Name: quantifying spontaneous ca2+ fluxes and their downstream effects in primary mouse midbrain neurons
Uploaded: 2020-09-09T14:00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons at JoVE.com

Supportato da sovvenzioni dell'American Parkinson Disease Association (APDA) e del NIH R01NS115809-01 alla RS. Ringraziamo il Texas A&M Institute for Genomic Medicine (TIGM) per aver fornito topi in gravidanza a tempo per generare colture dopaminergiche primarie.

<ol>
	<li>Marras, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+Parkinson's+disease+across+North+America.">Prevalence of Parkinson's disease across North America.</a> NPJ Parkinson's Disease. 4, 21 (2018).</li><li>Poewe, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson+disease.">Parkinson disease.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013 (2017).</li><li>Mehta, A., Prabhakar, M., Kumar, P., Deshmukh, R., Sharma, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxicity:+bridge+to+various+triggers+in+neurodegenerative+disorders.">Excitotoxicity: bridge to various triggers in neurodegenerative disorders.</a> European Journal of Pharmacology. 698 (1-3), 6-18 (2013).</li><li>Ambrosi, G., Cerri, S., Blandini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+further+update+on+the+role+of+excitotoxicity+in+the+pathogenesis+of+Parkinson's+disease.">A further update on the role of excitotoxicity in the pathogenesis of Parkinson's disease.</a> Journal of Neural Transmission (Vienna). 121 (8), 849-859 (2014).</li><li>Dong, X. X., Wang, Y., Qin, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+excitotoxicity+and+their+relevance+to+pathogenesis+of+neurodegenerative+diseases.">Molecular mechanisms of excitotoxicity and their relevance to pathogenesis of neurodegenerative diseases.</a> Acta Pharmaceutica Sinica B. 30 (4), 379-387 (2009).</li><li>Vieira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxicity+through+Ca2+-permeable+AMPA+receptors+requires+Ca2+-dependent+JNK+activation.">Excitotoxicity through Ca2+-permeable AMPA receptors requires Ca2+-dependent JNK activation.</a> Neurobiology of Disease. 40 (3), 645-655 (2010).</li><li>Sebe, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)-Permeable+AMPARs+Mediate+Glutamatergic+Transmission+and+Excitotoxic+Damage+at+the+Hair+Cell+Ribbon+Synapse.">Ca(2+)-Permeable AMPARs Mediate Glutamatergic Transmission and Excitotoxic Damage at the Hair Cell Ribbon Synapse.</a> Journal of Neuroscience. 37 (25), 6162-6175 (2017).</li><li>Brickley, S. G., Farrant, M., Swanson, G. T., Cull-Candy, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNQX+increases+GABA-mediated+synaptic+transmission+in+the+cerebellum+by+an+AMPA/kainate+receptor-independent+mechanism.">CNQX increases GABA-mediated synaptic transmission in the cerebellum by an AMPA/kainate receptor-independent mechanism.</a> Neuropharmacology. 41 (6), 730-736 (2001).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smoking-Relevant+Nicotine+Concentration+Attenuates+the+Unfolded+Protein+Response+in+Dopaminergic+Neurons.">Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).</li><li>Henley, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+Identification+of+Living+Dopaminergic+Neurons+in+Midbrain+Cultures+Using+RNA+Sequencing+and+TH-promoter-driven+eGFP+Expression.">Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e54981 (2017).</li><li>Douhou, A., Troadec, J. D., Ruberg, M., Raisman-Vozari, R., Michel, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+promotion+of+mesencephalic+dopaminergic+neurons+by+depolarizing+concentrations+of+K++requires+concurrent+inactivation+of+NMDA+or+AMPA/kainate+receptors.">Survival promotion of mesencephalic dopaminergic neurons by depolarizing concentrations of K+ requires concurrent inactivation of NMDA or AMPA/kainate receptors.</a> Journal of Neurochemistry. 78 (1), 163-174 (2001).