Name: quantifying spontaneous ca2+ fluxes and their downstream effects in primary mouse midbrain neurons
Uploaded: 2020-09-09T14:00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons at JoVE.com

Ondersteund door subsidies van de American Parkinson Disease Association (APDA) en NIH R01NS15809-01 aan RS. Wij danken het Texas A&M Institute for Genomic Medicine (TIGM) voor het verstrekken van getimede zwangere muizen om primaire dopaminerge culturen te genereren.

<ol>
	<li>Marras, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+Parkinson's+disease+across+North+America.">Prevalence of Parkinson's disease across North America.</a> NPJ Parkinson's Disease. 4, 21 (2018).</li><li>Poewe, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson+disease.">Parkinson disease.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013 (2017).</li><li>Mehta, A., Prabhakar, M., Kumar, P., Deshmukh, R., Sharma, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxicity:+bridge+to+various+triggers+in+neurodegenerative+disorders.">Excitotoxicity: bridge to various triggers in neurodegenerative disorders.</a> European Journal of Pharmacology. 698 (1-3), 6-18 (2013).</li><li>Ambrosi, G., Cerri, S., Blandini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+further+update+on+the+role+of+excitotoxicity+in+the+pathogenesis+of+Parkinson's+disease.">A further update on the role of excitotoxicity in the pathogenesis of Parkinson's disease.</a> Journal of Neural Transmission (Vienna). 121 (8), 849-859 (2014).</li><li>Dong, X. X., Wang, Y., Qin, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+excitotoxicity+and+their+relevance+to+pathogenesis+of+neurodegenerative+diseases.">Molecular mechanisms of excitotoxicity and their relevance to pathogenesis of neurodegenerative diseases.</a> Acta Pharmaceutica Sinica B. 30 (4), 379-387 (2009).</li><li>Vieira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxicity+through+Ca2+-permeable+AMPA+receptors+requires+Ca2+-dependent+JNK+activation.">Excitotoxicity through Ca2+-permeable AMPA receptors requires Ca2+-dependent JNK activation.</a> Neurobiology of Disease. 40 (3), 645-655 (2010).</li><li>Sebe, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)-Permeable+AMPARs+Mediate+Glutamatergic+Transmission+and+Excitotoxic+Damage+at+the+Hair+Cell+Ribbon+Synapse.">Ca(2+)-Permeable AMPARs Mediate Glutamatergic Transmission and Excitotoxic Damage at the Hair Cell Ribbon Synapse.</a> Journal of Neuroscience. 37 (25), 6162-6175 (2017).</li><li>Brickley, S. G., Farrant, M., Swanson, G. T., Cull-Candy, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNQX+increases+GABA-mediated+synaptic+transmission+in+the+cerebellum+by+an+AMPA/kainate+receptor-independent+mechanism.">CNQX increases GABA-mediated synaptic transmission in the cerebellum by an AMPA/kainate receptor-independent mechanism.</a> Neuropharmacology. 41 (6), 730-736 (2001).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smoking-Relevant+Nicotine+Concentration+Attenuates+the+Unfolded+Protein+Response+in+Dopaminergic+Neurons.">Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).</li><li>Henley, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+Identification+of+Living+Dopaminergic+Neurons+in+Midbrain+Cultures+Using+RNA+Sequencing+and+TH-promoter-driven+eGFP+Expression.">Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e54981 (2017).</li><li>Douhou, A., Troadec, J. D., Ruberg, M., Raisman-Vozari, R., Michel, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+promotion+of+mesencephalic+dopaminergic+neurons+by+depolarizing+concentrations+of+K++requires+concurrent+inactivation+of+NMDA+or+AMPA/kainate+receptors.">Survival promotion of mesencephalic dopaminergic neurons by depolarizing concentrations of K+ requires concurrent inactivation of NMDA or AMPA/kainate receptors.</a> Journal of Neurochemistry. 78 (1), 163-174 (2001).</li><li>Lavaur, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+noble+gas+xenon+provides+protection+and+trophic+stimulation+to+midbrain+dopamine+neurons.">The noble gas xenon provides protection and trophic stimulation to midbrain dopamine neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 142 (1), 14-28 (2017).</li><li>Kritis, A. A., Stamoula, E. G., Paniskaki, K. A., Vavilis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Researching+glutamate+-+induced+cytotoxicity+in+different+cell+lines:+a+comparative/collective+analysis/study.">Researching glutamate - induced cytotoxicity in different cell lines: a comparative/collective analysis/study.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 91 (2015).</li><li>Gupta, K., Hardingham, G. E., Chandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-dependent+glutamate+excitotoxicity+in+human+embryonic+stem+cell-derived+neurons.">NMDA receptor-dependent glutamate excitotoxicity in human embryonic stem cell-derived neurons.</a> Neuroscience Letters. 543, 95-100 (2013).</li><li>Surmeier, D. J., Obeso, J. A., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+neuronal+vulnerability+in+Parkinson+disease.">Selective neuronal vulnerability in Parkinson disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (2), 101-113 (2017).</li><li>Ramirez, J. M., Tryba, A. K., Pena, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacemaker+neurons+and+neuronal+networks:+an+integrative+view.">Pacemaker neurons and neuronal networks: an integrative view.</a> Current Opinion in Neurobiology. 14 (6), 665-674 (2004).</li><li>Guzman, J. N., Sanchez-Padilla, J., Chan, C. S., Surmeier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+pacemaking+in+substantia+nigra+dopaminergic+neurons.">Robust pacemaking in substantia nigra dopaminergic neurons.</a> Journal of Neuroscience. 29 (35), 11011-11019 (2009).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

