Lake Sediments as a Measure of Internal Phosphorus Loading

Laboratorium bestämda Fosfor Flux från sjösediment som ett mått på intern fosforbelastning

Eutrophication is a water quality issue in lakes worldwide, and there is a critical need to identify and control nutrient sources. Internal phosphorus (P) ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Metod 1615. Mätning av Enterovirus och Norovirus förekomst i vatten efter kultur och RT-qPCR. I. Insamling av virusprov

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) Fluorometry

A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated WATER-PAM Fluorometry

En liten volym Bioanalys att Bedöm Bakteriell / Växtplankton Co-kultur Använda WATER-Pulse-amplitudmodulerad (WATER-PAM) fluorometri

Conventional methods for experimental manipulation of microalgae have employed large volumes of culture (20 ml to 5 L), so that the culture can be ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Metod 1615 Mätning av Enterovirus och Norovirus förekomst i vatten efter kultur och RT-qPCR. Del III. Virus Detection med RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

En Duplex Digital PCR-analys för samtidig kvantifiering av<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Och Human fekal-associerade HF183 Marker i Waters

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

Screening för endokrin aktivitet i vatten med hjälp av kommersiellt tillgängliga<em&gt; In Vitro</em&gt; Transaktiverings Bioanalyser

In vitro transactivation bioassays have shown promise as water quality monitoring tools, however their adoption and widespread application has been ...

A Simple Planting Technique for Re-establishing Trees Where Frequent Inundation Occurs

En enkel plantering teknik för åter upprättar träd där frekvent översvämning uppstår

Many of the Everglades tree islands have lost elevation over the past century and most of their trees have died such that they are now covered with ...

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Bioindication provning av Stream miljö lämplighet för ung sötvatten pärla musslorna med i Situ exponering metoder

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol ...

Optimized Procedure for Determining the Adsorption of Phosphonates onto Granular Ferric Hydroxide using a Miniaturized Phosphorus Determination Method

Optimerad förfarandet för bestämning av Adsorption av fosfonater på granulat järnklorid hydroxid metoden en miniatyriserade fosfor bestämning

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric ...