Name: quantifying spontaneous ca2+ fluxes and their downstream effects in primary mouse midbrain neurons
Uploaded: 2020-09-09T14:00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons at JoVE.com

נתמך על ידי מענקים של האגודה האמריקאית למחלות פרקינסון (APDA) ו NIH R01NS15809-01 ל RS. אנו מודים טקסס A & M המכון לרפואה גנומית (TIGM) על מתן עכברים בהריון מתוזמן כדי ליצור תרבויות דופאמין ראשוני.

<ol>
	<li>Marras, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+Parkinson's+disease+across+North+America.">Prevalence of Parkinson's disease across North America.</a> NPJ Parkinson's Disease. 4, 21 (2018).</li><li>Poewe, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson+disease.">Parkinson disease.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013 (2017).</li><li>Mehta, A., Prabhakar, M., Kumar, P., Deshmukh, R., Sharma, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxicity:+bridge+to+various+triggers+in+neurodegenerative+disorders.">Excitotoxicity: bridge to various triggers in neurodegenerative disorders.</a> European Journal of Pharmacology. 698 (1-3), 6-18 (2013).</li><li>Ambrosi, G., Cerri, S., Blandini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+further+update+on+the+role+of+excitotoxicity+in+the+pathogenesis+of+Parkinson's+disease.">A further update on the role of excitotoxicity in the pathogenesis of Parkinson's disease.</a> Journal of Neural Transmission (Vienna). 121 (8), 849-859 (2014).</li><li>Dong, X. X., Wang, Y., Qin, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+excitotoxicity+and+their+relevance+to+pathogenesis+of+neurodegenerative+diseases.">Molecular mechanisms of excitotoxicity and their relevance to pathogenesis of neurodegenerative diseases.</a> Acta Pharmaceutica Sinica B. 30 (4), 379-387 (2009).</li><li>Vieira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxicity+through+Ca2+-permeable+AMPA+receptors+requires+Ca2+-dependent+JNK+activation.">Excitotoxicity through Ca2+-permeable AMPA receptors requires Ca2+-dependent JNK activation.</a> Neurobiology of Disease. 40 (3), 645-655 (2010).</li><li>Sebe, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)-Permeable+AMPARs+Mediate+Glutamatergic+Transmission+and+Excitotoxic+Damage+at+the+Hair+Cell+Ribbon+Synapse.">Ca(2+)-Permeable AMPARs Mediate Glutamatergic Transmission and Excitotoxic Damage at the Hair Cell Ribbon Synapse.</a> Journal of Neuroscience. 37 (25), 6162-6175 (2017).</li><li>Brickley, S. G., Farrant, M., Swanson, G. T., Cull-Candy, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNQX+increases+GABA-mediated+synaptic+transmission+in+the+cerebellum+by+an+AMPA/kainate+receptor-independent+mechanism.">CNQX increases GABA-mediated synaptic transmission in the cerebellum by an AMPA/kainate receptor-independent mechanism.</a> Neuropharmacology. 41 (6), 730-736 (2001).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smoking-Relevant+Nicotine+Concentration+Attenuates+the+Unfolded+Protein+Response+in+Dopaminergic+Neurons.">Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).</li><li>Henley, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+Identification+of+Living+Dopaminergic+Neurons+in+Midbrain+Cultures+Using+RNA+Sequencing+and+TH-promoter-driven+eGFP+Expression.">Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e54981 (2017).</li><li>Douhou, A., Troadec, J. D., Ruberg, M., Raisman-Vozari, R., Michel, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+promotion+of+mesencephalic+dopaminergic+neurons+by+depolarizing+concentrations+of+K++requires+concurrent+inactivation+of+NMDA+or+AMPA/kainate+receptors.">Survival promotion of mesencephalic dopaminergic neurons by depolarizing concentrations of K+ requires concurrent inactivation of NMDA or AMPA/kainate receptors.</a> Journal of Neurochemistry. 78 (1), 163-174 (2001).</li><li>Lavaur, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+noble+gas+xenon+provides+protection+and+trophic+stimulation+to+midbrain+dopamine+neurons.">The noble gas xenon provides protection and trophic stimulation to midbrain dopamine neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 142 (1), 14-28 (2017).</li><li>Kritis, A. A., Stamoula, E. G., Paniskaki, K. A., Vavilis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Researching+glutamate+-+induced+cytotoxicity+in+different+cell+lines:+a+comparative/collective+analysis/study.">Researching glutamate - induced cytotoxicity in different cell lines: a comparative/collective analysis/study.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 91 (2015).</li><li>Gupta, K., Hardingham, G. E., Chandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-dependent+glutamate+excitotoxicity+in+human+embryonic+stem+cell-derived+neurons.">NMDA receptor-dependent glutamate excitotoxicity in human embryonic stem cell-derived neurons.</a> Neuroscience Letters. 543, 95-100 (2013).</li><li>Surmeier, D. J., Obeso, J. A., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+neuronal+vulnerability+in+Parkinson+disease.">Selective neuronal vulnerability in Parkinson disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (2), 101-113 (2017).</li><li>Ramirez, J. M., Tryba, A. K., Pena, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacemaker+neurons+and+neuronal+networks:+an+integrative+view.">Pacemaker neurons and neuronal networks: an integrative view.</a> Current Opinion in Neurobiology. 14 (6), 665-674 (2004).</li><li>Guzman, J. N., Sanchez-Padilla, J., Chan, C. S., Surmeier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+pacemaking+in+substantia+nigra+dopaminergic+neurons.">Robust pacemaking in substantia nigra dopaminergic neurons.</a> Journal of Neuroscience. 29 (35), 11011-11019 (2009).</li></ol>

לסופרים אין מה לחשוף.

אנו מתארים מערכת תרבות תאי מאסנפפלית (VM) ראשית לטווח ארוך לניתוח תוכן גבוה של אפופטוזיס בתיווך גלוטמט בנוירונים. מחקרים העסיקו תרביות דופאמין המוח האמצעי העיקרי כדי להכליל מנגנונים excitotoxic בהקשר של מודלים PD11,12. במחקר זה, אנו משתמשים בגישה קומבינטורית באמצעות מחווני סידן מקודדים גנטית (GECIs) כדי למדוד פעילות Ca2+ ולשייך פעילות זו עם שינויים מולקולריים במורד הזרם, כגון חניכה של מפלים איתות אפופטוטי4. לשיטה יתרונות מרובים למערכות אחרות של תרבות תאים דומות. כפי שיש לנו עניין מיוחד ב-excitotoxicity בהקשר של מחלת פרקינסון, באמצעות תרביות תאי VM ראשי הוא אידיאלי. על ידי שימוש בטכניקות שונות רילוקיישן שדה, כגון כיסויים ממוסמרים או שלב מיקרוסקופ XY ממונע בשילוב עם TH immunostaining, אנחנו יכולים ישירות ללמוד את סוג התא השפעות ספציפיות של אפופטוזיס גלוטמט בתיווך גלוטמט בנוירונים אמצע המוח הגחוני. בנוסף, מודל תרבות התא 3 שבועות מאפשר נוירונים לפתח את הפרופיל המולקולרי המלא שלהם, בוגר, המשקף נוירונים DA למבוגרים9. שיטות קודמות התמקדו בעיקר בשינויים מולקולריים בעקבות excitotoxicity בתיווך גלוטמט13,14. המודל הוא ייחודי ביכולתו לתאם שינויים אקוטיים בפיזיולוגיה עצבית עם אירועים מולקולריים במורד הזרם בסוגי תאים מזוהים. מגבלה אחת של מודל התרבות העיקרית היא כי טכניקת הניתור לוכדת את המוח האמצעי הגחני כולו, כולל DA ו נוירונים GABAergic, כמו גם נוירונים SNc ו- VTA. ראיות עכשיו עולה כי נוירונים DA של SNc יש פגיעות סלקטיבית סידן ובסופו של דבר מוות תאים בהשוואה לנוירונים DA של VTAהשכן 15. למרבה הצער, בידול SNc מנויונים VTA בתרבויות עובריות הוכיח קשה עם כמה ציוני דרך אנטומיים כדי להגדיר מבנים אלה במוח העוברי.
אנו מדגימים כי טכניקת התרבות העיקרית מאפשרת לכמת פעילות הטרוגנית ספונטנית Ca2+ (איור 1). לכן, זהו מודל אידיאלי של מערכת תרבות התא ללמוד תאים פעילים tonically, כגון נוירונים דופאמין קצב של המוח האמצעי, נוירונים neocortical, נוירונים GABAergic של הגרעין suprachiasmatic (SCN)16,17. ברוב היישומים, Ca2+ הדמיה אינה משיגה את אותה רזולוציה זמנית כמו אלקטרופיזיולוגיה. לכן, סביר להניח כי אירוע Ca2+ יחיד מקביל פרץ של פוטנציאל פעולה עצבית. זה יכול להתפרש אומר כי Ca2+ הדמיה מאפשרת אמצעים מדויקים יחסית של פעילות מתפרצת חריגה בתאי pacemaking ולכן מתאים מסך תוכן גבוה של Ca2 +- מוותתאי excitotoxic בתיווך.
