Name: quantifying spontaneous ca2+ fluxes and their downstream effects in primary mouse midbrain neurons
Uploaded: 2020-09-09T14:00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons at JoVE.com

Unterstützt durch Stipendien der American Parkinson Disease Association (APDA) und NIH R01NS115809-01 an RS. Wir danken dem Texas A&M Institute for Genomic Medicine (TIGM) für die Bereitstellung von zeitzeitlich enträchtigen schwangeren Mäusen, um primäre dopaminerge Kulturen zu erzeugen.

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A., Vavilis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Researching+glutamate+-+induced+cytotoxicity+in+different+cell+lines:+a+comparative/collective+analysis/study.">Researching glutamate - induced cytotoxicity in different cell lines: a comparative/collective analysis/study.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 91 (2015).</li><li>Gupta, K., Hardingham, G. E., Chandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-dependent+glutamate+excitotoxicity+in+human+embryonic+stem+cell-derived+neurons.">NMDA receptor-dependent glutamate excitotoxicity in human embryonic stem cell-derived neurons.</a> Neuroscience Letters. 543, 95-100 (2013).</li><li>Surmeier, D. J., Obeso, J. A., Halliday, G. 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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Wir beschreiben ein langfristiges primäres ventrales mesenzephales (VM) Zellkultursystem zur hochinhaltigen Analyse der glutamatvermittelten Apoptose in Neuronen. Studien haben primäre mittelgehirne dopaminerge Kulturen verwendet, um exzitotoxische Mechanismen im Kontext der PD-Modelle11,12aufzuklären. In dieser Studie verwenden wir einen kombinatorischen Ansatz mit genetisch codierten Calciumindikatoren (GECIs), um die Ca2+-Aktivität zu messen und diese Aktivität weiter mit nachgelagerten molekularen Veränderungen zu verknüpfen, wie z. B. der Initiierung von apoptotischen Signalkaskaden4. Die Methode hat mehrere Vorteile gegenüber anderen ähnlichen Zellkultursystemen. Da wir ein besonderes Interesse an Exzitotoxizität im Zusammenhang mit der Parkinson-Krankheit haben, ist die Verwendung primärer VM-Zellkulturen ideal. Durch die Verwendung verschiedener Feldumsiedlungstechniken, wie z. B. gitterförmige Nupuslipsoder einer motorisierten XY-Mikroskopstufe in Kombination mit TH-Immunostainierung, können wir die zelltypspezifischen Wirkungen von Glutamat-vermittelter Apoptose in ventralen Mittelhirnneuronen direkt untersuchen. Darüber hinaus ermöglicht das 3-Wochen-Zellkulturmodell Neuronen, ihr volles, ausgereiftes molekulares Profil zu entwickeln, das erwachsene DA-Neuronenwiderspiegelt 9. Frühere Methoden konzentrierten sich hauptsächlich auf molekulare Veränderungen nach Glutamat-vermittelter Exzitotoxizität13,14. Das Modell ist einzigartig in seiner Fähigkeit, akute Veränderungen in der neuronalen Physiologie mit nachgelagerten molekularen Ereignissen in identifizierten Zelltypen zu korrelieren. Eine Einschränkung des primären Kulturmodells ist, dass die Seziertechnik das gesamte ventrale Mittelhirn erfasst, einschließlich DA und GABAergen Neuronen sowie Neuronen aus dem SNc und VTA. Es gibt nun Hinweise darauf, dass DA-Neuronen des SNc eine selektive Anfälligkeit für Kalzium und den letztendlichen Zelltod im Vergleich zu DA-Neuronen des benachbarten VTA15haben. Leider hat sich die Unterscheidung von SNc von VTA-Neuronen in embryonalen Kulturen mit wenigen anatomischen Landmarken als schwierig erwiesen, diese Strukturen im embryonalen Gehirn zu definieren.
Wir zeigen, dass die primäre Kulturtechnik die Quantifizierung heterogener spontaner Ca2+-Aktivität ermöglicht (Abbildung 1). Daher ist dies ein ideales Zellkultursystemmodell, um tonisch aktive Zellen zu studieren, wie z. B. perodierte Neuronen des Mittelhirns, neokortikale Neuronen und GABAerge Neuronen des suprachiasmatischen Kerns (SCN)16,17. In den meisten Anwendungen erreicht ca2+ Imaging nicht die gleiche zeitliche Auflösung wie die Elektrophysiologie. Daher ist es wahrscheinlich, dass ein einzelnes Ca2+-Ereignis analog zu einem Ausbruch neuronaler Aktionspotenziale ist. Dies kann so interpretiert werden, dass ca2+ Imaging relativ genaue Messungen der abnormalen Berstaktivität in Herzschrittmacherzellen ermöglicht und daher für einen hochgehaltigen Bildschirm des Ca2+-vermittelten exzitotoxischen Zelltodes geeignet ist.
