Name: detection of phytophthora capsici in irrigation water using loop-mediated isothermal amplification
Uploaded: 2020-06-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification at JoVE.com

Bu çalışma Gürcistan Sebze Emtia Komisyonu'nun FP00016659 projesi NIN mali desteğini aldı. Yazarlar Dr Pingsheng Ji, Georgia Üniversitesi ve Dr Anne Dorrance, Ohio State Üniversitesi Phytophthora sppsaf kültürleri sağlamak için teşekkür ederiz. Biz de çalışma boyunca teknik yardım için Li Wang ve Deloris Veney teşekkür ederiz.

1. Portatif döngü aracılı izomal amplifikasyon kullanarak sulama suyundan Fitophthora capsici yerinde tespiti
<ol><li>Pompa ve filtrenin ayarlanması<ol>
<li>Pompa etkinleştirildiğinde, hava filtreleme şişesinin ağzından çekilecek şekilde bir el pompasına bağlı bir tüpe bir filtreleme şişesi takın.</li>
		<li>Buchner hunisini filtreleme şişesinin ağzına kauçuk durdurucuya tuygulayın ve uygun büyüklükteki filtre kağıdını Buchner hunisine sığdırın, böylece hava filtre kağıd...

<ol>
	<li>Hong, C., Moorman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+pathogens+in+irrigation+water:+challenges+and+opportunities.">Plant pathogens in irrigation water: challenges and opportunities.</a> Critical Reviews in Plant Sciences. 24 (3), 189-208 (2005).</li><li>Malkawi, H. I., Mohammad, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiology,+Genetics,+Morphology,+&amp;+Microorganisms,+E.+o.+Survival+and+accumulation+of+microorganisms+in+soils+irrigated+with+secondary+treated+wastewater.">Physiology, Genetics, Morphology, &amp; Microorganisms, E. o. Survival and accumulation of microorganisms in soils irrigated with secondary treated wastewater.</a> Journal of Basic Microbiology. 43 (1), 47-55 (2003).</li><li>Bush, E. A., Hong, C., Stromberg, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluctuations+of+Phytophthora+and+Pythium+spp.+in+components+of+a+recycling+irrigation+system.">Fluctuations of Phytophthora and Pythium spp. in components of a recycling irrigation system.</a> Plant Disease. 87 (12), 1500-1506 (2003).</li><li>Ghimire, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+diversity+of+Phytophthora+species+in+nursery+irrigation+reservoir+adopting+water+recycling+system+during+winter+months.">Distribution and diversity of Phytophthora species in nursery irrigation reservoir adopting water recycling system during winter months.</a> Journal of Phytopathology. 159 (11-12), 713-719 (2011).</li><li>Hausbeck, M. K., Lamour, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytophthora+capsici+on+vegetable+crops:+research+progress+and+management+challenges.">Phytophthora capsici on vegetable crops: research progress and management challenges.</a> Plant Disease. 88 (12), 1292-1303 (2004).</li><li>Gevens, A., Donahoo, R., Lamour, K., Hausbeck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Phytophthora+capsici+from+Michigan+surface+irrigation+water.">Characterization of Phytophthora capsici from Michigan surface irrigation water.</a> Phytopathology. 97 (4), 421-428 (2007).</li><li>Thomson, S., Allen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+Phytophthora+species+and+other+potential+plant+pathogens+in+recycled+irrigation+water.">Occurrence of Phytophthora species and other potential plant pathogens in recycled irrigation water.</a> Plant Disease Reporter. 58 (10), 945-949 (1974).</li><li>Lamour, K. H., Stam, R., Jupe, J., Huitema, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+oomycete+broad-host-range+pathogen+Phytophthora+capsici.">The oomycete broad-host-range pathogen Phytophthora capsici.</a> Journal of Molecular Plant Pathology. 13 (4), 329-337 (2012).</li><li>Sanogo, S., Ji, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water+management+in+relation+to+control+of+Phytophthora+capsici+in+vegetable+crops.">Water management in relation to control of Phytophthora capsici in vegetable crops.</a> Agricultural Water Management. 129, 113-119 (2013).</li><li>Zhang, Z., Li, Y., Fan, H., Wang, Y., Zheng, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+detection+of+Phytophthora+capsici+in+infected+plant+tissues,+soil+and+water.">Molecular detection of Phytophthora capsici in infected plant tissues, soil and water.</a> Plant Pathology. 55 (6), 770-775 (2006).</li><li>Trout, C., Ristaino, J., Madritch, M., Wangsomboondee, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+of+Phytophthora+infestans+in+late+blight-infected+potato+and+tomato+using+PCR.">Rapid detection of Phytophthora infestans in late blight-infected potato and tomato using PCR.</a> Plant Disease. 81 (9), 1042-1048 (1997).</li><li>Sankaran, S., Mishra, A., Ehsani, R., Davis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+advanced+techniques+for+detecting+plant+diseases.">A review of advanced techniques for detecting plant diseases.</a> Commputers and Electronics in Agriculture. 72 (1), 1-13 (2010).</li><li>Wang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+improved+isolation+approach+and+simple+sequence+repeat+markers+to+characterize+Phytophthora+capsici+populations+in+irrigation+ponds+in+southern+Georgia.">Development of an improved isolation approach and simple sequence repeat markers to characterize Phytophthora capsici populations in irrigation ponds in southern Georgia.</a> Applied and Environmental Microbiology. 75 (17), 5467-5473 (2009).</li><li>Ali-Shtayeh, M., MacDonald, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Occurrence+of+Phytophthora+species+in+irrigation+water+in+the+Nablus+area+(West+Bank+of+Jordan).">Occurrence of Phytophthora species in irrigation water in the Nablus area (West Bank of Jordan).</a> Phytopathologia Mediterranea. , 143-150 (1991).</li><li>Pringsh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+serological+and+culture+plate+methods+for+detecting+species+of+Phytophthora,+Pythium,+and+Rhizoctonia+in+ornamental+plants.">Comparison of serological and culture plate methods for detecting species of Phytophthora, Pythium, and Rhizoctonia in ornamental plants.</a> Plant Disease. 74 (9), 655 (1990).</li><li>Stewart-Wade, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+pathogens+in+recycled+irrigation+water+in+commercial+plant+nurseries+and+greenhouses:+their+detection+and+management.">Plant pathogens in recycled irrigation water in commercial plant nurseries and greenhouses: their detection and management.</a> Irrigation Science. 29 (4), 267-297 (2011).</li><li>Aragaki, M., Uchida, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+distinctions+between+Phytophthora+capsici+and+P.+tropicalis+sp.+nov.">Morphological distinctions between Phytophthora capsici and P. tropicalis sp. nov.</a> Mycologia. 93 (1), 137-145 (2001).</li><li>Tomlinson, J., Boonham, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+of+LAMP+for+detection+of+plant+pathogens.">Potential of LAMP for detection of plant pathogens.</a> CAB Reviews Perspectives in Agriculture Veterinary Science Nutrition and Natural Resources. 3 (066), 1-7 (2008).</li><li>Li, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PCR-based+assay+for+distinguishing+between+A1+and+A2+mating+types+of+Phytophthora+capsici.">A PCR-based assay for distinguishing between A1 and A2 mating types of Phytophthora capsici.</a> Journal of the American Society for Horticultural Science. 142 (4), 260-264 (2017).</li><li>Dong, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loop-mediated+isothermal+amplification+assay+for+sensitive+and+rapid+detection+of+Phytophthora+capsici.">Loop-mediated isothermal amplification assay for sensitive and rapid detection of Phytophthora capsici.</a> Canadian Journal of Plant Pathology. 37 (4), 485-494 (2015).</li><li>Khan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+evaluation+of+the+LAMP+assay+and+PCR-based+assays+for+the+rapid+detection+of+Alternaria+solani.">Comparative evaluation of the LAMP assay and PCR-based assays for the rapid detection of Alternaria solani.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 2089 (2018).</li><li>Sowmya, N., Thakur, M., Manonmani, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+simple+DNA+extraction+method+for+the+detection+of+enterotoxigenic+Staphylococcus+aureus+directly+from+food+samples:+comparison+of+PCR+and+LAMP+methods.">Rapid and simple DNA extraction method for the detection of enterotoxigenic Staphylococcus aureus directly from food samples: comparison of PCR and LAMP methods.</a> Journal of Applied Microbiology. 113 (1), 106-113 (2012).</li><li>Waliullah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+different+molecular+and+serological+methods+for+detection+of+Xylella+fastidiosa+in+blueberry.">Comparative analysis of different molecular and serological methods for detection of Xylella fastidiosa in blueberry.</a> PLOS ONE. 14 (9), 0221903 (2019).</li><li>B&#246;hm, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantitative+PCR:+DNA+determination+in+isolated+spores+of+the+mycorrhizal+fungus+Glomus+mosseae+and+monitoring+of+Phytophthora+infestans+and+Phytophthora+citricola+in+their+respective+host+plants.">Real-time quantitative PCR: DNA determination in isolated spores of the mycorrhizal fungus Glomus mosseae and monitoring of Phytophthora infestans and Phytophthora citricola in their respective host plants.</a> Journal of Phytopathology. 147, 409-416 (1999).</li><li>Klimczak, L., Prell, H. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+mitochondrial+DNA+of+the+oomycetous+fungus+Phytophthora+infestans.">Isolation and characterization of mitochondrial DNA of the oomycetous fungus Phytophthora infestans.</a> Current Genetics. 8 (4), 323-326 (1984).</li><li>Ghimire, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Phytophthora+species+in+a+run-off+water+retention+basin+at+a+commercial+nursery+in+plant+hardiness+zones+7+b+of+Virginia+in+winter.">Detection of Phytophthora species in a run-off water retention basin at a commercial nursery in plant hardiness zones 7 b of Virginia in winter.</a> Phytopathology. 96 (6), (2006).</li><li>Feng, W., Hieno, A., Kusunoki, M., Suga, H., Kageyama, K. J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LAMP+detection+of+four+plant-pathogenic+oomycetes+and+its+application+in+lettuce+fields.">LAMP detection of four plant-pathogenic oomycetes and its application in lettuce fields.</a> Plant Disease. 103 (2), 298-307 (2019).</li><li>Aglietti, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+loop-mediated+isothermal+amplification:+an+early-warning+tool+for+quarantine+plant+pathogen+detection.">Real-time loop-mediated isothermal amplification: an early-warning tool for quarantine plant pathogen detection.</a> AMB Express. 9 (1), 50 (2019).</li><li>Almasi, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+colorimetric+loop-mediated+isothermal+amplification+assay+for+the+visual+detection+of+Fusarium+oxysporum+f.+sp.+melonis.">Development of a colorimetric loop-mediated isothermal amplification assay for the visual detection of Fusarium oxysporum f. sp. melonis.</a> Horticultural Plant Journal. 5 (3), 129-136 (2019).</li><li>Gill, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+Pythium+from+irrigation+ponds.">Pathogenic Pythium from irrigation ponds.</a> Plant Disease Reporter. 54 (12), 1077-1079 (1970).</li></ol>

Fitopatojenler için sulama suyunun test edilmesi, sulama havuzları ve geri dönüştürülmüş su kullanan yetiştiriciler için çok önemli bir adımdır27. Sulama havuzları aşırı sulama suyu mevcut olabilir herhangi bir patojenler taşıyan gölet alanından gölete yönlendirilir gibi fitopatojenler bir dizi için bir rezervuar ve üreme zemin sağlar16,27. Büyük bir su kaynağında bir bitki patojenlerinin tespiti için gelen...

Çiftliklerde ve kreşlerde su geri dönüşümü, su maliyetlerindeki artış ve su kullanımının ardındaki çevresel kaygılar nedeniyle giderek daha popüler hale gelmektedir. Bitki hastalıklarının yayılmasını ve oluşumunu azaltmak için yetiştiriciler için birçok sulama yöntemi geliştirilmiştir. Ne olursa olsun su kaynağı (sulama veya yağış), kaçak oluşturulur ve birçok sebze ve kreş yetiştiricileri toplamak ve runoff1geri dönüşüm için bir gölet var. Bu geri dönüşümlü,subitkileri2,3,4sulamak için kullanıldığında patojenlerin yayılması lehine olası patojen birikimi için bir rezervuar oluşturur. Oomycete bitki patojenler özellikle zoosporlar suda birikir ve birincil dağılım spor u kendine hareketli olacak gibi bu uygulamadan yarar ama yüzey suyu gerektirir5,6,7. Fitophthora capsici farklı şekillerde solanaceous ve cucurbit bitkileri önemli sayıda etkileyen8bir oomycete patojen8 . Genellikle, belirtiler fide, kök ve taç çürümesi sönümleme-off vardır; ancak salatalık, kabak, kavun, kabak, karpuz, patlıcan ve biber gibi ürünlerde, tüm hasat meyve çürüklüğü nedeniyle kaybedilebilir9. Bu bitki patojentespit bilinen yöntemler olmasına rağmen, çoğu önemli bir etkiye sahip herhangi bir önleyici fungisitler için çok geç zaten yer almış bir enfeksiyon gerektirir10.
Hedeflenen mikroorganizmaların tespiti ve tanısı için sulama suyunu test etmek için geleneksel yöntem hız ve duyarlılık başarı ve karlı ürün üretimi için çok önemli olduğunda antika bir yaklaşımdır11,12. Hedeflenen patojene duyarlı bitki dokusu (örneğin, P. capsiciiçin patlıcan) çıkarıldı ve enfeksiyon için denetlenmeden önce uzun bir süre bir sulama havuzunda asılı değiştirilmiş bir tuzak bağlı. Bitki dokusundan alınan numuneler daha sonra yarı selektif ortama (PARPH) kaplanır ve kültür gelişimi için kuluçkaya yatırılır, daha sonra morfolojik tanımlama bileşik mikroskop kullanılarak yapılır13. Seçici ortam kullanarak diğer bitki patojenleri için diğer benzer algılama yöntemleri vardır ve alt culturing önce kontamine su küçük miktarlarda kaplama14,15. Bu yöntemler her türün temel morfolojik karakterlerini tanıyabilmek için 2 ila 6 hafta arasında herhangi bir yerde, organizmayı izole etmek için birkaç tur alt-kültür ve Fitophthora diagnostik deneyimi gerektirir. Bu geleneksel yöntemler, su kaynaklarında da bulunan diğer mikroorganizmaların müdahalesi gibi faktörler nedeniyle P. capsici tarafından kontamine olan sulama suyunun tespiti için iyi çalışmaz. Pythium spp. ve su kaynaklı bakteriler gibi bazı hızlı büyüyen mikroorganizmalar p. capsici tespit edilemez,16,17yapma plaka üzerinde aşırı büyüyebilir.
Bu çalışmanın amacı, sulama suyunda P. capsici zoosporları saptamak için hem saha hem de laboratuvar ortamlarında kullanılabilecek hassas ve spesifik bir moleküler yöntem geliştirmektir. Protokol, p. capsici18,,191121-baz çifti (bp) parçası dayalı, özellikle P. capsiciyükseltmek mümkün yeni bir döngü aracılı izomal amplifikasyon (LAMP) astar seti gelişimini içerir. Dong ve ark. (2015) daha önce geliştirilmiş lamp astarı bu çalışma için geliştirilen tsurel ile karşılaştırıldığında kullanılmıştır20.
LAMP testi, geleneksel polimeraz zincir reaksiyonundan (PCR) daha hızlı, hassas ve spesifik olduğu kanıtlanmıştır moleküler algılama nispeten yeni bir şeklidir21. Genel olarak, geleneksel PCR tahlilleri 500 kopyanın altında (1,25 pg/μL) algılayamaz; buna karşılık, önceki çalışmalar LAMP hassasiyetinin konvansiyonel PCR'den 10 ila 1.000 kat daha yüksek olabileceğini ve genomikDNA'nın1 fg/μL'sini bile kolayca tespit edebildiği gösterilmiştir 22,23. Ayrıca, test hızla yapılabilir (genellikle 30 dk) ve yerinde (alanında) amplifikasyon için taşınabilir bir ısıtma bloğu ve pozitif bir örnek için renk değiştiren bir kolorimetrik boya kullanılarak (elektroforez ihtiyacını ortadan kaldırarak). Bu çalışmada PCR ve LAMP tahlillerinin hassasiyetini filtre çıkarma yöntemi ile karşılaştırdık. Önerilen algılama yöntemi, araştırmacıların ve uzatma ajanlarının p. capsici sporlarının varlığını iki saatten kısa bir sürede farklı su kaynaklarından kolayca tespit etmesini sağlar. Tetki nin konvansiyonel PCR'den daha hassas olduğu kanıtlanmıştır ve bir yetiştirici tarafından kullanılan sulama suyunda patojenin varlığı tespit edilerek yerinde doğrulanmıştır. Bu algılama yöntemi, yetiştiricilerin sulama için kullanılan çeşitli su kaynaklarında patojenin varlığını ve popülasyon yoğunluğunu tahmin edebilmelerini sağlayarak yıkıcı salgınları ve ekonomik kayıpları önleyecektir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Agarose gel powder</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C997J85</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buchner funnel</td>
			<td>Southern Labware</td>
			<td>JBF003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bullet Blender</td>
			<td>Next Advance</td>
			<td>BBX24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5430</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22620509</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>C298-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTAB solution</td>
			<td>Biosciences</td>
			<td>786-565</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dneasy Extraction Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Flask</td>
			<td>United</td>
			<td>FHFL1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Paper</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>FPR009</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel Green 10000X</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>B003B68 (1/EA)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genie III</td>
			<td>OptiGene</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hand pump</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1163B06</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iso-amyl Alcohol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>BP1150-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAVA LAMP master mix</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>30086-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic bead DNA extraction</td>
			<td>Genesig</td>
			<td>genesigEASY-EK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Separator</td>
			<td>Genesig</td>
			<td>genesigEASY-MR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>PVP40-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primers</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism Mini Centrifuge</td>
			<td>Labnet</td>
			<td>C1801</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV Gel Doc</td>
			<td>Analytik Jena</td>
			<td>849-00502-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Warmstart Colorimetric Dye</td>
			<td>Lucigen</td>
			<td>E1800m</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide Mini ReadySub-Cell GT Cell</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1704489EDU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% isopropanol</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>A451-1</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of phytophthora capsici in irrigation water using loop-mediated isothermal amplification

Fitophthora capsici birçok önemli solanaceous ve cucurbit bitkileri yılda sebze üretiminde önemli ekonomik kayıplara neden etkileyen yıkıcı bir oomycete patojendir. Fitophthora capsici toprak kaynaklı ve uzun ömürlü sağkalım yapıları (oosporlar ve konmydosporlar) nedeniyle sebze alanlarında kalıcı bir sorundur. Dağılmanın ana yöntemi, yüzeylerde veya su dolu toprak gözeneklerinde bulunan ince su filmleriyle yüzebilen ve su birikintileri ve göletlerde birikebilen tek hücreli, kamçılı sporlar olan zoosporların üretimidir. Bu nedenle, sulama havuzları patojen ve hastalık salgınları ilk noktaları nın kaynağı olabilir. Sulama suyunda P. capsici'nin tespiti geleneksel kültür temelli yöntemlerle zordur, çünkü pythium spp. gibi çevrede bulunan diğer mikroorganizmalar genellikle p. capsici'yi aşarak saptanamaz hale getirirler. Su kaynaklarında (sulama suyu, akıntı, vb.) P. capsici sporlarının varlığını belirlemek için, patojensporlarını (zoosporlar) yakalayan ve daha sonra P. capsici'nin özel amplifikasyonu için tasarlanmış yeni bir döngü aracılı isothermal amplifikasyon (LAMP) aracılığıyla patojenin DNA'sını yükseltmek için kullanılan bir el pompası tabanlı filtre kağıdı (8-10 μm) yöntemi geliştirdik. Bu yöntem, geleneksel PCR'den 40 kat daha hassas olan 1.2 x 102 zoospor/mL gibi düşük bir konsantrasyondan DNA'yı yükseltebilir ve algılayabilir. Yakından ilişkili türler test edilirken çapraz amplifikasyon elde edilemedik. LAMP da bir kolorimetrik LAMP ana karışımı boya kullanılarak yapıldı, yerinde hızlı algılama için çıplak gözle okunabilir sonuçları gösteren. Bu protokol, kontamine sulama sistemleri aracılığıyla ikamet eden, biriken veya dağıtılan diğer patojenlere uyarlanabilir.