We beschrijven een lange termijn primaire ventrale mesencephalic (VM) celkweeksysteem voor high-content analyse van glutamaat-gemedieerde apoptose in neuronen. Studies hebben primaire midbrain dopaminergische culturen gebruikt om excitotoxische mechanismen op te helderen in de context van PD-modellen11,12. In deze studie hanteren we een combinatorische benadering met behulp van genetisch gecodeerde calciumindicatoren (GECI's) om Ca2+ activiteit te meten en deze activiteit verder te associëren met downstream moleculaire veranderingen, zoals het initiëren van apoptotische signaleringscascade's4. De methode heeft meerdere voordelen voor andere soortgelijke celkweeksystemen. Aangezien we vooral geïnteresseerd zijn in excitotoxiciteit binnen de context van de ziekte van Parkinson, is het gebruik van primaire VM-celculturen ideaal. Door gebruik te maken van verschillende veldverplaatsingstechnieken, zoals geraste coverslips of een gemotoriseerde XY-microscoopfase in combinatie met TH-immunostaining, kunnen we de specifieke effecten van glutamaat-gemediteerde apoptose in ventrale midbrainneuronen direct bestuderen. Bovendien, de 3-weekse cel cultuur model maakt het mogelijk voor neuronen om hun volledige, volwassen moleculaire profiel te ontwikkelen, als gevolg van volwassen DA neuronen9. Eerdere methoden waren voornamelijk gericht op moleculaire veranderingen na glutamaat-gemedieerde excitotoxiciteit13,14. Het model is uniek in zijn vermogen om acute veranderingen in de neuronale fysiologie te correleren met downstream moleculaire gebeurtenissen in geïdentificeerde celtypen. Een beperking van het primaire cultuurmodel is dat de dissectietechniek de gehele ventrale midbrain vangt, inclusief DA- en GABAergic-neuronen en neuronen van de SNc en VTA. Bewijs suggereert nu dat DA neuronen van de SNc hebben selectieve kwetsbaarheid voor calcium en uiteindelijke celdood in vergelijking met DA neuronen van de naburige VTA15. Helaas, differentiërende SNc van VTA neuronen in embryonale culturen heeft bewezen moeilijk met weinig anatomische oriëntatiepunten om deze structuren te definiëren in de embryonale hersenen.
We tonen aan dat de primaire cultuurtechniek het mogelijk maakt om heterogene spontane Ca2+ activiteit te kwantificeren(figuur 1). Daarom is dit een ideaal celcultuursysteemmodel om tonisch actieve cellen te bestuderen, zoals pacemaking dopaminerge neuronen van de midbrain, neocorticale neuronen en GABAergic neuronen van de suprachiasmatische kern (SCN)16,17. In de meeste toepassingen bereikt Ca2+ imaging niet dezelfde temporele resolutie als elektrofysiologie. Daarom is het waarschijnlijk dat een enkele Ca2 + gebeurtenis is analoog aan een uitbarsting van neuronale actie potentialen. Dit kan worden geïnterpreteerd om te betekenen dat Ca2 + imaging zorgt voor relatief nauwkeurige metingen van abnormale bursting activiteit in pacemaking cellen en is daarom geschikt voor een hoog gehalte scherm van Ca2 +-gemedieerde excitotoxische celdood.