Um spontane Ca2+-Aktivität zu erreichen und aufrechtzuerhalten, ist es wichtig, zwei Schlüsselpunkte im Protokoll zu behandeln. Zuerst ist die Beschichtungsdichte der Zellen nach der Zerlegung. Für primäre VM-Neuronen haben frühere Studien rund 100.000 Zellen/cm29,,10verwendet. Wir haben das Protokoll angepasst, um eine Dichte von 200.000Zellen/cm2zu verdichten, was einen heterogenen Bereich spontaner Aktivität erzeugt und die Anzahl der dopaminergen VM-Neuronen erhöht, die auf jedem Coverslip vorhanden sind. Da verschiedene Schrittmacher-Neuronen unterschiedliche Brenneigenschaften16aufweisen, muss die Beschichtungsdichte an den untersuchten und optimierten Zelltyp angepasst werden, um ein ideales Maß an spontaner Aktivität zu erreichen. Zweitens ist die Inkubationszeit nach einer Virusinfektion von AAVs. Wie die Beschichtungsdichte hängt dies vom spezifischen Kontext der Forschungsfrage und der Art der verwendeten AAV ab. Für die hier verwendete spezifische AAV sind 5 Tage Inkubation nach einer Virusinfektion ideal, um die gewünschten Proteinexpressionsniveaus zu erreichen, was dynamische Veränderungen der GCaMP-Fluoreszenz ermöglicht, um ca2+ Aktivität aufzuzeichnen. Viele Faktoren bestimmen, wie schnell und effizient ein AAV seine Ladung ausdrücken wird, von denen ein Großer außerhalb des Geltungsbereichs dieser Methode liegt, aber kurz gesagt, es ist wichtig, die Projektträgeraktivität und die Geschwindigkeit zu berücksichtigen, mit der das Ladungsprotein reift und faltet.
Ein weiterer Vorteil der Methode besteht darin, dass sie eine erhebliche Flexibilität bei Format, Expressionsvektoren, dem Einsatz von Bildgebungsgeräten und der Bandbreite der wissenschaftlichen Fragen ermöglicht, die angegangen werden können. Darüber hinaus ermöglicht die Methode die Untersuchung einer breiten Palette von spezifischen Fragen, die Glutamat-vermittelte Exzitotoxizität bei PD umgeben, und andere Modelle der Dysfunktion des Nervensystems. Zum Beispiel beinhaltet Glutamat-vermittelte Exzitotoxizität mehrere Rezeptoren und Signalkaskaden5. Durch die Anwendung der Methode und wie mit dem AMPAR-Blocker NBQX in Abbildung 1gezeigt, ist es möglich, bestimmte Komponenten der excitotoxischen Glutamatreaktion auf physiologischer und molekularer Ebene zu sezieren. Denkbar wäre, dass ein ähnlicher Ansatz mit Inhibitoren von zweiten Botensystemen verwendet werden könnte, um ihren Beitrag zur Exzitotoxizität zu bestimmen. Zusätzlich könnten die hier verwendeten AAVs angepasst werden, um GECIs mit zellspezifischen Promotoren oder AAV-ausgedrückten optogenetischen Sensoren auszudrücken, die verwendet werden könnten, um andere Parameter wie die Freisetzung von Neurotransmittern zu messen.
Abgesehen von primären embryonalen Sezieren und konfokalen Bildgebungen verwendet ein Großteil des Protokolls grundlegende Laborfertigkeiten, die keine spezielle Ausbildung erfordern. Daher umfassen die Einschränkungen des Modells die Schwierigkeit der embryonalen Zerlegungstechnik, die Dauer der Zeit, die die Zellen kultiviert werden müssen, um reife zu werden, und den Zugang zu einem konfokalen Mikroskop oder ähnlichen bildgebenden Geräten. Die vielen Vorteile und die Flexibilität der Methode überwiegen diese Einschränkungen, was dies zu einem idealen Modell macht, um die Rolle der Glutamat-vermittelten Exzitotoxizität bei Erkrankungen des Nervensystems zu untersuchen. Schließlich könnte dieses Modell ein effektives Werkzeug sein, um neuartige Verbindungen für anti-apoptotische Effekte und ihre Fähigkeit, DIE Gesundheit von DA Neuronen zu erhalten, zu überprüfen.

Parkinson-Krankheit (PD) ist die zweithäufigste neurodegenerative Erkrankung weltweit, ohne bekannte Heilung. Schätzungen gehen davon aus, dass die PD-Prävalenz weiter zunehmen wird und bis zum Jahr 2030 allein in den Vereinigten Staaten voraussichtlich 1 Million Diagnosen übersteigen wird1. Da derzeit nur wenige wirksame Behandlungen zur Bekämpfung von PD zur Verfügung stehen, besteht die dringende Notwendigkeit, wirksamere Therapien zu entwickeln. PD ist durch einen schnellen und fortschreitenden Verlust von Midbrain Dopamin (DA) Neuronengekennzeichnet 2. Die Mechanismen, die der Neurodegeneration bei PD zugrunde liegen, sind schlecht verstanden. Es gibt Hinweise auf eine wahrscheinliche Konvergenz mehrerer Mechanismen, wie oxidativen Stress und mitochondriale Dysfunktion, etc., die zur Einleitung von apoptotischen Signalkaskaden und schließlich Zelltodbeitragen 3.
Ein solcher konvergenter Mechanismus, Glutamat-vermittelte Exzitotoxizität, wurde in mehrere neurodegenerative Erkrankungen verwickelt, einschließlich PD4. Während Glutamat-vermittelte Exzitotoxizität vor allem durch Stimulation von NMDA-Rezeptoren über eine übermäßige Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration und schließlich die Einleitung von Apoptose funktioniert, wurden ca2+-permeable AMPA-Rezeptoren auch in das exzitotoxische Ansprechen5,6,7verwickelt. Daher ist es von Interesse, den Beitrag von AMPA-Rezeptoren zur Glutamat-vermittelten Apoptose innerhalb eines PD-Modells zu bestimmen. Dies kann mit NBQX, einem AMPA- und Kainate-Blocker, erreicht werden, der bei mikromolaren Konzentrationen für AMPA-Rezeptoren8selektiv ist. Glutamat-vermittelte Exzitotoxizität und apoptotische Signalkaskaden sind ein ideales nachgeschaltetes Ziel, um das Ausmaß des Zelltodes zu messen, und ein potenzielles Ziel für therapeutische Interventionen. Daher wäre die Entwicklung einer hochgehaltigen Methode zur Beurteilung der Glutamat-vermittelten Modulation der Calciumaktivität und der damit verbundenen nachgeschalteten Signalisierung in primären ventralen mesenzephalen (VM)-Neuronen wertvoll, um neuartige Behandlungsmethoden auf ihre Fähigkeit zur Erhaltung der neuronalen Gesundheit zu überprüfen.
Hier haben wir ein Protokoll entwickelt, in dem wir den genetisch kodierten Kalziumindikator (GECI), GCaMP6f, unter Verwendung von AAV2/5 mit dem humanen Synapsin (hSyn) Promotor ausdrücken, um die Ca2+-Aktivität von Maus-VM-Primärneuronen als Reaktion auf Dieglutamat-Anwendung zu messen, die auf physiologischer und molekularer Ebene gemessen werden kann. Dieses hochgehaltende Screening kann für die Entdeckung von Arzneimitteln oder Behandlungen angepasst werden, die die Ca2+-Aktivität modulieren, um die Gesundheit von VM-Neuronen zu erhalten. Wir schlagen vor, dass dieses primäre Kulturmodell eine effektive Möglichkeit ist, neuartige PD-Interventionen zu überprüfen, basierend auf ihrer Fähigkeit, die Gesundheit von VM-Neuronen zu erhalten und das Fortschreiten der PD zu mildern.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Formalin/PBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100496-506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X NA 0.3 water-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UMPLFLN10XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm circular cover glass No. 1</td>
			<td>Phenix Research Products</td>
			<td>MS20-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X NA 0.85 oil-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO20XO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm uncoated plastic cell culture dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X NA 0.3 water-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LUMPLFLN40XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X NA 1.35 oil-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO60XO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin (sodium)</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>A-301-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td>50x stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binolcular Microscope</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>KSCXTS-1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2), anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (DNase)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose, andydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RDD016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM + GlutaMAX medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10569010</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equine serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26050088</td>
			<td>heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Illuminator, 100V</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>KSC5410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System, PES 22UM 250ML</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28199-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoview 1000 confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoview 1200 confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-chicken Alexa Fluor 594</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-rabbit Alexa Fluor 594</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks-balanced Salt Solution (HBSS) 1x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14175095</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101170-478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeraCell 150 CO2 incubator</td>
			<td>Heraeus (ThermoFisher)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ v1.52e</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS-Fine Scissors (Round Type)-S/S Str/31*8mm/13cm</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S12014-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>K-120-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2), andydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPII Mini-Peristaltic Pump, 115/230 VAC, 50/60 Hz</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MULLER Micro Forceps-Str, 0.15mm Tips, 11cm</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11014-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBQX</td>
			<td>Hello Bio</td>
			<td>HB0443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (NGS)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin 2020</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>100837-AAV1</td>
			<td>Titer: 1.00E+13 gc/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington Biomedical Corporation</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010049</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl), anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head Tubing Pieces For MPII</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>55-4148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal anti-caspase-3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl), anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>BioXtra, &#8805;99.5% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-pregnant female C57BL/6 mice</td>
			<td>Texas A&#38;M Institue for Genomic Medicine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-bore blue pipette tips P1000</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83007-380</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying spontaneous ca2+ fluxes and their downstream effects in primary mouse midbrain neurons