</li><li>Lavaur, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+noble+gas+xenon+provides+protection+and+trophic+stimulation+to+midbrain+dopamine+neurons.">The noble gas xenon provides protection and trophic stimulation to midbrain dopamine neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 142 (1), 14-28 (2017).</li><li>Kritis, A. A., Stamoula, E. G., Paniskaki, K. A., Vavilis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Researching+glutamate+-+induced+cytotoxicity+in+different+cell+lines:+a+comparative/collective+analysis/study.">Researching glutamate - induced cytotoxicity in different cell lines: a comparative/collective analysis/study.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 91 (2015).</li><li>Gupta, K., Hardingham, G. E., Chandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-dependent+glutamate+excitotoxicity+in+human+embryonic+stem+cell-derived+neurons.">NMDA receptor-dependent glutamate excitotoxicity in human embryonic stem cell-derived neurons.</a> Neuroscience Letters. 543, 95-100 (2013).</li><li>Surmeier, D. J., Obeso, J. A., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+neuronal+vulnerability+in+Parkinson+disease.">Selective neuronal vulnerability in Parkinson disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (2), 101-113 (2017).</li><li>Ramirez, J. M., Tryba, A. K., Pena, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacemaker+neurons+and+neuronal+networks:+an+integrative+view.">Pacemaker neurons and neuronal networks: an integrative view.</a> Current Opinion in Neurobiology. 14 (6), 665-674 (2004).</li><li>Guzman, J. N., Sanchez-Padilla, J., Chan, C. S., Surmeier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+pacemaking+in+substantia+nigra+dopaminergic+neurons.">Robust pacemaking in substantia nigra dopaminergic neurons.</a> Journal of Neuroscience. 29 (35), 11011-11019 (2009).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Descriviamo un sistema di coltura cellulare ventrale primaria a lungo termine (VM) per l'analisi ad alto contenuto dell'apoptosi mediata dal glutammato nei neuroni. Gli studi hanno impiegato colture dopaminergiche midbrain primarie per chiarire i meccanismi eccitatotossici nel contesto dei modelli PD11,12. In questo studio, impieghiamo un approccio combinatorio utilizzando indicatori di calcio codificati geneticamente (GECI) per misurarel'attività di Ca 2 e associare ulteriormente questa attività ai cambiamenti molecolari a valle, come l'avvio di cascate di segnalazione apoptotica4. Il metodo presenta molteplici vantaggi rispetto ad altri sistemi di coltura cellulare simili. Poiché abbiamo un particolare interesse per l'eccitatotossicità nel contesto del morbo di Parkinson, l'uso di colture cellulari VM primarie è l'ideale. Utilizzando diverse tecniche di rilocazione del campo, come i puntini di copertura grigliati o uno stadio di microscopio XY motorizzato combinato con l'immunostaining TH, possiamo studiare direttamente gli effetti specifici del tipo di cellula dell'apoptosi mediata dal glutammato nei neuroni midbrain ventrali. Inoltre, il modello di coltura cellulare di 3 settimane consente ai neuroni di sviluppare il loro profilo molecolare completo e maturo, riflettendo i neuroni DAadulti 9. I metodi precedenti si sono concentrati principalmente sui cambiamenti molecolari a seguito dell'ecitototossicità mediata dal glutammato13,14. Il modello è unico nella sua capacità di correlare i cambiamenti acuti nella fisiologia neuronale con gli eventi molecolari a valle nei tipi di cellule identificati. Una limitazione del modello di coltura primaria è che la tecnica di dissezione cattura l'intero midbrain ventrale, compresi i neuroni DA e GABAergic così come i neuroni dalla SNc e VTA. Le prove suggeriscono ora che i neuroni DA della SNc hanno vulnerabilità selettiva al calcio e alla morte delle cellule rispetto ai neuroni DA della vicina VTA15. Sfortunatamente, differenziare la SNc dai neuroni VTA nelle colture embrionali si è dimostrata difficile con pochi punti di riferimento anatomici per definire queste strutture nel cervello embrionale.