LAMP yönteminin optimizasyonu Bu çalışmada, portatif döngü aracılı izotermal amplifikasyon (LAMP) analizi ile sulama suyunda Fitophthora capsici varlığı saptandı. İlk olarak, önerilen LAMP testi farklı LAMP astar konsantrasyonları test edilerek optimize edildi [F3, B3 (her biri 0.1-0.5 μM); LF, LB (her biri 0,5-1,0 μM) ve FIP, BIP (her biri 0,8-2,4 μM)], süreler (30-70 dk) ve sıcaklıklar (55-70 °C). Bu çalışmada kullanılan son LAMP astar karışımı: 0.2 μM her F3...

Watch this Scientific Journal Video about Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification at JoVE.com

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

Tarlada veya laboratuvarda analiz edilebilen döngü aracılı izomal amplifikasyon (LAMP) testi ile birleşen bir filtre kağıdı DNA ekstraksiyon yöntemi kullanarak su kaynaklarında Fitophthora capsici zoosporları tespit etmek için bir yöntem geliştirdik.

Loop Aracılı İzofenel Amplifikasyon Kullanarak Sulama Suyunda Fitophthora Capsici'nin Saptanması

Phytophthora capsici is a devastating oomycete pathogen that affects many important solanaceous and cucurbit crops causing significant economic losses in ...