Parkinson-Krankheit (PD) ist eine verheerende neurodegenerative Erkrankung, die durch die Degeneration von dopaminergen (DA) Neuronen verursacht wird. Übermäßiger Ca2+ Zustrom aufgrund der abnormalen Aktivierung von Glutamatrezeptoren führt zu DA-Exzitotoxizität und wurde als wichtiger Mechanismus für DEN Verlust von DA-Neuronen identifiziert. In dieser Studie isolieren, dissoziieren und kulturieren Midbrain Neuronen aus dem Maus ventralen Mesencephalon (VM) von ED14-Mausembryonen. Wir infizieren dann die langfristigen primären Maus-Mittelhirnkulturen mit einem Adeno-assoziierten Virus (AAV), das einen genetisch kodierten Kalziumindikator, GCaMP6f unter Kontrolle des menschlichen neuronspezifischen Synapsin-Promotors hSyn, ausdrückt. Mit Live konfokaler Bildgebung zeigen wir, dass kultivierte Maus-Mittelhirn-Neuronen spontane Ca2+-Flusse aufweisen, die von AAV-hSyn-GCaMP6f erkannt wurden. Die Anwendung von Glutamat auf Midhirnkulturen verursacht abnormale Erhöhungen in intrazellulären Ca2+ innerhalb von Neuronen und dies wird von der Caspase-3-Aktivierung in DA-Neuronen begleitet, wie durch Immunstainierung nachgewiesen wird. Die Techniken zur Identifizierung von Glutamat-vermittelter Apoptose in primären Maus-DA-Neuronen haben wichtige Anwendungen für das hochgehaltige Screening von Medikamenten, die die Gesundheit von DA-Neuronen erhalten.