Dimostriamo che la tecnica di coltura primaria consente la quantificazione dell'attività spontanea eterogenea di Ca2 (Figura 1). Pertanto, questo è un modello di sistema di coltura cellulare ideale per studiare le cellule tonicamente attive, come i neuroni dopaminergici che making del midbrain, neuroni neocorticali, e neuroni GABaergic del nucleo soprachiasmatico (SCN)16,17. Nella maggior parte delle applicazioni,l'imaging Ca 2 non raggiunge la stessa risoluzione temporale dell'elettrofisiologia. Pertanto, è probabile che un singolo evento Ca2 è analogo a una raffica di potenziali di azione neuronale. Questo può essere interpretato nel modo in cuil'imaging Ca 2 consente misure relativamente accurate dell'attività di scoppio anormale nelle cellule di pace ed è quindi appropriato per uno schermo ad alto contenuto della morte delle cellule eccitate mediate ca2.
Per realizzare e mantenerel'attività spontanea di Ca 2, è importante affrontare due punti chiave del protocollo. Il primo è la densità di placcatura delle cellule dopo la dissezione. Per i neuroni primari della macchina virtuale, studi precedenti hanno utilizzato circa 100.000cellule/cm 29,10. Abbiamo adattato il protocollo per placcare una densità di 200.000 cellule/cm2, che crea una gamma eterogenea di attività spontanea e aumenta il numero di neuroni VM dopaminergici presenti su ogni coperture. Poiché diversi neuroni del pacemaking hanno proprietà di cotturadistinte 16, la densità di placcatura deve essere personalizzata in base al tipo di cellula studiata e ottimizzata al fine di raggiungere livelli ideali di attività spontanea. Il secondo è il tempo di incubazione dopo l'infezione virale degli AAV. Come la densità di placcatura, questo dipenderà dal contesto specifico della domanda di ricerca e dal tipo di AAV in uso. Per l'AAV specifico utilizzato qui, 5 giorni di incubazione a seguito di infezione virale è ideale per raggiungere i livelli di espressione proteica desiderati, che consente cambiamenti dinamici nella fluorescenza GCaMP al fine di registrare l'attività di Ca2. Molti fattori determinano quanto rapidamente ed efficientemente un AAV esprimerà il suo carico, gran parte dei quali è al di fuori dell'ambito di questo metodo, ma brevemente, è importante considerare l'attività del promotore e la velocità con cui la proteina del carico matura e si piega.
Un altro vantaggio del metodo è che consente una notevole flessibilità nel formato, nei vettori di espressione, nell'uso di apparecchiature di imaging e nella gamma di domande scientifiche che possono essere affrontate. Inoltre, il metodo consente di indagare su una vasta gamma di domande specifiche che circondano l'eccitactotossicità mediata dal glutammato nella PD e altri modelli di disfunzione del sistema nervoso. Ad esempio, l'ecitotossicità mediata dal glutammato coinvolge più recettori e cascate di segnalazione5. Utilizzando il metodo, e come dimostrato con il blocco AMPAR, NBQX in Figura 1, è possibile sezionare componenti specifici della risposta del glutammato excitotossico a livello fisiologico e molecolare. In teoria, un approccio simile utilizzando inibitori dei sistemi di secondo messaggero potrebbe essere utilizzato per determinare il loro contributo all'eccitatossicità. Inoltre, gli AV utilizzati qui potrebbero essere adattati per esprimere i GECI con promotori specifici delle cellule o sensori optogenetici espressi da AAV che potrebbero essere utilizzati per misurare altri parametri come il rilascio di neurotrasmettitori.