כדי להשיג ולתחזק פעילותספונטנית Ca 2+ , חשוב לטפל בשתי נקודות מפתח בפרוטוקול. הראשון הוא צפיפות הציפוי של התאים לאחר הקטף. עבור נוירונים VM העיקריים, מחקרים קודמים השתמשו סביב 100,000 תאים /ס"מ 29,10. התאמנו את הפרוטוקול כדי צלחת צפיפות של 200,000 תאים / ס"מ 2 , אשר יוצרמגווןהטרוגני של פעילות ספונטנית ומגדיל את מספר נוירונים VM דופאמין נוכח על כל כיסוי. מאז נוירונים קצב שונים יש מאפייניירי שונים 16, צפיפות הציפוי צריך להיות מותאם אישית לסוג התא נחקר אופטימיזציה על מנת להשיג רמות אידיאליות של פעילות ספונטנית. השני הוא זמן הדגירה בעקבות זיהום נגיפי של AAVs. כמו צפיפות ציפוי, זה יהיה תלוי בהקשר הספציפי של שאלת המחקר וסוג AAV בשימוש. עבור AAV ספציפי בשימוש כאן, 5 ימים של דגירה בעקבות זיהום נגיפי הוא אידיאלי כדי להשיג את רמות ביטוי החלבון הרצוי, המאפשר שינויים דינמיים בפלואורסציט GCaMP על מנת להקליט Ca2+ פעילות. גורמים רבים קובעים באיזו מהירות וביעילות AAV תבטא את המטען שלה, שרבים מהם נמצאים מחוץ לתחום השיטה הזו, אך בקצרה, חשוב לשקול את פעילות היזם ואת הקצב שבו חלבון המטען מתבגר ומתקפל.
יתרון נוסף של השיטה הוא שהיא מאפשרת גמישות ניכרת בפורמט, וקטורים ביטוי, שימוש בציוד הדמיה, ואת מגוון השאלות המדעיות שניתן לטפל. בנוסף, השיטה מאפשרת בירור במגוון רחב של שאלות ספציפיות המקיפות את ההתעוררות בתיווך גלוטמט ב-PD, ומודלים אחרים של תפקוד לקוי של מערכת העצבים. לדוגמה, excitotoxicity בתיווך גלוטמט כרוך קולטנים מרובים מפלים איתות5. על ידי שימוש בשיטה, כפי שהוכח עם חוסם AMPAR, NBQX באיור 1, ניתן לנתח רכיבים ספציפיים של תגובת גלוטמט excitotoxic ברמה פיזיולוגית ומולקולרית. סביר להניח, גישה דומה באמצעות מעכבים של מערכות שליח שני יכול לשמש כדי לקבוע את תרומתם לרגשות. בנוסף, AAVs בשימוש כאן יכול להיות מותאם לבטא GECIs עם יזמים ספציפיים לתא או חיישנים אופטוגנטיים AAV-הביע שיכול לשמש כדי למדוד פרמטרים אחרים כגון שחרור מוליך עצבי.
מלבד ניתוחים עובריים ראשוניים והדמיה קונקודית, חלק גדול מהפרוטוקול משתמש בכישורי מעבדה בסיסיים שלא דורשים הכשרה מיוחדת. לכן, המגבלות על המודל כוללות את הקושי של טכניקת הניתוח העוברי, משך הזמן שבו יש לתורבת את התאים כדי להגיע לבגרות, וגישה למיקרוסקופ קונפוקאלי, או לאביזר הדמיה דומה. היתרונות והגמישות הרבים של השיטה עולה על מגבלות אלה, מה שהופך את זה מודל אידיאלי ללמוד את התפקיד גלוטמט בתיווך excitotoxicity בהפרעות במערכת העצבים. לבסוף, מודל זה יכול להיות כלי יעיל כדי לסנן תרכובות רומן עבור אפקטים אנטי אפופטוטיים והיכולת שלהם לשמר את בריאות הנוירון DA.