Fitopatojen tespiti bitki hastalıkları nın yönetiminde önemli bir adımdır. Bu protokol, ortak bir su kaynaklı avcı patojeni nedeniyle sulama suyu kirlenmesi için hızlı bir algılama yöntemi sağlar. Bu teknik kullanılarak, Phytophthora capcici gibi spesifik patojen, yerinde kalırken, sulama suyunun büyük hacminden işlenebilir ve hızlı bir şekilde tespit edilebilir.Prosedürü gösteren Owen Hudson, benim laboratuvardan bir Master öğrencisi ve Sumyya Waliullah, Dr.Pingxi G laboratuvarından bir PostDoctoral araştırmacı sulama suyunda yerinde Phytophthora capcici algılama için bir pompa ve filtre kurmak olacaktır. Bir el pompasına bağlı bir tüpe bir filtreleme şişesi takın ve filtreleme şişesinin ağzındaki kauçuk durdurucuya buchner hunisi takın. Daha sonra huni içine 15 mikron tutma boyutu ile uygun büyüklükte bir filtre kağıdı parçası takın.Su numuneleri elde etmek için hedeflenen kaynaktan sulama suyu toplanır. Su enkaz küçük miktarlarda olabilir, ama önemli bir tortu veya toprak. Huni den su çekmek için bir emme oluşturmak için el pompası kullanırken yavaş yavaş huni içinde filtre kağıdı üzerinde test suyu 50 ila 1000 mililitre arasında dökün.Tüm su filtrelendiğinde, filtre kağıdını huniden çıkarmak için forcep kullanın. Ve küçük parçalar halinde kağıt kesmek için steril makas kullanın. Oda sıcaklığında beş dakikalık bir kuluçka için 1,5 mililitrelik bir tüpte 400 mikrolitre ekstraksiyon tamponuna 8 ila 12 adet kağıt batırın.Girdap veya başka bir kez her dakika 10 saniye boyunca kağıt ajite. Kuluçka sonunda, mümkün olduğunca az tampon ile kağıt kaldırmak için forceps kullanın. Ve lisansı bir sonraki filtre kağıdı parçaları kümesiyle tekrarlayın.Filtre kağıdı ndan DNA çıkarma numuneleri 20 mikrolitre proteinaz K ve 10 mikrolitre mikrolitre 10 mikrolitre mikrolitre RNA'lar başına numuneye de eklenir ve çözeltiyi her üç dakikada bir girdap veya sallayarak 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Kuluçka sonunda, numuneye bağlama tampon500 mikrolitre manyetik boncuk ekleyin ve sallayarak iyice karıştırın. Oda sıcaklığında beş dakika sonra, süpernatant çıkarmadan önce iki dakika boyunca tüp ve manyetik ayırıcı raf yerleştirin.Tüpü manyetik ayırıcıdan çıkarın ve 500 mikrolitre yıkama tamponu yla boncukları şiddetle yeniden askıya alın. 30 saniye sonra mıknatıs için tüp dönmek ve supernatant atmadan önce iki dakika bekleyin. 500 mikrolitre yıkama tamponu ve 500 mikrolitre %80 etanol ile yıkayın.Ve hava manyetik boncuk peletini oda sıcaklığında 15 dakika sürer. Kuluçka sonunda yeniden supernatant toplanması sağlamak için iki dakika için mıknatıs üzerine tüp geri yerleştirmeden önce bir dakika boyunca borulama ile elüsasyon tampon 50 mikrolitre boncuk askıya. Lamp astar karışımını masada belirtildiği gibi hazırladıktan sonra, 2,5 mikrolitre astar karışımı 12,5 mikrolitre bir lav LAMP mastermix bir mikrolitre çıkarılan DNA ve dokuz mikrolitre çift distile su pcr tüp ve bir pozitif ve bir negatif kontrol kurmak ekleyin.tüm numuneleri 45 dakika boyunca 64 derece lik bir ısı blogunda veya kuluçka sonunda cin üç amplifikasyon aletinde, her güçlendirilmiş numuneden beş mikrolitrelik bir yükü %1'lik agarose jelüzerine kuluçkaya yatırın ve ultraviyole görüntüleme makinesinde ortaya çıkan bantları görüntüleyin. Kalorimetrik boya kullanıldıysa, sonuçları pozitif veya negatif olarak belirlemek için renk değişikliğini görüntüleyin. Taşınabilir bir amplifikasyon aleti kullanıldıysa, sonuçları belirlemek için ekrandaki amplifikasyon grafiğini görüntüleyin.LAMP testinin 64 derecede çalıştırılmak için optik süresi 45 dakikadır, çünkü algılama için pozitif olan en düşük konsantrasyonlar 40 dakikaya kadar yükseltimezken, daha yüksek konsantrasyonlar 20 dakikada yükseltilir. Amplifikasyon bir Nükleik asit lekesi ile etiketlenmiş bir% 1 agarose jel üzerinde teyit edilebilir. Gösterildiği gibi geleneksel PCR LAMP'den 40 kat daha az hassastır.Mililitre konsantrasyonları başına 4.8 kez 10 kez tespit en düşük. Bu analizde Gürcistan'ın Tift İlçesi'nde ticari sebze üretimi için kullanılan yedi göletten su örnekleri toplanmıştır. Bunlardan üçü olumlu LAMP sonuçları gösterdi.Ancak numuneler konvansiyonel PCR tarafından test edildiğinde, zoosporlar üç pozitif örnekten sadece birinde tespit edildi. Bu tabloda duyarlılık, zaman, gerekli hazırlık, malzeme ve maliyet gibi değişkenleri kullanan algılama yöntemleri arasındaki farklar özetlenmiştir. LAMP test edilen yöntemler arasında en ucuz yöntemdir ve aynı zamanda en hızlı, geleneksel PCR amplifikasyon ile karşılaştırıldığında amplifikasyon için sadece 30 ila 60 dakika gerektiren.Bu protokolün kullanılması, yakından ilişkili UMI tohum patojenlerinden elde edilen DNA, örneklerin hiçbirinde tespit edilmeyerek astarların özgüllüğünü doğrular. Numune suyunu çok hızlı dökmediğinizden emin olun ve kontaminasyonu sınırlamak için LAMP tüplerine çıkarılan DNA eklerken dikkatli olun. Diğer su kaynaklı patojenler kendi özel astar setleri geliştirilmiş olması, filtrasyon ve lamba asit yöntemleri diğer patojenler için adapte edilebilir.