Nach der anfänglichen Zellkultivierung behandelten wir VM-Kulturgerichte bei 14 DIV mit 1 L AAV hSyn-GCaMP6f und erlaubten 5 Tage virale Expression. Am Tag der Bildgebung wurde der HEPES-Aufzeichnungspuffer frisch vorbereitet. Wir haben zwei Bedingungen verwendet; in einer Bedingung wurde 20 m Glutamat für 10 min angewendet, während in der anderen Bedingung 5 min von 10 M NBQX Anwendung einer 10 min Co-Anwendung von 10 m NBQX + 20 M Glutamat vorausging. Unter beiden Bedingungen beobachteten wir heterogene und spontane Veränderungen der GCaMP6f-Fluoreszenz, die auf spontane Ca2+-Flusse hinweisen, wie in den repräsentativen Spuren gezeigt (Abbildung 1A,B, Supplemental Movie 1-2). Die Anwendung von 20 M Glutamat erzeugte eine robuste und nachhaltige Ca2+-Antwort sowohl in spontan aktiven als auch in stillen Neuronen (Abbildung 1A, Supplemental Movie 1). Die Anwendung von 10 M NBQX reduzierte die spontane Aktivität und blockierte teilweise die Glutamat-Antwort (Abbildung 1B, Supplemental Movie 2). Das Ausmaß, in dem die Glutamatanwendung eine Ca2+-Antwort in jeder Bedingung stimulierte, wurde anhand der Fläche unter der Kurve, der Spitzenamplitude und der Latenz quantifiziert, um zu reagieren. Beide Flächen unter der Kurve und Die Spitzenamplitude waren sowohl für glutamat als auch für NBQX + Glutamat behandelte Bedingungen ähnlich (Abbildung 1C), während die Latenz auf die Reaktion im NBQX + Glutamatzustand signifikant erhöht wurde (Abbildung 2A,B). Neben der Quantifizierung der Ca2+-Reaktion auf Glutamatbehandlungen haben wir Proben mit einem Anti-Caspase-3-Antikörper als Maß für die Glutamat-vermittelte Apoptose fixiert und gebeizt. Wir beobachteten eine Reihe von Caspase-3-Aktivierungen über die Bedingungen hinweg (Abbildung 3A,B). Die Caspase-3-Aktivierung wurde durch Messfläche und mittlere Caspase-3-Intensität quantifiziert. Im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen tendierte die durchschnittliche Zellfläche mit Caspase-3-Aktivierung unter Glutamat- und NBQX + Glutamat-Bedingungen zur Signifikanz (Abbildung 3B). Die mittlere Caspase-3-Intensität war bei den Glutamat- und NBQX + Glutamat-Bedingungen signifikant höher als bei unbehandelten Kontrollen (Abbildung 3B). Zusammen zeigen diese Ergebnisse einen hochgehaltigen Rahmen, in dem die Apoptose von Neuronen durch Quantifizierung von Ca2+-Antworten auf Exzitotoxische Wirkstoffe gemessen und anschließend mit einer Analyse nachgelagerter apoptotischer Ereignisse wie der Caspase-3-Aktivierung in denselben Kulturen verfolgt werden kann.