מחלת פרקינסון (PD) היא ההפרעה ניווניות השני הנפוץ ביותר בעולם, ללא תרופה ידועה. ההערכות מצביעות על כך ששכיחות המשטרה תמשיך לגדול והיא צפויה לעלות על מיליון אבחנות עד שנת 2030 בארצות הברית בלבד1. עם מעט טיפולים יעילים הזמינים כיום למאבק ב-PD, יש צורך דחוף לפתח טיפולים יעילים יותר. PD מאופיין על ידי אובדן מהיר ומתקדם של דופמין באמצע המוח (DA) נוירונים2. המנגנונים שבסיס ניוון עצבי בPD מובנים היטב. הראיות מצביעות על התכנסות סבירה של מנגנונים מרובים, כגון סטרס חמצוני ותפקוד מיטוכונדריאלי, וכו 'שתורמים לחניכה של מפלים איתות אפופטוטי ובסופו שלדבר מוות תא 3.
מנגנון אחד כזה התכנסות, excitotoxicity בתיווך גלוטמט כבר מעורב במחלות ניווניות מרובות, כולל PD4. בעוד excitotoxicity בתיווך גלוטמט נחשב לעבוד בעיקר באמצעות גירוי של קולטני NMDA באמצעות עלייה מוגזמת בריכוז Ca2+ תאיים ובסופו של דבר חניכה של אפופטוזיס, Ca2+-קולטני AMPA חדיר גם היו מעורבים בתגובה excitotoxic5,6,7. לכן, זה עניין כדי לקבוע את התרומה של קולטני AMPA אפופטוזיס גלוטמט בתיווך בתוך מודל PD. זה יכול להיות מושגת באמצעות NBQX, אמפא וחוסם kainate, אשר בריכוזי micromolar הוא סלקטיבי עבור קולטני AMPA8. תסיסה מתווכת גלוטמט ומפלים איתות אפופטוטי הם יעד אידיאלי במורד הזרם כדי למדוד את היקף המוות של תאים, ותורמטרה פוטנציאלית להתערבות טיפולית. לכן, פיתוח שיטה בעלת תוכן גבוה להערכת אפנון בתיווך גלוטמט של פעילות סידן ואיתות במורד הזרם הראשוני mesencephalic (VM) נוירונים יהיה בעל ערך להקרנת שיטות טיפול חדשניות על יכולתם לשמור על בריאות עצבית.
כאן, פיתחנו פרוטוקול שבו אנו מבטאים את מחוון סידן מקודד גנטית (GECI), GCaMP6f, באמצעות AAV2/5 עם מקדם סינפסין אנושי (hSyn) כדי למדוד את פעילות Ca2+ של עכבר VM נוירונים ראשוניים בתגובה ליישום גלוטמט אשר ניתן למדוד ברמה הפיזיולוגית והמולקולרית. הקרנה זו תוכן גבוה יכול להיות מותאם לגילוי תרופות או טיפולים לווסת Ca2+ פעילות כדי לשמור על הבריאות של נוירונים VM. אנו מציעים כי מודל תרבות ראשוני זה היא דרך יעילה לסנן התערבויות PD רומן, בהתבסס על יכולתם לשמור על הבריאות של נוירונים VM ולצמצם את ההתקדמות של PD.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Formalin/PBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100496-506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X NA 0.3 water-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UMPLFLN10XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm circular cover glass No. 1</td>
			<td>Phenix Research Products</td>
			<td>MS20-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X NA 0.85 oil-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO20XO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm uncoated plastic cell culture dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X NA 0.3 water-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LUMPLFLN40XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X NA 1.35 oil-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO60XO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin (sodium)</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>A-301-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td>50x stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binolcular Microscope</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>KSCXTS-1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2), anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (DNase)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose, andydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RDD016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM + GlutaMAX medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10569010</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equine serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26050088</td>
			<td>heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Illuminator, 100V</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>KSC5410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System, PES 22UM 250ML</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28199-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoview 1000 confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoview 1200 confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-chicken Alexa Fluor 594</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-rabbit Alexa Fluor 594</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks-balanced Salt Solution (HBSS) 1x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14175095</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101170-478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeraCell 150 CO2 incubator</td>
			<td>Heraeus (ThermoFisher)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ v1.52e</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS-Fine Scissors (Round Type)-S/S Str/31*8mm/13cm</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S12014-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>K-120-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2), andydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPII Mini-Peristaltic Pump, 115/230 VAC, 50/60 Hz</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MULLER Micro Forceps-Str, 0.15mm Tips, 11cm</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11014-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBQX</td>
			<td>Hello Bio</td>
			<td>HB0443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (NGS)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin 2020</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>100837-AAV1</td>
			<td>Titer: 1.00E+13 gc/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington Biomedical Corporation</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010049</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl), anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head Tubing Pieces For MPII</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>55-4148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal anti-caspase-3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl), anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>BioXtra, &#8805;99.5% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-pregnant female C57BL/6 mice</td>
			<td>Texas A&#38;M Institue for Genomic Medicine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-bore blue pipette tips P1000</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83007-380</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying spontaneous ca2+ fluxes and their downstream effects in primary mouse midbrain neurons