Oltre alle dissezioni embrionali primarie e all'imaging confocale, gran parte del protocollo utilizza competenze di laboratorio di base che non richiedono una formazione specializzata. Pertanto, i limiti al modello includono la difficoltà della tecnica di dissezione embrionale, il periodo di tempo in cui le cellule devono essere colturate per raggiungere la maturità e l'accesso a un microscopio confocale, o a un apparato di imaging simile. I numerosi vantaggi e la flessibilità del metodo superano queste limitazioni, rendendo questo un modello ideale per studiare il ruolo di evitotossicità mediata dal glutammato nei disturbi del sistema nervoso. Infine, questo modello potrebbe essere uno strumento efficace per lo screening di nuovi composti per gli effetti anti-apoptotici e la loro capacità di preservare la salute dei neuroni DA.

Il morbo di Parkinson (PD) è il secondo disturbo neurodegenerativo più comune al mondo, senza una cura nota. Le stime suggeriscono che la prevalenza della PD continuerà ad aumentare e si prevede che supererà 1 milione di diagnosi entro il 2030 solo negli Stati Uniti1. Con pochi trattamenti efficaci attualmente disponibili per combattere la PD, c'è una pressante necessità di sviluppare terapie più efficaci. PD è caratterizzato da una rapida e progressiva perdita di neuroni dopamina midbrain (DA)2. I meccanismi che sono alla base della neurodegenerazione nella PD sono poco compresi. Le prove suggeriscono una probabile convergenza di più meccanismi, come lo stress ossidativo e la disfunzione mitocondriale, ecc. che contribuiscono all'avvio di cascate di segnalazione apoptotica e alla morte finaledelle cellule 3.
Uno di questi meccanismi convergenti, l'ecitotossicità mediata dal glutammato è stato implicato in molteplici malattie neurodegenerative, tra cui PD4. Mentre si pensa che l'ecitotossicità mediata dal glutammato funzioni principalmente attraverso la stimolazione dei recettori NMDA attraverso un aumento eccessivo della concentrazione intracellulare di Ca2 e l'eventuale inizio dell'apoptosi, anche i recettori AMPA permeabili ca2sono stati implicati nella risposta excitotossica5,6,7. Pertanto, è interessante determinare il contributo dei recettori AMPA all'apoptosi mediata dal glutammato all'interno di un modello PD. Questo può essere ottenuto utilizzando NBQX, un AMPA e kainate blocker, che a concentrazioni di micromolari è selettivo per i recettori AMPA8. L'ecitotossicità mediata dal glutammato e le cascate di segnalazione apoptotica sono un bersaglio a valle ideale per misurare l'entità della morte cellulare e un potenziale obiettivo per l'intervento terapeutico. Pertanto, lo sviluppo di un metodo ad alto contenuto per valutare la modulazione mediata dal glutammato dell'attività del calcio e la segnalazione a valle associata nei neuroni mesencephalici ventrali (VM) primari sarebbe utile per lo screening di nuovi metodi di trattamento sulla loro capacità di preservare la salute neuronale.
