Name: quantifying spontaneous ca2+ fluxes and their downstream effects in primary mouse midbrain neurons
Uploaded: 2020-09-09T14:00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons at JoVE.com

支持美国帕金森病协会（APDA）和NIH R01NS115809-01到RS的资助。我们感谢德克萨斯A&M基因组医学研究所（TIGM）提供及时怀孕的小鼠，以产生原发性多巴胺培养物。

<ol>
	<li>Marras, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+Parkinson's+disease+across+North+America.">Prevalence of Parkinson's disease across North America.</a> NPJ Parkinson's Disease. 4, 21 (2018).</li><li>Poewe, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson+disease.">Parkinson disease.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013 (2017).</li><li>Mehta, A., Prabhakar, M., Kumar, P., Deshmukh, R., Sharma, P. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+Identification+of+Living+Dopaminergic+Neurons+in+Midbrain+Cultures+Using+RNA+Sequencing+and+TH-promoter-driven+eGFP+Expression.">Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e54981 (2017).</li><li>Douhou, A., Troadec, J. D., Ruberg, M., Raisman-Vozari, R., Michel, P. 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A., Vavilis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Researching+glutamate+-+induced+cytotoxicity+in+different+cell+lines:+a+comparative/collective+analysis/study.">Researching glutamate - induced cytotoxicity in different cell lines: a comparative/collective analysis/study.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 91 (2015).</li><li>Gupta, K., Hardingham, G. E., Chandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-dependent+glutamate+excitotoxicity+in+human+embryonic+stem+cell-derived+neurons.">NMDA receptor-dependent glutamate excitotoxicity in human embryonic stem cell-derived neurons.</a> Neuroscience Letters. 543, 95-100 (2013).</li><li>Surmeier, D. J., Obeso, J. A., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+neuronal+vulnerability+in+Parkinson+disease.">Selective neuronal vulnerability in Parkinson disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (2), 101-113 (2017).</li><li>Ramirez, J. M., Tryba, A. K., Pena, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacemaker+neurons+and+neuronal+networks:+an+integrative+view.">Pacemaker neurons and neuronal networks: an integrative view.</a> Current Opinion in Neurobiology. 14 (6), 665-674 (2004).</li><li>Guzman, J. N., Sanchez-Padilla, J., Chan, C. S., Surmeier, D. 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作者没有什么可透露的。