מחלת פרקינסון (PD) היא הפרעה ניוונית הרסנית הנגרמת על ידי ניוון של נוירונים דופאמין (DA). זרם מוגזם Ca2+ בשל ההפעלה החריגה של קולטני גלוטמט תוצאות ב-DA excitotoxicity וזוהה כמנגנון חשוב לאובדן נוירון DA. במחקר זה, אנו לבודד, לנתק, ותרבות באמצע המוח נוירונים מן mesencephalon הגחוני העכבר (VM) של עוברי עכבר ED14. לאחר מכן אנו מדביקים את תרביות המוח האמצעי של העכבר הראשי לטווח ארוך עם וירוס אדנו הקשורים (AAV) המבטא מחוון סידן מקודד גנטית, GCaMP6f תחת שליטה של מקדם סינפסין ספציפי לנוירון האנושי, hSyn. באמצעות הדמיה נוחה חיה, אנו מראים כי נוירונים באמצע המוח של העכבר תרבות להציגספונטני Ca 2+ שטף שזוהה על ידי AAV-hSyn-GCaMP6f. יישום אמבטיה של גלוטמט לתרביות המוח האמצעי גורם לעלייה חריגה Ca2 תאיים בתוך נוירונים וזה מלווה בהפעלה caspase-3 בנוירונים DA, כפי שהוכח על ידי immunostaining. הטכניקות לזיהוי אפופטוזיס גלוטמט בתיווך בעכבר הראשי DA נוירונים יש יישומים חשובים עבור הקרנת תוכן גבוה של תרופות השמירה על בריאות הנוירון DA.