Research

JoVE Journal

Environment

Detection of Phytophthora capsici in Irrigation Water using Loop-Mediated Isothermal Amplification

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

Colorimetric Paper-based Detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from Large Volumes of Agricultural Water

Kolorimetrik Algılama Paper-based<em&gt; Escherichia coli</em&gt;<em&gt; Salmonella</em&gt; Spp. Ve<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Tarım Su geniş hacimli

This protocol describes rapid colorimetric detection of Escherichia coli, Salmonella spp., and Listeria monocytogenes from large volumes (10 L) of ...

Laboratory-determined Phosphorus Flux from Lake Sediments as a Measure of Internal Phosphorus Loading

Göl tortulları Laboratuvar belirlenen Fosfor Flux İç Fosfor Yükleniyor bir tedbir olarak

Eutrophication is a water quality issue in lakes worldwide, and there is a critical need to identify and control nutrient sources. Internal phosphorus (P) ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

Enterovirus Kültür ve RT-qPCR Su Norovirüs Oluşum EPA Metot 1615 Ölçüm. Virüs Örneklerinin I. Koleksiyonu

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated (WATER-PAM) Fluorometry

A Small Volume Bioassay to Assess Bacterial/Phytoplankton Co-culture Using WATER-Pulse-Amplitude-Modulated WATER-PAM Fluorometry

Küçük Hacim Biyodeneyler SU-Pulse-Genlik Modülasyonlu (SU-PAM) fluorometri Kullanma Bakteriyel / Fitoplankton Co-kültür değerlendirilmesi için

Conventional methods for experimental manipulation of microalgae have employed large volumes of culture (20 ml to 5 L), so that the culture can be ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

Enterovirüs Kültür ve RT-qPCR Su Norovirus Oluşum EPA Method 1615 Ölçümü. Bölüm III. RT-qPCR Virüs Algılama

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

A Duplex Digital PCR Assay for Simultaneous Quantification of the Enterococcus spp. and the Human Fecal-associated HF183 Marker in Waters

Eşzamanlı Niceleme için Dubleks Dijital PCR Testi<em&gt; Enterococcus spp.</em&gt; Ve Waters İnsan Fekal ilişkili HF183 Marker

This manuscript describes a duplex digital PCR assay (EntHF183 dPCR) for simultaneous quantification of Enterococcus spp. and the human fecal-associated ...

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

Su Kullanımı Endokrin Aktivitesi Tarama Piyasada satılan<em&gt; İn Vitro</em&gt; Transaktivasyon biyolojik tayinler

In vitro transactivation bioassays have shown promise as water quality monitoring tools, however their adoption and widespread application has been ...

A Simple Planting Technique for Re-establishing Trees Where Frequent Inundation Occurs

Bir basit tekniği sık su baskını/taşkın oluştuğu için yeniden kurulması ağaç dikme

Many of the Everglades tree islands have lost elevation over the past century and most of their trees have died such that they are now covered with ...

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Bioindication Testing of Stream Environment Suitability for Young Freshwater Pearl Mussels Using In Situ Exposure Methods

Genç tatlı su midye içinde in Situ maruz kalma yöntemlerle inci için Bioindication akış ortamı uygunluğu test

Knowledge of habitat suitability for freshwater mussels is an important step in the conservation of this endangered species group. We describe a protocol ...

Optimized Procedure for Determining the Adsorption of Phosphonates onto Granular Ferric Hydroxide using a Miniaturized Phosphorus Determination Method

Fosfonat adsorpsiyon taneli ferrik minyatürize fosfor belirleme yöntemini kullanarak hidroksit üzerine belirlemek için en iyi duruma getirilmiş yordamı

This paper introduces a procedure to investigate the adsorption of phosphonates onto iron-containing filter materials, particularly granular ferric ...