我们描述了一个长期的原发性腹腔（VM）细胞培养系统，用于对神经元中谷氨酸培养的凋亡进行高含量分析。研究已经采用了初级中脑多巴胺培养物，以阐明在PD模型11，12的背景下兴奋毒性机制。在这项研究中，我们使用一种组合方法，使用基因编码钙指标（GECIs）来测量Ca2+ 活性，并将进一步将此活性与下游分子变化关联，例如启动凋亡信号级联4。该方法与其他类似的细胞培养系统具有多种优点。由于我们对帕金森病环境中的兴奋毒性特别感兴趣，因此使用原发性VM细胞培养是理想的。通过使用不同的场位定位技术，如网格覆盖唇或电动XY显微镜阶段结合TH免疫覆盖，我们可以直接研究谷氨酸培养的凋亡在腹中脑神经元中的细胞类型特异性效应。此外，3周的细胞培养模型允许神经元发展其完整的，成熟的分子轮廓，反映成人DA神经元9。以前的方法主要侧重于谷氨酸介质的兴奋性13，14之后分子的变化。该模型在将神经元生理学的急性变化与已识别细胞类型的下游分子事件关联的能力方面独树一帜。初级培养模型的一个限制是解剖技术捕获整个腹中脑，包括DA和GABAergic神经元以及来自SNc和VTA的神经元。现在有证据表明，与邻近的VTA15的DA神经元相比，SNc的DA神经元对钙和最终细胞死亡有选择性的脆弱性。不幸的是，在胚胎培养中区分SNc和VTA神经元已被证明是困难的，很少有解剖地标来定义胚胎大脑中的这些结构。
我们证明，初级培养技术允许定量异源自发Ca2+活性（图1）。因此，这是一个理想的细胞培养系统模型，用于研究吨位活性细胞，如中脑、新皮质神经元和超血核（SCN）16、17,的GABAergic神经元的起搏多巴胺神经元。在大多数应用中，Ca2+成像无法达到与电生理学相同的时间分辨率。因此，单个 Ca2+事件很可能类似于神经元作用电位的爆发。这可解释为 Ca2+成像允许相对精确测量起搏细胞中的异常爆发活动，因此适用于 Ca2+ 中培养兴奋细胞死亡的高含量屏幕。
为了实现和维护自发的 Ca2+活动，必须解决协议中的两个关键点。首先是解剖后细胞的电镀密度。对于原发性VM神经元，先前的研究已经使用了大约100，000个细胞/厘米29，10。9,10我们已经调整了协议，将200，000个细胞/cm2的密度进行板，从而产生一个自发活动的异质范围，并增加了每个盖玻片上存在的多巴胺VM神经元的数量。由于不同的起搏神经元具有不同的发射特性16，电镀密度需要根据所研究的细胞类型进行定制和优化，以达到理想的自发活性水平。第二是AAV病毒感染后孵育时间。与电镀密度一样，这将取决于研究问题的具体背景和使用的 AAV 类型。对于此处使用的特定 AAV，病毒感染后 5 天的孵育是达到所需蛋白质表达水平的理想值，这允许 GCaMP 荧光的动态变化，以记录 Ca2+活性。许多因素决定了 AAV 能够快速高效地表达其货物，其中很多都超出了这种方法的范围，但简言之，考虑促进剂活性和货物蛋白成熟和折叠的速度非常重要。
该方法的另一个优点是，它允许在格式、表达载体、成像设备的使用以及可以解决的一系列科学问题方面具有相当大的灵活性。此外，该方法还能够调查围绕PD中谷氨酸的兴奋性和其他神经系统功能障碍模型的广泛具体问题。例如，谷氨酸中质兴奋性涉及多个受体和信号级联5。通过使用该方法，如图1所示，与APAR阻滞器 NBQX一起，有可能在生理和分子水平上解剖出兴奋性谷氨酸反应的特定成分。可以想象，使用第二信使系统抑制剂的类似方法可以用来确定它们对兴奋毒性的贡献。此外，此处使用的 AAV 可用于使用细胞特异性启动子或 AAV 表示的光遗传学传感器来表示 GEC，这些传感器可用于测量其他参数，如神经递质释放。
除了初级胚胎解剖和共生成像外，大部分协议都使用不需要专门培训的基本实验室技能。因此，该模型的局限性包括胚胎解剖技术的难度、细胞培养时间长或需要获得共生显微镜或类似成像设备。该方法的许多优点和灵活性超过了这些限制，使其成为研究谷氨酸促进兴奋在神经系统疾病中的作用的理想模型。最后，该模型可以有效地筛选新的化合物，防止抗凋亡效果，并保护DA神经元健康的能力。

帕金森病（PD）是全世界第二常见的神经退行性疾病，没有已知的治疗方法。据估计，PD患病率将继续上升，预计到2030年，仅美国就有100万例诊断。由于目前可用于对抗PD的有效治疗很少，因此迫切需要开发更有效的治疗方法。PD的特点是中脑多巴胺（DA）神经元2的快速和渐进损失。在PD中神经退化的成理理，人们对此知之甚少。有证据表明，多种机制（如氧化应激和线粒体功能障碍等）可能收敛，有助于启动凋亡信号级联和最终细胞死亡3。
其中一种这种收敛机制，谷氨酸的中质兴奋性已经牵连到多种神经退行性疾病，包括PD4。虽然谷氨酸调节的兴奋性被认为主要通过刺激NMDA受体通过细胞内Ca2+浓度的过度增加和最终启动凋亡，Ca2+渗透的AMPA受体也牵连在兴奋毒性反应5，6，7。,6,7因此，在PD模型中确定AMPA受体对谷氨酸受体的细胞凋亡的贡献是值得感兴趣的。这可以通过NBQX，一种AMPA和先天阻滞剂实现，在微摩尔浓度下，对AMPA受体8是选择性的。谷氨酸培养的兴奋和凋亡信号级联是测量细胞死亡程度的理想下游目标，也是治疗干预的潜在目标。因此，开发一种高含量的方法，评估谷氨酸调制的钙活性和相关下游信号在初级腹腔（VM）神经元将有价值的筛选新的治疗方法，其能力，以保持神经元健康。
在这里，我们开发了一个协议，其中我们表达基因编码的钙指标（GECI，GCaMP6f，使用AAV2/5与人类突触（hSyn）促进运动测量Ca2+活动小鼠VM 原生神经元的反应谷氨酸应用，可以在生理和分子水平测量。这种高含量的筛选可以适用于发现药物或治疗，调节Ca2+活性 ，以保持VM神经元的健康。我们提出，这种初级培养模型是基于其保护VM神经元健康并减轻PD进展的能力，对新型PD干预进行筛选的有效方法。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Formalin/PBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100496-506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X NA 0.3 water-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UMPLFLN10XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm circular cover glass No. 1</td>
			<td>Phenix Research Products</td>
			<td>MS20-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X NA 0.85 oil-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO20XO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm uncoated plastic cell culture dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X NA 0.3 water-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LUMPLFLN40XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X NA 1.35 oil-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO60XO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin (sodium)</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>A-301-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td>50x stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binolcular Microscope</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>KSCXTS-1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2), anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (DNase)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose, andydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RDD016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM + GlutaMAX medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10569010</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equine serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26050088</td>
			<td>heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Illuminator, 100V</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>KSC5410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System, PES 22UM 250ML</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28199-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoview 1000 confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoview 1200 confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-chicken Alexa Fluor 594</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-rabbit Alexa Fluor 594</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks-balanced Salt Solution (HBSS) 1x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14175095</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101170-478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeraCell 150 CO2 incubator</td>
			<td>Heraeus (ThermoFisher)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ v1.52e</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS-Fine Scissors (Round Type)-S/S Str/31*8mm/13cm</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S12014-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>K-120-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2), andydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPII Mini-Peristaltic Pump, 115/230 VAC, 50/60 Hz</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MULLER Micro Forceps-Str, 0.15mm Tips, 11cm</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11014-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBQX</td>
			<td>Hello Bio</td>
			<td>HB0443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (NGS)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin 2020</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>100837-AAV1</td>
			<td>Titer: 1.00E+13 gc/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington Biomedical Corporation</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010049</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl), anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head Tubing Pieces For MPII</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>55-4148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal anti-caspase-3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl), anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>BioXtra, &#8805;99.5% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-pregnant female C57BL/6 mice</td>
			<td>Texas A&#38;M Institue for Genomic Medicine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-bore blue pipette tips P1000</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83007-380</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying spontaneous ca2+ fluxes and their downstream effects in primary mouse midbrain neurons