לאחר ההתפלה הראשונית של תאים, טיפלנו במנות תרבות VM ב 14 DIV עם 1 μL של AAV hSyn-GCaMP6f ואפשר 5 ימים של ביטוי ויראלי. ביום של הדמיה HEPES הקלטה היה מוכן טרי. השתמשנו בשני תנאים. בתנאי אחד 20 μM גלוטמט הוחל עבור 10 דקות, בעוד בתנאי השני 5 דקות של 10 μM יישום NBQX קדם 10 דקות שיתוף יישום של 10 μM NBQX + 20 μM גלוטמט. בשני התנאים, הבחנו בשינויים הטרוגניים וספונטניים בפלואורסץ GCaMP6f, המציינים שטף ספונטני Ca2+ , כפי שמתואר בעקבות הנציג(איור 1A, B, סרט משלים 1.2). יישום של גלוטמט 20 μM יצר תגובה חזקה ומתמשכות Ca2+ הן באופן ספונטני פעיל וlyescent נוירונים(איור 1A, סרט משלים 1). יישום של 10 μM NBQX מופחת פעילות ספונטנית, וחסם חלקית את התגובהגלוטמט (איור 1B, תוספת סרט 2). המידה שבה יישום גלוטמט עורר תגובה Ca2+ בכל תנאי היה לכמת באמצעות אזור מתחת לעקומה, משרעת שיא, וההשתה להגיב. שני האזורים מתחת לעקומה ומשרעת שיא היו דומים הן גלוטמט NBQX + גלוטמט שטופלו תנאים(איור 1C),בעוד ההשתיה לתגובה גדל באופן משמעותי במצב NBQX + גלוטמט (איור 2A,B). בנוסף לכמת את התגובה Ca2+ לטיפול גלוטמט, תיקנו ומוכתמים דגימות עם נוגדן נגד קפסה-3 כמדד של אפופטוזיס בתיווך גלוטמט. ראינו טווח של הפעלה caspase-3 על פני התנאים(איור 3A,B). הפעלת Caspase-3 היה לכמת על ידי מדידת אזור ועוצמת caspase-3 אומר. בהשוואה לתאי בקרה לא מטופלים, האזור הממוצע של תאים עם הפעלה caspase-3 תחת גלוטמט ו NBQX + תנאי גלוטמט במגמה לקראת משמעות(איור 3B). עוצמת הקספס-3 הייתה גבוהה משמעותית בתנאי גלוטמט ו-NBQX + גלוטמט בהשוואה לפקדים לא מטופלים(איור 3B). יחד, תוצאות אלה מדגימות מסגרת תוכן גבוהה שבה אפופטוזיס של נוירונים ניתן למדוד על ידי כימות Ca2+ תגובות לסוכנים excitotoxic ואחריו עם ניתוח של אירועים אפופטוטיים במורד הזרם כגון הפעלה caspase-3 באותה קבוצה של תרבויות.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig01.jpg"> איור 1: נוירונים מאסנפפליים גנוניים תרבותיים מציגים פעילות ספונטנית Ca2+ והם מגורה בחוזקה על ידי יישום גלוטמט. (א)עקבות מייצג של פעילות ספונטנית Ca2+ בנוירונים VM ותגובתם 20 μM גלוטמט יישום. (ב)נציג עקבות של פעילות ספונטנית Ca2+ בנוירונים VM ותגובתם 10 μM NBQX + 20 μM יישום גלוטמט. (ג)נתוני אוכלוסין המציגים אזור מתחת לעקומה ומשרעת שיא של Ca2+ עקבות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig02v3.jpg"> איור 2: מצור AMPAR עם NBQX מעכב את התגובה ליישום גלוטמט בנוירונים מאסנפפליים גקויים תרבותיים. (A)נציג Ca2+ עקבות של גלוטמט (אפור) ו NBQX + גלוטמט (כחול) עורר תגובות. ממוצע Ca2+ עקבות של גלוטמט (שחור) ו NBQX + גלוטמט (אדום) מוצגים overlaid. (ב)נתוני אוכלוסייה המציגים ההיהיה לתגובה עבור גלוטמט ו- NBQX + גלוטמט עוררו תגובות. שינוי אחוזים בין גלוטמט ו-NBQX + תנאי גלוטמט מוצג בחלונית הימנית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig02v3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig03v3.jpg"> איור 3: יישום גלוטמט מגביר את הביטוי caspase-3 טירוסין hydroxylase (TH) נוירונים מאסנפפליים גחונים חיוביים. (א)תמונות קונפוקליות מייצגות של תרבויות VM מחוסנות עבור caspase-3 (ירוק) ו- TH (אדום), סרגל קנה מידה = 10 μm. (ב)נתוני אוכלוסין המציגים אזור DA neuron וערך אפור ממוצע של ביטוי caspase-3 בכל תנאי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig03v3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
סרט משלים 1: פעילות ספונטנית Ca2+ ותגובה ליישום גלוטמט. ספונטני Ca2+ שטף בנוכחות מאגר הקלטה HEPES (0-300 s) ואחריו יישום של 20 μM גלוטמט (301-600 s). סרגל קנה מידה = 50 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61481/Supplementary_Movie%201_glutamate_ver_2.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.</a>
סרט משלים 2: פעילות ספונטנית Ca2+ ותגובה NBQX + יישום גלוטמט. שטףספונטני Ca 2+ בנוכחות מאגר הקלטה HEPES (0-300 s) ואחריו יישום של 10 μM NBQX (301-600 s), ו 10 μM NBQX + 20 μM גלוטמט (601-900 s). סרגל קנה מידה = 50 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61481/Supplementary_Movie_2_NBQX_glut.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons at JoVE.com

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי למדוד במבחנה Ca2+ שטף בנוירונים המוח האמצעי ואת ההשפעות שלהם במורד הזרם על caspase-3 באמצעות תרביות המוח האמצעי של העכבר הראשי. מודל זה יכול להיות מועסק כדי ללמוד שינויים פתופיזיולוגיים הקשורים פעילות Ca2+ חריגה בנוירונים המוח האמצעי, ולסנן טיפולים רומן עבור תכונות אנטי אפופטוטיות.