Qui, abbiamo sviluppato un protocollo in cui esprimiamo l'indicatore di calcio geneticamente codificato (GECI), GCaMP6f, utilizzando AAV2/5 con la promotore della sinasi umana (hSyn) per misurarel'attività Ca 2 dei neuroni primari della VM del topo in risposta all'applicazione del glutammato che può essere misurata a livello fisiologico e molecolare. Questo screening ad alto contenuto può essere adattato per scoprire prodotti farmaceutici o trattamenti che modulano l'attività di Ca2 per preservare la salute dei neuroni vm. Proponiamo che questo modello di coltura primaria sia un modo efficace per controllare nuovi interventi pd, in base alla loro capacità di preservare la salute dei neuroni VM e mitigare la progressione della PD.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Formalin/PBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100496-506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X NA 0.3 water-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UMPLFLN10XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm circular cover glass No. 1</td>
			<td>Phenix Research Products</td>
			<td>MS20-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X NA 0.85 oil-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO20XO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm uncoated plastic cell culture dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X NA 0.3 water-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LUMPLFLN40XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X NA 1.35 oil-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO60XO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin (sodium)</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>A-301-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td>50x stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binolcular Microscope</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>KSCXTS-1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2), anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (DNase)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose, andydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RDD016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM + GlutaMAX medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10569010</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equine serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26050088</td>
			<td>heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Illuminator, 100V</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>KSC5410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System, PES 22UM 250ML</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28199-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoview 1000 confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoview 1200 confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-chicken Alexa Fluor 594</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-rabbit Alexa Fluor 594</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks-balanced Salt Solution (HBSS) 1x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14175095</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101170-478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeraCell 150 CO2 incubator</td>
			<td>Heraeus (ThermoFisher)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ v1.52e</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS-Fine Scissors (Round Type)-S/S Str/31*8mm/13cm</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S12014-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>K-120-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2), andydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPII Mini-Peristaltic Pump, 115/230 VAC, 50/60 Hz</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MULLER Micro Forceps-Str, 0.15mm Tips, 11cm</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11014-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBQX</td>
			<td>Hello Bio</td>
			<td>HB0443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (NGS)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin 2020</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>100837-AAV1</td>
			<td>Titer: 1.00E+13 gc/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington Biomedical Corporation</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010049</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl), anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head Tubing Pieces For MPII</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>55-4148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal anti-caspase-3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl), anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>BioXtra, &#8805;99.5% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-pregnant female C57BL/6 mice</td>
			<td>Texas A&#38;M Institue for Genomic Medicine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-bore blue pipette tips P1000</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83007-380</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying spontaneous ca2+ fluxes and their downstream effects in primary mouse midbrain neurons

Il morbo di Parkinson (PD) è un disturbo neurodegenerativo devastante causato dalla degenerazione dei neuroni dopaminergici (DA). L'eccessivo afflusso di Ca2 a causa dell'attivazione anomala dei recettori del glutammato si traduce in accitotossicità DA ed è stato identificato come un importante meccanismo per la perdita di neurone DA. In questo studio, isoliamo, dissociamo e coltura i neuroni midbrain dal mesencephalon ventrale del topo (VM) degli embrioni di topo ED14. Infettamo quindi le colture midbrain del topo primario a lungo termine con un virus associato all'adeno (AAV) che esprime un indicatore di calcio geneticamente codificato, GCaMP6f sotto il controllo del promotore di sinapsin specifico del neurone umano, hSyn. Utilizzando l'imaging confocale dal vivo, mostriamo che i neuroni midbrain murini di topo se nerici colturati mostrano iflussimenti spontanei di Ca 2 e rilevati da AAV-hSyn-GCaMP6f. L'applicazione del bagno di glutammato a colture midbrain provoca elevazioni anomale nella Ca2 all'interno dei neuroni e questo è accompagnato dall'attivazione del caspase-3 nei neuroni DA, come dimostrato dall'immunosostenimento. Le tecniche per identificare l'apoptosi mediata dal glutammato nei neuroni DA del topo primario hanno importanti applicazioni per lo screening ad alto contenuto di farmaci che preservano la salute dei neuroni DA.