Om spontane Ca2+ activiteit te bereiken en te onderhouden, is het belangrijk om twee belangrijke punten in het protocol aan te pakken. Ten eerste is de beplatingsdichtheid van de cellen na dissectie. Voor primaire VM-neuronen hebben eerdere studies ongeveer 100.000 cellen/cm29,10gebruikt. We hebben het protocol aangepast om een dichtheid van 200.000 cellen/cm2te plaaten, wat een heterogene reeks spontane activiteit creëert en het aantal dopaminerge VM-neuronen op elke coverslip verhoogt. Aangezien verschillende pacemaking neuronen hebben verschillende vuren eigenschappen16, de beplating dichtheid moet worden aangepast aan het celtype wordt bestudeerd en geoptimaliseerd om ideale niveaus van spontane activiteit te bereiken. Ten tweede is de incubatietijd na virale infectie van AAV's. Net als plating dichtheid, zal dit afhangen van de specifieke context van het onderzoek vraag en het type van AAV wordt gebruikt. Voor de specifieke AAV die hier wordt gebruikt, is 5 dagen incubatie na virale infectie ideaal om de gewenste eiwitexpressieniveaus te bereiken, wat dynamische veranderingen in GCaMP-fluorescentie mogelijk maakt om Ca2+ activiteit op te nemen. Veel factoren bepalen hoe snel en efficiënt een AAV zijn lading zal uitdrukken, waarvan een groot deel buiten het toepassingsgebied van deze methode valt, maar kortom, het is belangrijk om de promotoractiviteit en de snelheid waarmee het ladingeiwit rijpt en plooien heeft, te overwegen.
Een ander voordeel van de methode is dat het zorgt voor een aanzienlijke flexibiliteit in formaat, expressie vectoren, het gebruik van beeldvormingsapparatuur, en het bereik van wetenschappelijke vragen die kunnen worden aangepakt. Bovendien maakt de methode onderzoek mogelijk naar een breed scala aan specifieke vragen die glutamaat-gemedieerde excitotoxiciteit in PD en andere modellen van zenuwsfunctie omringen. Bijvoorbeeld, glutamaat-gemedieerde excitotoxiciteit omvat meerdere receptoren en signalering cascades5. Door de methode te gebruiken, en zoals aangetoond met de AMPAR-blokker, NBQX in figuur 1,is het mogelijk om specifieke componenten van de excitotoxische glutamaatrespons op fysiologisch en moleculair niveau te ontleden. Denkbaar, een soortgelijke aanpak met behulp van remmers van tweede boodschapper systemen kunnen worden gebruikt om hun bijdrage aan excitotoxiciteit te bepalen. Bovendien kunnen de AAV's die hier worden gebruikt worden aangepast om GECI's uit te drukken met celspecifieke promotors of AAV-uitgedrukte optogenetische sensoren die kunnen worden gebruikt om andere parameters te meten, zoals neurotransmitter-release.
Afgezien van primaire embryonale dissecties en confocale beeldvorming, veel van het protocol maakt gebruik van elementaire laboratoriumvaardigheden die geen gespecialiseerde opleiding vereisen. Daarom zijn de beperkingen van het model onder meer de moeilijkheid van de embryonale dissectietechniek, de lengte van de tijd dat de cellen moeten worden gekweekt om volwassenheid te bereiken, en toegang tot een confocale microscoop, of soortgelijke beeldvormingsapparatuur. De vele voordelen en flexibiliteit van de methode weegt op tegen deze beperkingen, waardoor dit een ideaal model is om de rol glutamaat-gemedieerde excitotoxiciteit in aandoeningen van het zenuwstelsel te bestuderen. Ten slotte kan dit model een effectief hulpmiddel zijn om nieuwe verbindingen te screenen op anti-apoptotische effecten en hun vermogen om de gezondheid van DA-neuronen te behouden.