כימות ספונטני Ca2+ שטף ואת ההשפעות במורד הזרם שלהם בעכבר ראשי נוירונים המוח האמצעי

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx ...

פרוטוקול זה מכמת שטפי סידן בנוירונים דופאמין, אשר הולכים לאיבוד במחלת פרקינסון. זה שימושי להבנת איך סידן חריג גורם אובדן נוירון דופאמין במחלת פרקינסון. בפעם הראשונה, אנו מדגימים שטפי סידן ספונטניים בנוירונים ראשוניים מתורבתים.שיטה זו יכולה לשמש כדי לנתח תרומות קולטן ספציפי מעורב אפופטוזיס מתווך סידן. השיטה שלנו מספקת שדרה למסכי תרופות בעלי תוכן גבוה כדי לגלות תרכובות נוירו-הגנה ספציפיות ויעילות למחלת פרקינסון. תרכובות נוירו-פרוטקטיביות אלה ימנעו אפופטוזיס מתווך סידן בנוירון דופאמין.התחל בהכנת מיליליטר אחד של מדיום DMEM ללא סרום עם מיקרוליטר אחד של hSyn-GCaMP6f AAV למנה. שאפו את מדיום תרבות התאים מכל מנה והחליפו אותו במיליליטר אחד של ה- DMEM המוכן עם hSyn-GCaMP6f. מניחים את הכלים בחזרה לתוך החממה 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.לאחר הדגירה, שאפו את המדיום עם AAVs והחלפו אותו בשלושה מיליליטר של מדיום תרבות התא. הדגירה את הכלים ב 37 מעלות צלזיוס במשך חמישה עד שבעה ימים. שינוי המדיום כל יומיים עד שלושה ימים לאורך תקופה זו של זיהום ויראלי.הכן ליטר אחד של מאגר ההקלטות HEPES, 200 מיליליטר של מאגר הקלטת גלוטמט מיקרומולר 20, ו 200 מיליליטר של 10 מאגר הקלטה micromolar NBQX על פי הוראות כתב היד. מלאו צלחת פטרי סטרילית של 35 מ"מ בשלושה מיליליטר של חיץ ההקלטה. קח את צלחת פטרי עם תרבויות נגועות מן החממה, ואז בזהירות לתפוס את הקצה של להחליק כיסוי אחד עם מטסות קצה בסדר ולהעביר אותו לתוך המנה עם חיץ ההקלטה.מניחים את החלקת הכיסוי הנותרת במדיום בחזרה לתוך החממה 37 מעלות צלזיוס ולהעביר את המנה עם חיץ הקלטה למיקרוסקופ confocal. הפעל את תוכנת ההדמיה. בעת האתחול, הפעל את המשאבה הראשונית והצב את הקו במאגר ההקלטה.ואז לכייל את הזרימה לשני מיליליטר לדקה. מעבירים את החלקת הכיסוי הנגועה מצלחת פטרי לאמבט ההקלטה עם מדפים עדין. באמצעות המטרה טבילת מים 10X ואור שדה בהיר, למצוא את מישור המיקוד ולחפש אזור עם צפיפות גבוהה של גופי תא נוירון, ולאחר מכן לעבור למטרה 40X ולמקד מחדש את המדגם.בחר והחל את AlexaFluor 488 בחלון הרשימה צבעים. על מנת למנוע תפוקת יתר והלבנת תמונות של הפלואורופורים, התחל עם הגדרות כוח HV ולייזר נמוכות. עבור ערוץ AlexaFluor 488, הגדר את ה- HV ל- 500, את הרווח ל- 1x ואת ההיסט לאפס.הגדר את העוצמה ל- 5% עבור קו הלייזר 488. הגדל את גודל חור הסיכה ל- 300 מיקרומטרים ושתמש באפשרות הסריקה של המוקד x2 כדי להתאים באופן מיטבי אותות פליטה לרמות תת-תאורציה. לאחר מכן ניתן להתאים את ההגדרות לנראות אופטימלית של כל ערוץ.לאחר אופטימיזציה של הגדרות המיקרוסקופ, הזיזו את הבמה לאיתור אזור עם תאים מרובים המציגים שינויים ספונטניים בנורסצנטיות GCaMP6f והתמקדו במישור הרצוי להדמיה. השתמש בכלי תיקון קליפ כדי לגזור את מסגרת ההדמיה לגודל שיכול להשיג מרווח מסגרת של קצת פחות משנייה אחת. הגדר את חלון המרווח לערך של 1.0 ואת החלון Num ל- 600.כדי ללכוד סרט מסדרת T, בחר באפשרות שעה ולאחר מכן השתמש באפשרות סריקת Xyt כדי להתחיל בהדמיה. צפה בר התקדמות ההדמיה והזז את הקו ממאגר ההקלטות של HEPES למאגר ההקלטות של 20 מיקרומולאר גלוטמט בנקודת הזמן המתאימה. לאחר השלמת ההדמיה, בחר את לחצן סיום הסדרה ושמור את הסרט המוגמר של סדרת T.