Dopo la coltura iniziale delle cellule, abbiamo trattato i piatti di coltura VM a 14 DIV con 1 L di AAV hSyn-GCaMP6f e abbiamo permesso 5 giorni di espressione virale. Il giorno dell'imaging hePES buffer di registrazione è stato preparato fresco. Abbiamo usato due condizioni; in una condizione 20 glutammato M è stato applicato per 10 min, mentre nell'altra condizione 5 min di 10 NBQX applicazione ha preceduto una co-applicazione di 10 min di 10 M NBQX . In entrambe le condizioni, abbiamo osservato cambiamenti eterogenei e spontanei nella fluorescenza GCaMP6f, che indicano i fluxs spontanei di Ca2, come mostrato nelle tracce rappresentative (Figura 1A,B, Supplemental Movie 1-2). L'applicazione di un glutammato da 20 M ha generato una risposta Ca2 e robusta sia nei neuroni spontaneamente attivi che in quiescenti (Figura 1A, Supplemental Movie 1). L'applicazione di 10 NBQX ha ridotto l'attività spontanea e ha parzialmente bloccato la risposta del glutammato (Figura 1B, Supplemental Movie 2). La misura in cui l'applicazione del glutammato ha stimolato una risposta Ca2 in ogni condizione è stata quantificata utilizzando l'area sotto la curva, l'ampiezza di picco e la latenza per rispondere. Entrambe le area sotto la curva e l'ampiezza di picco erano simili sia per il glutammato che per NBQX , le condizioni trattate con glutammato (Figura 1C), mentre la latenza di risposta è stata notevolmente aumentata nella condizione NBQX - glutammato (Figura 2A,B). Oltre a quantificare la risposta ca2 al trattamento del glutammato, abbiamo fissato e macchiato campioni con un anticorpo anti-caspase-3 come misura dell'apoptosi mediata dal glutammato. È stata osservata una serie di attivazione di caspase-3 nelle condizioni (Figura 3A,B). L'attivazione di Caspase-3 è stata quantificata dall'area di misurazione e dall'intensità media della caspase-3. Rispetto alle celle di controllo non trattate, l'area media delle cellule con attivazione caspase-3 in condizioni di glutammato e NBQX - glutammato tendeva verso la significatività (Figura 3B). L'intensità media del caspase-3 è stata significativamente più elevata nelle condizioni di glutammato e NBQX - glutammato rispetto ai controlli non trattati (Figura 3B). Insieme, questi risultati dimostrano un quadro ad alto contenuto in cui l'apoptosi dei neuroni può essere misurata quantificando le risposte di Ca2 o più agli agenti eccitati e seguita da un'analisi degli eventi apoptotici a valle come l'attivazione della caspase-3 nello stesso insieme di culture.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig01.jpg"> Figura 1: I neuroni mesencephalici ventrali serenigraficicoltura mostrano un'attività spontanea di Ca 2 e sono stimolati in modo robusto dall'applicazione del glutammato. (A) Tracce rappresentative dell'attività spontanea di Ca2 e della loro risposta all'applicazione di 20 M Glutamate. (B) Tracce rappresentative dell'attività spontanea di Ca2 nei neuroni VM e la loro risposta all'applicazione 10 NBQX da 20 M. (C) Dati della popolazione che mostrano l'area sotto la curva e l'ampiezza di picco delle tracce di Ca2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig01large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig02v3.jpg"> Figura 2: Blocco AMPAR con NBQX ritarda la risposta all'applicazione glutammato nei neuroni mesencephalici ventrali colturati. (A) Le tracce del rappresentante Ca2 e dei glutammato (grigio) e NBQX - glutammato (blu) evocavano le risposte. Le tracce medie di Ca2 di glutammato (nero) e NBQX - glutammato (rosso) sono mostrate sovrapposte. (B) I dati sulla popolazione che mostrano la latenza di risposta per il glutammato e NBQX - glutammato evocavano risposte. Nel pannello di destra viene visualizzata la variazione percentuale tra glutammato e NBQX e condizioni di glutammato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig02v3large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig03v3.jpg"> Figura 3: L'applicazione glutammato aumenta l'espressione di caspase-3 nei neuroni mesencephalici ventrali positivi della tirosina (TH). (A) Immagini confocali rappresentative delle culture VM immunostained per caspase-3 (verde) e TH (rosso), barra della scala - 10 m. ( B ) Datidi popolazioneche mostrano l'area del neurone DA e il valore di grigio medio dell'espressione caspase-3 in ogni condizione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig03v3large.jpg" target="_blank">Si prega di fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Filmato supplementare 1: Attività spontanea di Ca2 e risposta all'applicazione del glutammato. Flussispontanei di ca 2 in presenza di buffer di registrazione HEPES (0-300 s) seguiti dall'applicazione di 20 glutammato di M (301-600 s). Barra della scala di 50 m. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61481/Supplementary_Movie%201_glutamate_ver_2.avi" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo video.</a>
Filmato supplementare 2: Attività spontanea di Ca2 e risposta all'applicazione NBQX - glutammato. Flussispontanei di ca 2 in presenza di buffer di registrazione HEPES (0-300 s) seguiti dall'applicazione di 10 SM NBQX (301-600 s) e 10 NBQX (20 s) (601-900 s). Barra della scala di 50 m. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61481/Supplementary_Movie_2_NBQX_glut.avi" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo video.</a>

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Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Qui presentiamo un protocollo per misurare i flussi in vitro di Ca2 nei neuroni midbrain e i loro effetti a valle sulla caspase-3 utilizzando colture midbrain topo primario. Questo modello può essere utilizzato per studiare i cambiamenti patofsiologici legati all'attività anormale di Ca2 nei neuroni midbrain e per lo screening di nuove terapie per le proprietà anti-apoptotiche.