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig01.jpg"> Abbildung 1: Kultivierte ventrale mesenzephale Neuronen zeigen spontane Ca2+-Aktivität und werden durch Glutamatanwendung robust stimuliert. (A) Repräsentative Spuren spontaner Ca2+-Aktivität in VM-Neuronen und deren Reaktion auf die Anwendung von 20 -M Glutamat. (B) Repräsentative Spuren der spontanen Ca2+-Aktivität in VM-Neuronen und deren Reaktion auf die Anwendung von 10 M NBQX + 20 M Glutamat. (C) Bevölkerungsdaten, die die Fläche unter der Kurve und die Spitzenamplitude von Ca2+-Spuren anzeigen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig02v3.jpg"> Abbildung 2: AMPAR-Blockade mit NBQX verzögert die Reaktion auf Glutamat-Anwendung in kultivierten ventralen mesenzephalen Neuronen. (A) Repräsentative Ca2+ Spuren von Glutamat (grau) und NBQX + Glutamat (blau) evozierten Reaktionen. Durchschnittliche Ca2+-Spuren von Glutamat (schwarz) und NBQX + Glutamat (rot) werden überlagert angezeigt. (B) Bevölkerungsdaten, die die Latenz auf die Reaktion auf Glutamat und NBQX + Glutamat evozierten Antworten zeigen. Prozentuale Veränderung zwischen Glutamat- und NBQX + Glutamat-Bedingungen wird im rechten Bereich angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig02v3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig03v3.jpg"> Abbildung 3: Die Glutamatanwendung erhöht die Caspase-3-Expression in Tyrosinhydroxylase (TH) positiven ventralen mesenzephalen Neuronen. (A) Repräsentative konfokale Bilder von VM-Kulturen immunostainiert für Caspase-3 (grün) und TH (rot), Skalenbalken = 10 m (B) Populationsdaten zeigen DA-Neuron-Bereich und mittleren Grauwert der Caspase-3-Expression in jeder Bedingung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig03v3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzender Film 1: Spontane Ca2+ Aktivität und Reaktion auf Glutamat-Anwendung. Spontane Ca2+-Flussmittel in Gegenwart eines HEPES-Aufnahmepuffers (0-300 s), gefolgt von der Anwendung von 20 M Glutamat (301-600 s). Skala Bar = 50 m. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61481/Supplementary_Movie%201_glutamate_ver_2.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Ergänzender Film 2: Spontane Ca2+ Aktivität und Reaktion auf NBQX + Glutamat Anwendung. Spontane Ca2+-Flussmittel in Gegenwart von HEPES-Aufnahmepuffer (0-300 s), gefolgt von der Anwendung von 10 M NBQX (301-600 s) und 10 M NBQX + 20 M Glutamat (601-900 s). Skala Bar = 50 m. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61481/Supplementary_Movie_2_NBQX_glut.avi" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>