De ziekte van Parkinson (PD) is de tweede meest voorkomende neurodegeneratieve aandoening wereldwijd, zonder bekende genezing. Schattingen suggereren dat pd prevalentie zal blijven toenemen en zal naar verwachting meer dan 1 miljoen diagnoses tegen het jaar 2030 in de Verenigde Staten alleenal 1. Met weinig effectieve behandelingen die momenteel beschikbaar zijn om PD te bestrijden, is er een dringende noodzaak om effectievere therapieën te ontwikkelen. PD wordt gekenmerkt door een snel en progressief verlies van midbrain dopamine (DA) neuronen2. De mechanismen die ten grondslag liggen aan neurodegeneratie in PD zijn slecht begrepen. Bewijs suggereert een waarschijnlijke convergentie van meerdere mechanismen, zoals oxidatieve stress en mitochondriale disfunctie, enz.3
Een dergelijk convergent mechanisme, glutamaat-gemedieerde excitotoxiciteit is betrokken bij meerdere neurodegeneratieve ziekten, waaronder PD4. Terwijl glutamaat-gemedieerde excitotoxiciteit wordt gedacht om vooral te werken door middel van stimulatie van NMDA receptoren via een overmatige toename van intracellulaire Ca2 + concentratie en uiteindelijke initiatie van apoptose, Ca2 +-doorlatende AMPA receptoren zijn ook betrokken bij de excitotoxische respons5,6,7. Daarom is het van belang om de bijdrage van AMPA-receptoren aan glutamaat-gemedieerde apoptose binnen een PD-model te bepalen. Dit kan worden bereikt met NBQX, een AMPA en kainate blocker, die bij micromolar concentraties selectief is voor AMPA receptoren8. Glutamaat-gemedieerde excitotoxiciteit en apoptotische signalering cascades zijn een ideaal downstream doel om de omvang van celdood te meten, en een potentieel doelwit voor therapeutische interventie. Daarom zou het ontwikkelen van een hoog-gehalte methode voor het beoordelen van glutamaat-gemedieerde modulatie van calciumactiviteit en bijbehorende downstream signalering in primaire ventrale mesencephalic (VM) neuronen waardevol zijn voor het screenen van nieuwe behandelingsmethoden op hun vermogen om neuronale gezondheid te behouden.
Hier hebben we een protocol ontwikkeld waarin we de genetisch gecodeerde calciumindicator (GECI), GCaMP6f uitdrukken, met behulp van AAV2/5 met de menselijke synapsine (hSyn) promotor om de Ca2+ activiteit van muis VM primaire neuronen te meten in reactie op glutamaattoepassing die kan worden gemeten op fysiologisch en moleculair niveau. Deze high-content screening kan worden aangepast voor het ontdekken van geneesmiddelen of behandelingen die Ca2 + activiteit moduleren om de gezondheid van VM neuronen te behouden. Wij stellen voor dat dit primaire cultuurmodel een effectieve manier is om nieuwe PD-interventies te screenen, gebaseerd op hun vermogen om de gezondheid van VM-neuronen te behouden en de progressie van PD te beperken.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Formalin/PBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100496-506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X NA 0.3 water-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UMPLFLN10XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm circular cover glass No. 1</td>
			<td>Phenix Research Products</td>
			<td>MS20-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X NA 0.85 oil-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO20XO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm uncoated plastic cell culture dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X NA 0.3 water-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LUMPLFLN40XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X NA 1.35 oil-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO60XO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin (sodium)</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>A-301-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td>50x stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binolcular Microscope</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>KSCXTS-1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2), anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (DNase)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose, andydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RDD016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM + GlutaMAX medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10569010</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equine serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26050088</td>
			<td>heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Illuminator, 100V</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>KSC5410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System, PES 22UM 250ML</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28199-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoview 1000 confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoview 1200 confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-chicken Alexa Fluor 594</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-rabbit Alexa Fluor 594</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks-balanced Salt Solution (HBSS) 1x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14175095</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101170-478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeraCell 150 CO2 incubator</td>
			<td>Heraeus (ThermoFisher)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ v1.52e</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS-Fine Scissors (Round Type)-S/S Str/31*8mm/13cm</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S12014-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>K-120-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2), andydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPII Mini-Peristaltic Pump, 115/230 VAC, 50/60 Hz</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MULLER Micro Forceps-Str, 0.15mm Tips, 11cm</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11014-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBQX</td>
			<td>Hello Bio</td>
			<td>HB0443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (NGS)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin 2020</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>100837-AAV1</td>
			<td>Titer: 1.00E+13 gc/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington Biomedical Corporation</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010049</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl), anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head Tubing Pieces For MPII</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>55-4148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal anti-caspase-3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl), anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>BioXtra, &#8805;99.5% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-pregnant female C57BL/6 mice</td>
			<td>Texas A&#38;M Institue for Genomic Medicine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-bore blue pipette tips P1000</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83007-380</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying spontaneous ca2+ fluxes and their downstream effects in primary mouse midbrain neurons