Quantificare i flussispontanei di Ca 2 e i loro effetti a valle nei neuroni Midbrain del topo primario

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx ...

Questo protocollo quantifica i flussi di calcio nei neuroni dopaminergici, che si perdono nel morbo di Parkinson. Questo è utile per capire come il calcio anomalo causa la perdita di neuroni dopaminergici nel morbo di Parkinson. Per la prima volta, dimostriamo flussi spontanei di calcio nei neuroni del midbrain primario coltivato.Questo metodo può essere utilizzato per sezionare specifici contributi del recettore coinvolti nell'apoptosi mediata dal calcio. Il nostro metodo fornisce una strada per schermi di farmaci ad alto contenuto per scoprire composti neuroprotettivi specifici ed efficaci per il morbo di Parkinson. Questi composti neuroprotettivi prevenirebbero l'apoptosi mediata dal calcio nei neuroni dopaminergici.Inizia preparando un millilitro di mezzo DMEM senza siero con un microlitro di hSyn-GCaMP6f AAV per piatto. Aspirare il mezzo di coltura cellulare da ogni piatto e sostituirlo con un millilitro del DMEM preparato con hSyn-GCaMP6f. Riposizionare i piatti nell'incubatore di 37 gradi Celsius per un'ora.Dopo l'incubazione, aspirare il mezzo con AAV e sostituirlo con tre millilitri di mezzo di coltura cellulare. Incubare i piatti a 37 gradi Celsius per cinque o sette giorni. Cambiare il mezzo ogni due o tre giorni durante questo periodo di infezione virale.Preparare un litro del buffer di registrazione HEPES, 200 millilitri di 20 buffer di registrazione del glutammato micromolare e 200 millilitri di tampone di registrazione NBQX micromolare secondo le indicazioni del manoscritto. Riempire una piastra di Petri sterile da 35 millimetri con tre millilitri del tampone di registrazione. Prendere la piastra di Petri con le colture infette dall'incubatrice, quindi afferrare attentamente il bordo di un coperchio scivolare con forcep di punta fine e trasferirlo nella piastra con il tampone di registrazione.Riposizionare il coperchio rimanente in mezzo nell'incubatore di 37 gradi Celsius e trasportare il piatto con tampone di registrazione al microscopio confocale. Avviare il software di imaging. Durante l'inizializzazione, avviare la pompa peristaltica e posizionare la linea nel buffer di registrazione.Quindi calibrare il flusso a due millilitri al minuto. Trasferire il coperchio infetto dalla piastra di Petri al bagno di registrazione con forcep fini. Utilizzando l'obiettivo di immersione dell'acqua 10X e la luce del campo luminoso, trova il piano di messa a fuoco e cerca una regione con un'alta densità di corpi cellulari neuronali, quindi passa all'obiettivo 40X e rifocalizza il campione.Selezionare e applicare AlexaFluor 488 nella finestra dell'elenco Coloranti. Al fine di prevenire la sovraesposizione e lo sbiancamento fotografico dei fluorofori, iniziare con basse impostazioni di potenza HV e laser. Per il canale AlexaFluor 488, impostare l'HV su 500, il guadagno su 1x e l'offset su zero.Impostare la potenza sul 5% per la linea laser 488. Aumentare le dimensioni del foro stenopeica a 300 micrometri e utilizzare l'opzione di scansione focus x2 per regolare in modo ottimale i segnali di emissione ai livelli di subsaturazione. Le impostazioni possono quindi essere regolate per una visibilità ottimale di ogni