Name: quantifying spontaneous ca2+ fluxes and their downstream effects in primary mouse midbrain neurons
Uploaded: 2020-09-09T14:00:00
Duration: 6 min 54 s
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米国パーキンソン病協会(APDA)とNIH R01NS115809-01からRSへの助成金によってサポートされています。テキサスA&Mゲノム医学研究所(TIGM)は、原発性ドーパミン作動性培養を生み出すタイミングの高い妊娠中のマウスを提供してくれたことに感謝します。

<ol>
	<li>Marras, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+Parkinson's+disease+across+North+America.">Prevalence of Parkinson's disease across North America.</a> NPJ Parkinson's Disease. 4, 21 (2018).</li><li>Poewe, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson+disease.">Parkinson disease.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013 (2017).</li><li>Mehta, A., Prabhakar, M., Kumar, P., Deshmukh, R., Sharma, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxicity:+bridge+to+various+triggers+in+neurodegenerative+disorders.">Excitotoxicity: bridge to various triggers in neurodegenerative disorders.</a> European Journal of Pharmacology. 698 (1-3), 6-18 (2013).</li><li>Ambrosi, G., Cerri, S., Blandini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+further+update+on+the+role+of+excitotoxicity+in+the+pathogenesis+of+Parkinson's+disease.">A further update on the role of excitotoxicity in the pathogenesis of Parkinson's disease.</a> Journal of Neural Transmission (Vienna). 121 (8), 849-859 (2014).</li><li>Dong, X. X., Wang, Y., Qin, Z. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+Identification+of+Living+Dopaminergic+Neurons+in+Midbrain+Cultures+Using+RNA+Sequencing+and+TH-promoter-driven+eGFP+Expression.">Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e54981 (2017).</li><li>Douhou, A., Troadec, J. D., Ruberg, M., Raisman-Vozari, R., Michel, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+promotion+of+mesencephalic+dopaminergic+neurons+by+depolarizing+concentrations+of+K++requires+concurrent+inactivation+of+NMDA+or+AMPA/kainate+receptors.">Survival promotion of mesencephalic dopaminergic neurons by depolarizing concentrations of K+ requires concurrent inactivation of NMDA or AMPA/kainate receptors.</a> Journal of Neurochemistry. 78 (1), 163-174 (2001).</li><li>Lavaur, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+noble+gas+xenon+provides+protection+and+trophic+stimulation+to+midbrain+dopamine+neurons.">The noble gas xenon provides protection and trophic stimulation to midbrain dopamine neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 142 (1), 14-28 (2017).</li><li>Kritis, A. A., Stamoula, E. G., Paniskaki, K. A., Vavilis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Researching+glutamate+-+induced+cytotoxicity+in+different+cell+lines:+a+comparative/collective+analysis/study.">Researching glutamate - induced cytotoxicity in different cell lines: a comparative/collective analysis/study.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 91 (2015).</li><li>Gupta, K., Hardingham, G. E., Chandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-dependent+glutamate+excitotoxicity+in+human+embryonic+stem+cell-derived+neurons.">NMDA receptor-dependent glutamate excitotoxicity in human embryonic stem cell-derived neurons.</a> Neuroscience Letters. 543, 95-100 (2013).