De ziekte van Parkinson (PD) is een verwoestende neurodegeneratieve aandoening veroorzaakt door de degeneratie van dopaminerge (DA) neuronen. Overmatige Ca2 + instroom als gevolg van de abnormale activering van glutamaat receptoren resulteert in DA excitotoxiciteit en is geïdentificeerd als een belangrijk mechanisme voor DA neuron verlies. In deze studie isoleren, scheiden en cultuur midbrain neuronen van de muis ventrale mesencephalon (VM) van ED14 muisembryo's. Vervolgens infecteren we de lange termijn primaire muis midbrain culturen met een adeno-geassocieerd virus (AAV) uitdrukken van een genetisch gecodeerde calcium indicator, GCaMP6f onder controle van de menselijke neuron-specifieke synapsin promotor, hSyn. Met behulp van live confocale beeldvorming, tonen we aan dat gekweekte muis midbrain neuronen tonen spontane Ca2 + fluxen gedetecteerd door AAV-hSyn-GCaMP6f. Badtoepassing van glutamaat op midbrainculturen veroorzaakt abnormale verhogingen in intracellulaire Ca2+ binnen neuronen en dit gaat gepaard met caspase-3-activering in DA-neuronen, zoals aangetoond door immunostaining. De technieken om glutamaat-gemedieerde apoptose in primaire muis DA neuronen te identificeren hebben belangrijke toepassingen voor de hoge inhoud screening van geneesmiddelen die DA neuron gezondheid te behouden.