canale.Una volta ottimizzate le impostazioni del microscopio, spostare lo stadio per localizzare una regione con più cellule che mostrano cambiamenti spontanei nella fluorescenza GCaMP6f e concentrarsi sul piano desiderato per l'imaging. Utilizzate lo strumento Clip rect per ritagliare il fotogramma di imaging a una dimensione che può ottenere un intervallo di fotogrammi di poco inferiore a un secondo. Impostare la finestra intervallo su un valore pari a 1,0 e la finestra Num su 600.Per acquisire un filmato della serie T, selezionate l'opzione Tempo (Time), quindi usate l'opzione di scansione Xyt per iniziare l'imaging. Guarda la barra di stato dell'imaging e sposta la linea dal buffer di registrazione HEPES nel buffer di registrazione del glutammato micromolare 20 nel momento appropriato. Al termine dell'imaging, selezionare il pulsante di creazione della serie e salvare il filmato finito della serie T.Continuare a perfondere il glutammato per altri cinque minuti in modo che la coltura dei neuroni sia stata esposta al glutammato per un totale di 10 minuti. Ripetere questo processo per l'immagine di ogni slittamento di copertina. È possibile visualizzare tracce di calcio e corpi cellulari neuronali immediatamente dopo l'esperimento.Utilizzare lo strumento Ellisse per disegnare il numero desiderato di ROM attorno al soma neuronale. E utilizzare il pulsante Analisi serie per visualizzare le tracce. Dopo l'esposizione aggiuntiva di cinque minuti al glutammato, rimuovere la scivolata di copertura dal bagno con forcep fini e riposizionare nella piastra di Petri con il buffer di registrazione fino al completamento di tutte le immagini.Il giorno dell'imaging, le colture di macchine virtuale sono state trattate con glutammato o una combinazione di glutammato e NBQX. In entrambe le condizioni, sono stati osservati cambiamenti eterogenei e spontanei nella florescenza GCaMP6f che indicano flussi spontanei di calcio. L'applicazione del glutammato ha generato una risposta al calcio robusta e sostenuta sia nei neuroni spontaneamente attivi che in quello quiescente.L'applicazione di NBQX ha ridotto l'attività spontanea e parzialmente bloccato la risposta del glutammato. La misura in cui l'applicazione del glutammato stimolava una risposta al calcio in ogni condizione è stata quantificata usando l'area sotto la curva, l'ampiezza del picco e la latenza per rispondere. La latenza alla risposta è aumentata sotto la condizione NBQX e glutammato.Per misurare l'apoptosi mediata dal glutammato, le cellule sono state fissate e macchiate con un anticorpo anti-Caspasi-3. L'intensità media della caspasi-3 era significativamente più alta in entrambe le condizioni di trattamento rispetto ai controlli non trattati. Un'analisi più approfondita della morte eccitata delle cellule tossiche può essere fatta contando il numero di neuroni dopaminergici positivi all'immunostain tirosina idrossilasi in controllo e condizione trattata con glutammato.Questa tecnica ha spianato la strada alla comprensione dei contributi relativi di diversi recettori e canali di ferro coinvolti nell'apoptosi mediata dal calcio nel neurone dopaminergico.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

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Ricerca

Neuroscienze

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