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Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Hier stellen wir ein Protokoll zur Messung von in vitro Ca2+ Flussflüssen in Midbrain-Neuronen und deren nachgelagerten Auswirkungen auf Caspase-3 unter Verwendung primärer Maus-Midbrain-Kulturen vor. Dieses Modell kann verwendet werden, um pathophysiologische Veränderungen im Zusammenhang mit abnormalen Ca2+ Aktivität in Midbrain Neuronen zu studieren, und um neue Therapeutika für anti-apoptotische Eigenschaften zu überprüfen.

Quantifizierung von Spontan-Ca2+-Fluxes und ihren nachgelagerten Auswirkungen in primären Maus-Midbrain-Neuronen

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx ...

Dieses Protokoll quantifiziert Kalziumflüsse in dopaminergen Neuronen, die bei der Parkinson-Krankheit verloren gehen. Dies ist nützlich, um zu verstehen, wie abnormes Kalzium dopaminergen Neuronenverlust bei der Parkinson-Krankheit verursacht. Zum ersten Mal zeigen wir spontane Kalziumflüsse in kultivierten primären Midbrain-Neuronen.Diese Methode kann verwendet werden, um bestimmte Rezeptor-Beiträge zu sezieren, die an der Calcium-vermittelten Apoptose beteiligt sind. Unsere Methode bietet eine Möglichkeit für hochhaltige Arzneimittel-Screens, um spezifische und effektive neuroprotektive Verbindungen für die Parkinson-Krankheit zu entdecken. Diese neuroprotektive Verbindungen würden Kalzium-vermittelte Apoptose in dopaminergen Neuron verhindern.Beginnen Sie mit der Zubereitung eines Milliliters serumfreiem DMEM-Medium mit einem Mikroliter hSyn-GCaMP6f AAV pro Schale. Das Zellkulturmedium aus jedem Gericht ansaugen und durch einen Milliliter des vorbereiteten DMEM durch hSyn-GCaMP6f ersetzen. Legen Sie das Geschirr für eine Stunde wieder in den 37 Grad Celsius Brutkasten.Nach der Inkubation das Medium mit AAVs aspirieren und durch drei Milliliter Zellkulturmedium ersetzen. Die Gerichte fünf bis sieben Tage bei 37 Grad Celsius bebrüten. Wechseln des Mediums alle zwei bis drei Tage während dieser Periode der Virusinfektion.Bereiten Sie einen Liter des HEPES-Aufnahmepuffers, 200 Milliliter 20 Mikromollar-Glutamat-Aufzeichnungspuffer und 200 Milliliter 10 Mikromolar-NBQX-Aufnahmepuffer nach Manuskriptanweisungen vor. Füllen Sie eine sterile 35-Millimeter-Petrischale mit drei Millilitern des Aufnahmepuffers. Nehmen Sie die Petrischale mit den infizierten Kulturen aus dem Brutkasten, dann schnappen Sie sich vorsichtig die Kante eines Deckelschlupfes mit feinen Spitzenzangen und übertragen Sie sie mit dem Aufnahmepuffer in die Schale.Legen Sie den restlichen Deckelschlupf in Medium zurück in den 37 Grad Celsius Inkubator und transportieren Sie die Schale mit Aufnahmepuffer zum konfokalen Mikroskop. Starten Sie die Bildverarbeitungssoftware. Während der Initialisierung starten Sie die peristaltische Pumpe und platzieren Sie die Leitung in den Aufnahmepuffer.Dann kalibrieren Sie den Durchfluss auf zwei Milliliter pro Minute. Übertragen Sie den infizierten Deckelschlupf von der Petrischale in das Aufnahmebad mit feiner Zange. Mit dem 10X Wasser-Immersion-Objektiv und hellfeldlicht, finden Sie die Ebene des Fokus und suchen Sie nach einer Region mit einer hohen Dichte von Neuronen-Zellkörpern, dann wechseln Sie zum 40X-Objektiv und fokussieren Sie die Probe neu.Wählen Sie AlexaFluor 488 im Listenfenster Farbstoffe aus und wenden Sie es an. Um Überbelichtung und Photobleichung der Fluorophore zu verhindern, beginnen Sie mit niedrigen HV- und Laserleistungseinstellungen. Für den AlexaFluor 488 Kanal stellen Sie den HV auf 500, den Gewinn auf 1x und den Offset auf Null.Stellen Sie die Leistung für die 488-Laserlinie auf 5 % ein. Erhöhen Sie die Lochgröße auf 300 Mikrometer und verwenden Sie die Option Fokus x2-Scanning, um Emissionssignale optimal an die Subsättigung anzupassen. Die Einstellungen können dann für eine optimale Sichtbarkeit jedes Kanals angepasst werden.Sobald die Mikroskopeinstellungen optimiert sind, bewegen Sie die Bühne, um einen Bereich mit mehreren Zellen zu lokalisieren, die spontane Veränderungen in der GCaMP6f-Fluoreszenz anzeigen, und konzentrieren Sie sich auf die gewünschte Ebene für die Bildgebung. Verwenden Sie das Clip-Korrekturwerkzeug, um den Bildrahmen auf eine Größe zu beschneiden, die ein Frameintervall von knapp einer Sekunde erreichen kann. Legen