Na de eerste kweek van cellen behandelden we VM-kweekschotels op 14 DIV met 1 μL AAV hSyn-GCaMP6f en toegestaan voor 5 dagen virale expressie. Op de dag van de beeldvorming werd hepes opnamebuffer vers bereid. We gebruikten twee voorwaarden; in één voorwaarde werd 20 μM glutamaat toegepast voor 10 min, terwijl in de andere voorwaarde 5 min van 10 μM NBQX toepassing voorafging aan een 10 min co-toepassing van 10 μM NBQX + 20 μM glutamaat. In beide omstandigheden hebben we heterogene en spontane veranderingen in de GCaMP6f-fluorescentie waargenomen, die duiden op spontane Ca2+ fluxen, zoals blijkt uit de representatieve sporen(figuur 1A,B, Aanvullende film 1-2). Toepassing van 20 μM glutamaat genereerde een robuuste en aanhoudende Ca2+ respons in zowel spontaan actieve als rustige neuronen (Figuur 1A, Supplemental Movie 1). Toepassing van 10 μM NBQX verminderde spontane activiteit en blokkeerde gedeeltelijk de glutamaatrespons (figuur 1B, aanvullende film 2). De mate waarin glutamaattoepassing een Ca2+ respons in elke voorwaarde stimuleerde, werd gekwantificeerd met behulp van het gebied onder de curve, piekamplitude en latentie om te reageren. Zowel het gebied onder de curve als de piekamplitude waren vergelijkbaar voor zowel de glutamaat- als de NBQX + glutamaat behandelde aandoeningen(figuur 1C),terwijl de latentie op respons aanzienlijk werd verhoogd in de NBQX + glutamaatconditie (figuur 2A,B). Naast het kwantificeren van de Ca2+ respons op glutamaatbehandeling, hebben we monsters vastgesteld en gekleurd met een anti-caspase-3-antilichaam als een maat van glutamaat-gemediteerde apoptose. We zagen een reeks caspase-3-activering over de omstandigheden(figuur 3A,B). Caspase-3 activering werd gekwantificeerd door meetgebied en gemiddelde caspase-3 intensiteit. In vergelijking met onbehandelde controlecellen, het gemiddelde gebied van cellen met caspase-3 activering onder glutamaat en NBQX + glutamaat voorwaarden trended naar betekenis (Figuur 3B). Gemiddelde caspase-3 intensiteit was aanzienlijk hoger in de glutamaat en NBQX + glutamaat voorwaarden in vergelijking met onbehandelde controles (Figuur 3B). Samen tonen deze resultaten een hoog-gehalte kader aan waarin apoptose van neuronen kan worden gemeten door Ca2+ reacties op excitoxische middelen te kwantificeren en gevolgd door een analyse van downstream apoptotische gebeurtenissen zoals caspase-3 activering in dezelfde reeks culturen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig01.jpg"> Figuur 1: Gekweekte ventrale mesencephalic neuronen vertonen spontane Ca2+ activiteit en worden robuust gestimuleerd door glutamaattoepassing. (A) Representatieve sporen van spontane Ca2+ activiteit in VM-neuronen en hun reactie op 20 μM Glutamaat toepassing. (B) Representatieve sporen van spontane Ca2+ activiteit in VM neuronen en hun reactie op 10 μM NBQX + 20 μM Glutamaat toepassing. (C) Bevolkingsgegevens die het gebied onder de curve en piekamplitude van Ca2+ sporen weergeven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig02v3.jpg"> Figuur 2: AMPAR blokkade met NBQX vertraagt de reactie op glutamaat toepassing in gekweekte ventrale mesencephalic neuronen. (A) Representatieve Ca2 + sporen van glutamaat (grijs) en NBQX + glutamaat (blauw) opgeroepen reacties. Gemiddelde Ca2 + sporen van glutamaat (zwart) en NBQX + glutamaat (rood) worden bedekt weergegeven. (B) Bevolkingsgegevens die latentie tonen op de reactie op glutamaat en NBQX + glutamaat riepen reacties op. Procentuele verandering tussen glutamaat en NBQX + glutamaat voorwaarden wordt weergegeven in het rechter paneel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig02v3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig03v3.jpg"> Figuur 3: Glutamaat toepassing verhoogt caspase-3 expressie in tyrosine hydroxylase (TH) positieve ventrale mesencephalic neuronen. (A) Representatieve confocale afbeeldingen van VM-culturen die immuun zijn voor caspase-3 (groen) en TH (rood), schaalbalk = 10 μm. (B) Bevolkingsgegevens die da-neurongebied en gemiddelde grijze waarde van caspase-3-expressie in elke toestand weergeven. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig03v3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Aanvullende Film 1: Spontane Ca2 + activiteit en reactie op glutamaat applicatie. Spontane Ca2+ fluxen in aanwezigheid van HEPES opnamebuffer (0-300 s) gevolgd door toepassing van 20 μM glutamaat (301-600 s). Schaalbalk = 50 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61481/Supplementary_Movie%201_glutamate_ver_2.avi" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>
Aanvullende Film 2: Spontane Ca2+ activiteit en reactie op NBQX + glutamaat applicatie. Spontane Ca2+ fluxen in aanwezigheid van HEPES opnamebuffer (0-300 s) gevolgd door toepassing van 10 μM NBQX (301-600 s) en 10 μMQX + 20 μM glutamaat (601-900 s). Schaalbalk = 50 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61481/Supplementary_Movie_2_NBQX_glut.avi" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons at JoVE.com