帕金森病 （PD） 是一种破坏性的神经退行性疾病，由多巴胺（DA）神经元退化引起。由于谷氨酸受体的异常激活导致过多的 Ca2+ 流入导致 DA 兴奋性，并被确定为 DA 神经元损失的重要机制。在这项研究中，我们从ED14小鼠胚胎的小鼠腹腔脑（VM）中分离和培养中脑神经元。然后，我们感染长期原发性小鼠中脑培养物与腺相关病毒（AAV），表达基因编码的钙指标，GCaMP6f在人类神经元特异性突触促进剂hSyn的控制之下。使用实时共体成像，我们显示培养小鼠中脑神经元显示AAV-hSyn-GCaMP6f检测到的自发的Ca2+ 通量。谷氨酸在中脑培养物的沐浴应用导致神经元内细胞Ca2+的异常 升高，并伴有DA神经元中的caspase-3活化，免疫污染就证明了这一点。识别原发性小鼠DA神经元中谷氨酸介质细胞凋亡的技术对于保持DA神经元健康的药物的高含量筛选具有重要的应用。

在细胞的初始培养后，我们用1 μL的AAV hSyn-GCaMP6f在14 DIV处理VM培养皿，并允许5天的病毒表达。在成像当天，HEPES记录缓冲液准备新鲜。我们使用了两个条件;在一个条件 20 μM 谷氨酸应用 10 分钟， 而在另一个条件 5 分钟 10 μM NBQX 应用之前 10 分钟共同应用 10 μM NBQX = 20 μM 谷氨酸.在这两个条件下，我们观察到GCaMP6f荧光的异质和自发变化，这些荧光表示自发的Ca2+通量，如代表性的轨迹所示（图1A，B，补充电影1-2）。20 μM谷氨酸的应用在自发活性神经元和静止神经元中产生了强健和持续的Ca2+反应（图1A，补充电影1）。应用10μM NBQX减少自发活性，并部分阻断谷氨酸反应（图1B，补充电影2）。谷氨酸应用在每个条件下刺激 Ca2+响应的程度使用曲线下的区域、峰值振幅和响应延迟进行量化。曲线下的区域和峰值振幅都相似，谷氨酸和NBQX + 谷氨酸处理条件（图1C），而响应延迟在NBQX = 谷氨酸条件（图2A，B）显著增加。 Figure 2除了量化Ca2+对谷氨酸治疗的反应外，我们还用抗卡斯帕塞-3抗体固定和染色样品，作为谷氨酸介质细胞凋亡的测量。我们观察到一系列在条件中的卡斯帕塞-3激活（图3A，B）。Caspase-3活化通过测量面积和平均卡斯帕塞-3强度进行量化。与未经治疗的对照细胞相比，谷氨酸和NBQX+谷氨酸条件下具有卡斯帕塞-3活化的细胞的平均面积呈显著趋势（图3B）。与未经治疗的对控相比，谷氨酸和NBQX + 谷氨酸条件均值的caspase-3强度明显高于（图3B）。这些结果共同展示了一个高含量的框架，在这个框架中，可以通过量化Ca2+对兴奋毒性剂的反应来测量神经元的凋亡，并随后分析下游凋亡事件，如在同一组培养物中的 caspase-3 激活。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig01.jpg"> 图1：培养的腹腔神经元表现出自发的Ca2+ 活性，并由谷氨酸应用有力地刺激。（A） VM神经元中自发的Ca2+ 活性的代表性痕迹及其对20μM谷氨酸应用的反应。（B） VM神经元中自发 Ca2+ 活性 的代表性痕迹及其对 10 μM NBQX = 20 μM 谷氨酸应用的反应。（C） 显示Ca2+ 曲线下面积和峰值振幅的群体数据。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig01large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig02v3.jpg"> 图2：AMPAR封锁与NBQX延迟对谷氨酸应用在培养的腹腔脑神经元的反应。（A） 代表 Ca2+ 谷氨酸（灰色）和 NBQX + 谷氨酸（蓝色）的痕迹引起反应。平均 Ca2+ 谷氨酸（黑色）和 NBQX + 谷氨酸（红色）的痕迹显示叠加。（B） 显示谷氨酸和 NBQX + 谷氨酸响应延迟的人口数据引起响应。谷氨酸和 NBQX = 谷氨酸条件之间的百分比变化显示在右侧面板中。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig02v3large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig03v3.jpg"> 图3：谷氨酸应用增加酪氨酸羟基酶（TH）阳性腹腔神经元中的卡斯帕塞-3表达。（A） 代表 VM 培养物的共生图像免疫，用于 caspase-3（绿色）和 TH（红色），比例杆 = 10 μm. （ B ）显示DA 神经元面积和 caspase-3 表达式在每个条件下的均值。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig03v3large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
补充电影1：自发的Ca 2+ 活动和对谷氨酸应用的反应。 在存在 HEPES 记录缓冲液 （0-300 s） 的情况下，自发的 Ca2+ 通量，然后应用 20 μM 谷氨酸 （301-600 s）。缩放栏 = 50 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61481/Supplementary_Movie%201_glutamate_ver_2.avi" target="_blank">请点击这里下载此视频。</a>
补充电影2：自发的Ca2+ 活动和响应NBQX+谷氨酸应用程序。 在存在 HEPES 记录缓冲液 （0-300 s） 时，自发 Ca2+ 通量，然后应用 10 μM NBQX （301-600 s）， 10 μM NBQX = 20 μM 谷氨酸 （601-900 s）。缩放栏 = 50 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61481/Supplementary_Movie_2_NBQX_glut.avi" target="_blank">请点击这里下载此视频。</a>

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Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

在这里，我们提出了一个协议，测量体外Ca 2+ 通量在中脑神经元及其下游影响卡斯帕塞-3使用原发性小鼠中脑培养。该模型可用于研究与中脑神经元异常Ca2+ 活性相关的病理生理变化，并筛选抗凋亡特性的新疗法。

定量自发 Ca2+ 通量及其在原发性小鼠中脑神经元中的下游效应

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx ...