Sie das Intervallfenster auf den Wert 1,0 und das Num-Fenster auf 600 fest.Um einen Film der T-Serie aufzunehmen, wählen Sie die Option Zeit aus, und verwenden Sie dann die Option Xyt-Scan, um mit der Bildgebung zu beginnen. Beobachten Sie die Bildfortschrittsleiste und verschieben Sie die Linie aus dem HEPES-Aufnahmepuffer zum entsprechenden Zeitpunkt in den 20 Mikromolaren-Glutamat-Aufzeichnungspuffer. Wenn die Bildgebung abgeschlossen ist, wählen Sie die Schaltfläche "Serie fertig" aus, und speichern Sie den fertigen T-Series-Film.Setzen Sie das Glutamat für weitere fünf Minuten fort, so dass die Kultur der Neuronen Glutamat für insgesamt 10 Minuten ausgesetzt wurden. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jeden Abdeckbeleg, der abgebildet werden soll. Es ist möglich, Kalziumspuren und neuronale Zellkörper unmittelbar nach dem Experiment zu sehen.Verwenden Sie das Ellipse-Tool, um die gewünschte Anzahl von ROIs um das neuronale Soma zu zeichnen. Und verwenden Sie die Schaltfläche Serienanalyse, um die Ablaufverfolgungen zu visualisieren. Nach der zusätzlichen fünfminütigen Exposition gegenüber Glutamat den Deckelschlupf mit feiner Zange aus dem Bad nehmen und mit dem Aufnahmepuffer wieder in die Petrischale legen, bis alle Bildgebung abgeschlossen ist.Am Tag der Bildgebung wurden die VM-Kulturen entweder mit Glutamat oder einer Kombination aus Glutamat und NBQX behandelt. Unter beiden Bedingungen wurden heterogene und spontane Veränderungen der GCaMP6f-Blütenstand beobachtet, die auf spontane Kalziumflüsse hindeuten. Die Anwendung von Glutamat erzeugte eine robuste und anhaltende Kalziumreaktion sowohl in spontan aktiven als auch in stillen Neuronen.Die Anwendung von NBQX reduzierte die spontane Aktivität und blockierte teilweise die Glutamatreaktion. Das Ausmaß, in dem die Glutamatanwendung eine Kalziumreaktion in jeder Erkrankung stimulierte, wurde anhand des Bereichs unter der Kurve, der Spitzenamplitude und der Latenz quantifiziert, um zu reagieren. Die Latenz auf die Reaktion nahm unter dem NBQX- und Glutamatzustand zu.Zur Messung der Glutamat-vermittelten Apoptose wurden die Zellen fixiert und mit einem Anti-Caspase-3-Antikörper befleckt. Die mittlere Caspase-3-Intensität war bei beiden Behandlungsbedingungen signifikant höher als bei unbehandelten Kontrollen. Eine gründlichere Analyse des angeregten toxischen Zelltodes kann durch Zählen der Anzahl der Immunstain-Tyrosin-Hydroxylase positive dopaminerge Neuronen in der Kontrolle und Glutamat behandelt Zustand durchgeführt werden.Diese Technik hat den Weg für das Verständnis der relativen Beiträge der verschiedenen Rezeptoren und Eisenkanäle an Kalzium-vermittelte Apoptose in dopaminergen Neuron beteiligt geebnet.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection und Primärkultur von embryonalen Maus-Hippocampus und kortikalen Neuronen

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Forschung

Neurowissenschaften

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

Imaging Receptor Insertion in die Plasmamembran pHluorin-Tag in der Grundschule Cultured Mäuseneuronen

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Calciumphosphat-Transfektion von primären Hippocampus-Neuronen

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Primärkultur von Maus dopaminergen Neuronen

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

Umwelt Modulationen der Anzahl der Mittelhirn Dopamin-Neuronen in erwachsenen Mäusen

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluoreszenz- und Biolumineszenz-Bildgebung subzellulärer Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Im Alter von Neuronen im Hippocampus

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modellierung von neuronalen Tod und Degeneration in Maus primären zerebelläre Granulat Neuronen

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Live-Bilder von GLUT4 Protein Menschenhandel Maus primäre hypothalamische Neurone mit Dekonvolution Mikroskopie

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Schnelle und spezifische Immunomagnetic Isolierung der Maus primären Oligodendrozyten

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualisierung von axonale Wachstum Kegel Zusammenbruch und frühe Amyloid β-Effekte in kultivierten Maus Neuronen

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...