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Hier presenteren we een protocol om in vitro Ca2+ fluxen in midbrain neuronen en hun downstream effecten op caspase-3 met behulp van primaire muis midbrain culturen te meten. Dit model kan worden gebruikt om pathofysiologische veranderingen in verband met abnormale Ca2 + activiteit in midbrain neuronen te bestuderen, en om nieuwe therapieën voor anti-apoptotische eigenschappen te screenen.

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes en hun downstream effecten in primaire muis midbrain neuronen

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx ...

Dit protocol kwantificeert calciumstromen in dopaminerge neuronen, die verloren gaan bij de ziekte van Parkinson. Dit is handig om te begrijpen hoe abnormaal calcium dopaminerge neuron verlies veroorzaakt bij de ziekte van Parkinson. Voor het eerst tonen we spontane calciumstromen in gekweekte primaire midbrainneuronen.Deze methode kan worden gebruikt om specifieke receptorbijdragen die betrokken zijn bij calcium-gemedieerde apoptose te ontleden. Onze methode biedt een laan voor hoge inhoud drug schermen om specifieke en effectieve neuroprotectieve verbindingen voor de ziekte van Parkinson te ontdekken. Deze neuroprotectieve verbindingen zou voorkomen dat calcium-gemedieerde apoptose in dopaminerge neuron.Begin met het bereiden van een milliliter serum-vrij DMEM medium met een microliter van hSyn-GCaMP6f AAV per schotel. Aspirate de cel cultuur medium van elk gerecht en vervang het door een milliliter van de voorbereide DMEM met hSyn-GCaMP6f. Plaats de gerechten terug in de 37 graden Celsius incubator voor een uur.Na de incubatie, aspirate het medium met AAV's en vervang het door drie milliliter van celcultuur medium. Broed de gerechten vijf tot zeven dagen op 37 graden Celsius. Het veranderen van het medium om de twee tot drie dagen in deze periode van virale infectie.Bereid een liter van de HEPES opname buffer, 200 milliliter van 20 micromolar glutamaat opname buffer, en 200 milliliter van 10 micromolar NBQX opname buffer volgens manuscript aanwijzingen. Vul een steriele petrischaal van 35 millimeter met drie milliliter van de opnamebuffer. Neem de petrischaal met de geïnfecteerde culturen uit de couveuse, pak dan voorzichtig de rand van een cover slip met fijne tip tangen en breng het in de schotel met de opnamebuffer.Plaats de resterende afdekking slip in medium terug in de 37 graden Celsius incubator en vervoer de schotel met opname buffer naar de confocale microscoop. Start de beeldsoftware. Terwijl het initialiseren is, start de peristaltische pomp en plaats de lijn in de opnamebuffer.Kalibreer vervolgens de stroom tot twee milliliter per minuut. Breng de geïnfecteerde cover slip van de Petri schotel naar het opnamebad met fijne tangen. Met behulp van de 10X water onderdompeling doelstelling en brightfield licht, vind het vlak van focus en kijk voor een regio met een hoge dichtheid van neuron cel lichamen, dan overschakelen naar de 40X doelstelling en heroriënteren van het monster.Selecteer en pas AlexaFluor 488 toe in het lijstvenster Kleurstoffen. Om overbelichting en fotobleken van de fluoroforen te voorkomen, begint u met lage HV- en laservermogensinstellingen. Voor het AlexaFluor 488-kanaal stelt u de HV in op 500, de winst op 1x en de offset op nul.Stel het vermogen in op 5% voor de 488 laserlijn. Verhoog de pinhole grootte tot 300 micrometer en gebruik de focus x2 scanning optie om de emissiesignalen optimaal aan te passen aan subsaturatieniveaus. Instellingen kunnen vervolgens worden aangepast voor een optimale zichtbaarheid van elk kanaal.Zodra de microscoop instellingen zijn geoptimaliseerd, verplaatsen van het stadium om een regio te lokaliseren met meerdere cellen met spontane veranderingen in GCaMP6f fluorescentie en zich richten op het gewenste vlak voor beeldvorming. Gebruik het gereedschap Clipnect om het beeldframe te knippen tot een grootte die een frameinterval van iets minder dan een seconde kan bereiken. Stel het intervalvenster