该协议量化多巴胺能神经元中的钙通量，这些神经元在帕金森病中丢失。这对于了解异常钙如何导致帕金森病多巴胺神经元损失非常有用。我们首次展示了培养的原发性中脑神经元中的自发钙通量。此方法可用于解剖钙中质凋亡中涉及的特定受体贡献。我们的方法为高含量药物筛选提供了一个途径，以发现帕金森病的特定和有效的神经保护化合物。这些神经保护化合物将防止多巴胺神经元中钙介质凋亡。首先准备一毫升无血清DMEM介质，每盘一粒hSyn-GCaMP6f AAV。从每道菜中吸出细胞培养基，用 hSyn-GCaMP6f 将其替换为一毫升的已准备好的 DMEM。将盘子放回37摄氏度的孵化器中一小时。孵育后，用AAV吸升培养，代之以三毫升细胞培养培养。在37摄氏度下孵化5至7天。在整个病毒感染期间，每两到三天更换一次介质。根据稿稿说明，准备一升 HEPES 记录缓冲液、200 毫升 20 微摩尔谷氨酸记录缓冲液和 200 毫升 10 微摩尔 NBQX 记录缓冲液。用三毫升的录音缓冲液填充无菌的35毫米培养皿。从培养箱中取出与受感染培养物的培养皿，然后用细尖钳小心地抓住一个盖滑的边缘，然后用记录缓冲器将其转移到培养皿中。将剩余的盖滑中移回 37 摄氏度的培养箱，然后将带记录缓冲液的培养皿运送到共合显微镜中。启动映像软件。初始化时，启动近位泵，将管路放入记录缓冲区。然后将流量校准为每分钟两毫升。将受感染的盖滑从培养皿转移到带细钳的录音浴。使用 10X 水浸目标和亮场光，找到焦点平面并查找神经元细胞体高密度区域，然后切换到 40 倍目标并重新聚焦样本。在"染料"列表窗口中选择并应用 AlexaFluor 488。为了防止荧光团过度曝光和照片漂白，请从低高压和激光功率设置开始。对于 AlexaFluor 488 通道，将 HV 设置为 500，将增益设置为 1 倍，将偏移设置为零。将 488 激光线的功率设置为 5%。将针孔尺寸增加至 300 微米，并使用对焦 x2 扫描选项以最佳方式将发射信号调整到饱和水平。然后可以调整设置，以优化每个通道的可见性。显微镜设置优化后，移动舞台以定位具有多个细胞的区域，该区域在 GCaMP6f 荧光中显示自发变化，并专注于所需的平面进行成像。使用"剪辑"工具将成像帧剪辑到可达到不到一秒的帧间隔的大小。将间隔窗口设置为值 1.0，将 Num 窗口设置为 600。要捕获 t 系列影片，请选择"时间"选项，然后使用 Xyt 扫描选项开始成像。观看成像进度条，并在适当的时间点将线从 HEPES 记录缓冲区移动到 20 微摩尔谷氨酸记录缓冲区。完成成像后，选择完成序列的按钮并保存完成的 t 系列影片。继续多用谷氨酸五分钟，使神经元的培养被谷氨酸接触共10分钟。对要成像的每个盖单重复此过程。实验后立即可以查看钙的痕迹和神经元细胞体。使用椭圆工具绘制神经元周围所需的 ROIs 数量。并使用"系列分析"按钮可视化跟踪。在额外五分钟接触谷氨酸后，用细钳从浴缸中取下盖滑，然后用记录缓冲液将其放回培养皿中，直到完成所有成像。在成像当天，VM 培养物被处理谷氨酸或谷氨酸和 NBQX 的组合。在这两种条件下，观察到GCaMP6f荧光的异质和自发变化，表明自发的钙通量。谷氨酸的应用在自发活性和静止神经元中产生了强大和持续的钙反应。NBQX的应用减少了自发活性，并部分阻断了谷氨酸反应。谷氨酸应用在每个条件下刺激钙反应的程度使用曲线下的区域、峰值振幅和响应延迟进行量化。在 NBQX 和谷氨酸条件下，响应延迟增加。为了测量谷氨酸介质的凋亡，这些细胞被固定并染色在抗卡斯帕塞-3抗体中。与未经治疗的对联相比，两种治疗条件下均值的 caspase-3 强度要高得多。通过计算控制和谷氨酸治疗条件下的免疫盐酪氨酸羟基酶阳性多巴胺能神经元的数量，可以更彻底地分析兴奋的毒性细胞死亡。这项技术为了解多巴胺神经中钙介质凋亡的不同受体和铁通道的相对贡献铺平了道路。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection和胚胎小鼠海马和皮层神经元的原代培养

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

科研

神经科学

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

成像pHluorin标记插入到质膜受体原代培养的小鼠神经元

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

原代海马神经元的磷酸钙转染

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

小鼠多巴胺能神经元的原代培养

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

中脑多巴胺神经元的数目在成年小鼠环境的调变

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

亚细胞钙荧光和生物发光成像<sup&gt; 2+</sup&gt;老年海马神经元

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

小鼠小脑颗粒神经元神经元死亡和变性的模型研究

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

用反褶积显微镜观察小鼠原发性下丘脑神经元 GLUT4 蛋白的动态图像

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

小鼠初级少突胶质的快速特异磁分离

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Effects in Cultured Mouse Neurons

在培养的小鼠神经元中可视化轴突生长锥塌陷和早期淀粉样β效应

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...