המשך לבלבל את גלוטמט במשך חמש דקות נוספות, כך התרבות של נוירונים נחשפו גלוטמט במשך סך של 10 דקות. חזור על תהליך זה כדי שכל שובר כריכה ידמיין. ניתן לראות עקבות סידן וגופי תאים עצביים מיד לאחר הניסוי.השתמש בכלי אליפסה כדי לצייר את המספר הרצוי של ROIs סביב soma עצבי. ולהשתמש בלחצן ניתוח סדרה כדי לדמיין את העקבות. לאחר החשיפה הנוספים של חמש דקות לגלוטמט, מוציאים את החלקת הכיסוי מהאמבטיה עם מדפים עדיפים וממקמינים אותה בחזרה לצלחת פטרי עם חיץ ההקלטה עד שכל ההדמיה הושלמה.ביום ההדמיה, תרבות ה-VM טופלו עם גלוטמט או שילוב של גלוטמט ו- NBQX. בשני התנאים נצפו שינויים הטרוגניים וספונטניים בפלורזנס GCaMP6f המצביעים על שטפי סידן ספונטניים. יישום גלוטמט יצר תגובת סידן חזקה ומתמשכת הן בנוירונים פעילים באופן ספונטני והן בנוירונים הרהוי.היישום של NBQX הפחית את הפעילות הספונטנית, וחסם חלקית את תגובת הגלוטמט. המידה שבה יישום גלוטמט עורר תגובת סידן בכל תנאי היה מכומת באמצעות האזור מתחת לעקומה, משרעת שיא, ו latency להגיב. ההשהיה לתגובה גדלה תחת מצב NBQX וגלוטמט.כדי למדוד אפופטוזיס מתווך גלוטמט, התאים היו קבועים מוכתמים בנוגדן נגד קפסה-3. עוצמת הקספסה-3 הממוצעת הייתה גבוהה משמעותית בשני תנאי הטיפול בהשוואה לפקדים לא מטופלים. ניתוח יסודי יותר של מוות תאים רעילים נרגש יכול להיעשות על ידי ספירת מספר immunostain טירוסין הידרוקסילאז נוירונים דופאמין חיובי בשליטה ומצב גלוטמט מטופל.טכניקה זו סללה את הדרך להבנת התרומות היחסיות של קולטנים שונים וערוצי ברזל המעורבים באפופטוזיס מתווך סידן בנוירון דופאמין.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection ותרבות ראשונית של נוירונים בהיפוקמפוס עכבר עובריים קליפתיים

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

הדמית pHluorin-תויגה הכנסת קולט לממברנה הפלזמה בנוירונים עכבר מתורבתים ראשיים

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

סידן פוספט Transfection של ראשוני נוירונים בהיפוקמפוס

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

יסודי תרבות של עכבר דופאמין נוירונים

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

אפנון סביבתי של מספר המוח התיכון דופמין נוירונים בעכברים בוגרים

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

הקרינה ופליטת אור הדמיה של Ca subcellular<sup&gt; 2 +</sup&gt; בבני נוירונים בהיפוקמפוס

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

מידול מוות עצביים והתנוונות בנוירונים גרגר אסטרוציטומה העיקרי העכבר

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

תמונות בשידור חי של GLUT4 חלבון בבני אדם העכבר נוירונים היפותלמי העיקרי באמצעות מיקרוסקופ Deconvolution

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

בידוד Immunomagnetic מהירה, מדויקת של העכבר הראשי oligodendrocytes להפוך

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Effects in Cultured Mouse Neurons

להמחיש התמוטטות חרוט הצמיחה עצב ואפקטים β עמילואיד מוקדם בנוירונים תרבותי. העכבר

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...