in op een waarde van 1,0 en het venster Num op 600.Als u een film uit de T-serie wilt vastleggen, selecteert u de optie Tijd en gebruikt u de scanoptie Xyt om te beginnen met beeldvorming. Bekijk de voortgangsbalk van de beeldvorming en verplaats de lijn van de HEPES-opnamebuffer naar de 20 micromolar glutamaat opnamebuffer op het juiste tijdstip. Wanneer de beeldvorming is voltooid, selecteert u de knop Series done en slaat u de voltooide t-serie film op.Blijf de glutamaat nog vijf minuten doornemen, zodat de cultuur van neuronen gedurende in totaal 10 minuten is blootgesteld aan glutamaat. Herhaal dit proces voor elke cover slip worden afgebeeld. Het is mogelijk om calciumsporen en neuronale cellichamen direct na het experiment te bekijken.Gebruik het gereedschap Ellips om het gewenste aantal ROI's rond neuronale soma te tekenen. En gebruik de knop Serieanalyse om de sporen te visualiseren. Na de extra vijf minuten blootstelling aan glutamaat, verwijder de cover slip uit het bad met fijne tangen en plaats het terug in de Petri schotel met de opname buffer totdat alle beeldvorming is voltooid.Op de dag van beeldvorming werden de VM-culturen behandeld met glutamaat of een combinatie van glutamaat en NBQX. In beide omstandigheden werden heterogene en spontane veranderingen in GCaMP6f-florescentie waargenomen, wat duidt op spontane calciumstromen. Toepassing van glutamaat genereerde een robuuste en aanhoudende calciumrespons in zowel spontaan actieve als rustige neuronen.Toepassing van NBQX verminderde spontane activiteit en blokkeerde gedeeltelijk de glutamaatrespons. De mate waarin glutamaattoepassing een calciumreactie in elke voorwaarde stimuleerde werd gekwantificeerd gebruikend het gebied onder de kromme, piekamplitude, en latentie om te antwoorden. De latentie naar respons nam toe onder de NBQX- en glutamaatconditie.Om glutamaat-gemedieerde apoptose te meten, werden de cellen gefixeerd en bevlekt met een anti-Caspase-3 antilichaam. Gemiddelde caspase-3 intensiteit was aanzienlijk hoger in beide behandelingsomstandigheden in vergelijking met onbehandelde controles. Een meer grondige analyse van opgewonden giftige celdood kan worden gedaan door het tellen van het aantal immunosbree tyrosine hydroxylase positieve dopaminerge neuronen in controle en glutamaat behandelde aandoening.Deze techniek heeft de weg vrijgemaakt voor het begrijpen van de relatieve bijdragen van verschillende receptoren en ijzerkanalen die betrokken zijn bij calcium-gemedieerde apoptose in dopaminerge neuron.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection en Primaire Cultuur van de embryonale Mouse hippocampus en de corticale neuronen

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

Imaging pHluorin-tagged Receptor invoegen in op het plasmamembraan in primaire gekweekte muis neuronen

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calciumfosfaattransfectie van Primary hippocampus neuronen

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Primaire Cultuur van de Muis dopaminerge neuronen

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

Milieu Modulaties van het aantal dopaminesysteem Neuronen in volwassen muizen

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescentie en Bioluminescentie beeldvorming van Subcellulaire Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; In Aged hippocampus Neuronen

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modelleren van neuronale dood en degeneratie in muis primaire cerebellaire submodule neuronen

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Live beelden van GLUT4 eiwit mensenhandel muis primaire hypothalame neuronen met behulp van deconvolutie microscopie

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Snelle en specifieke Immunomagnetic isolatie van de primaire oligodendrocyten muis

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualiseren van axonale groei Cone ineenstorting en vroege amyloïde β effecten in gekweekte muis neuronen

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...