</li><li>Surmeier, D. J., Obeso, J. A., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+neuronal+vulnerability+in+Parkinson+disease.">Selective neuronal vulnerability in Parkinson disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (2), 101-113 (2017).</li><li>Ramirez, J. M., Tryba, A. K., Pena, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacemaker+neurons+and+neuronal+networks:+an+integrative+view.">Pacemaker neurons and neuronal networks: an integrative view.</a> Current Opinion in Neurobiology. 14 (6), 665-674 (2004).</li><li>Guzman, J. N., Sanchez-Padilla, J., Chan, C. S., Surmeier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+pacemaking+in+substantia+nigra+dopaminergic+neurons.">Robust pacemaking in substantia nigra dopaminergic neurons.</a> Journal of Neuroscience. 29 (35), 11011-11019 (2009).</li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

ニューロンにおけるグルタミン酸媒介アポトーシスの高含有解析のための長期一次腹側中脳症(VM)細胞培養システムについて述べた。研究は、PDモデル11、12,の文脈で興奮性メカニズムを解明するために主要な中脳ドーパミン作動性培養を採用している。本研究では、遺伝的にコード化されたカルシウム指標(GECI)を用いた組み合わせアプローチを用いてCa2+活性を測定し、さらにこの活性をアポトーシスシグナル伝達カスケードの開始などの下流分子変化と関連付ける。この方法は、他の類似した細胞培養系に対して複数の利点を有する。パーキンソン病の文脈における興奮毒性に特に関心を持っているため、一次VM細胞培養を使用することが理想的である。グリッド付きカバースリップやTH免疫染色と組み合わせた電動XY顕微鏡ステージなど、異なるフィールド再配置技術を用いることで、腹側中脳ニューロンにおけるグルタミン酸媒介アポトーシスの細胞型特異的効果を直接研究することができます。さらに、3週間の細胞培養モデルは、ニューロンが成人DAニューロン9を反映して、完全で成熟した分子プロファイルを開発することを可能にする。以前の方法は、主にグルタミン酸媒介性興奮毒性13,14,14に続く分子変化に焦点を当ててきた。このモデルは、神経生理学の急性変化と同定された細胞タイプの下流の分子事象を関連付ける能力においてユニークである。一次培養モデルの1つの制限は、解剖技術が、DAおよびGABAergicニューロンならびにSNcおよびVTAのニューロンを含む腹側中脳全体を捕捉することです。SNcのDAニューロンは、隣接するVTA15のDAニューロンと比較して、カルシウムおよび最終的な細胞死に対する選択的脆弱性を有することを示唆する証拠がある。残念ながら、胚培養中のVTAニューロンからSNcを分化することは、胚性脳内でこれらの構造を定義する解剖学的ランドマークがほとんどないことが証明されています。
我々は、一次培養技術が異種自発的なCa2+活性の定量化を可能にすることを実証する(図1)。したがって、これは、中脳のペース形成ドーパミン作動性ニューロン、新皮質ニューロン、および、二重化核(SCN)16,17のGABAergicニューロンなどの、細胞間でのペース形成などの細胞を調べるための17理想的な細胞培養系モデルである。ほとんどのアプリケーションでは、Ca2+イメージングは電気生理学と同じ時間的分解能を達成しません。したがって、単一のCa2+イベントは、ニューロン作用電位のバーストに類似している可能性が高い。これは、Ca2+イメージングがペースメイキング細胞における異常な破裂活性の比較的正確な尺度を可能にし、したがってCa2+-媒介した興奮性細胞死の高い含有量スクリーンに適していることを意味すると解釈することができる。
自発的なCa2+ 活性を達成し維持するためには、プロトコルの2つの重要なポイントに対処することが重要です。第1は、解剖後の細胞のめっき密度である。プライマリ VM ニューロンの場合、これまでの研究では、約 100,000 個のセル/cm29,10を使用しています。我々は、自発的な活動の異種の範囲を作成し、各カバースリップに存在するドーパミン作動性VMニューロンの数を増加させる200,000細胞/cm2の密度をプレートするプロトコルを適応させました。異なるペースメイキングニューロンは、異なる発火特性16を有するので、メッキ密度は、自発的な活動の理想的なレベルを達成するために研究され、最適化されている細胞の種類に合わせてカスタマイズする必要があります。第二は、AAVのウイルス感染後の潜伏時間である。めっき密度と同様に、これは使用されているAAVの研究問題とタイプの特定の文脈に依存する。ここで用いられる特定のAAVについては、ウイルス感染後の5日間のインキュベーションが所望のタンパク質発現レベルを達成するのに理想的であり、これはCa2+ 活性を記録するためにGCaMP蛍光の動的変化を可能にする。多くの要因は、AAVがその貨物をどれだけ迅速かつ効率的に表現するかを決定しますが、その多くは、この方法の範囲外ですが、簡単に言えば、プロモーター活性と貨物タンパク質が成熟し、折り畳む速度を考慮することが重要です。
この方法のもう1つの利点は、フォーマット、発現ベクター、イメージング機器の使用、および対処可能な科学的な質問の範囲においてかなりの柔軟性を可能にすることです。さらに、この方法は、PDにおけるグルタミン酸媒介性興奮毒性、および神経系機能不全の他のモデルを取り巻く広範な特定の質問に関する調査を可能にする。例えば、グルタミン酸媒介性興奮毒性は、複数の受容体およびシグナル伝達カスケード5を伴う。この方法を用いることによって、 図1のAMPARブロッカー、NBQXと共に示したように、興奮性グルタミン酸反応の特定の成分を生理学的および分子レベルで解剖することができる。おそらく、第二のメッセンジャーシステムの阻害剤を使用して同様のアプローチを使用して、興奮毒性へのそれらの寄与を決定することができる。さらに、ここで使用されるAAVは、細胞特異的プロモーターまたは神経伝達物質放出などの他のパラメータを測定するために使用できるAAV発現光遺伝学的センサーを備えたGECIを発現するように適応することができる。
一次胚分節と共焦点イメージングとは別に、プロトコルの多くは専門的な訓練を必要としない基本的な実験室のスキルを使用しています。したがって、モデルの限界は、胚解離技術の難しさ、成熟に達するまで細胞を培養しなければならない時間の長さ、および共焦点顕微鏡、または同様の画像化装置へのアクセスを含む。この方法の多くの利点と柔軟性がこれらの制限を上回り、神経系障害におけるグルタミン酸媒介性興奮毒性の役割を研究するための理想的なモデルとなる。最後に、このモデルは、抗アポトーシス効果とDAニューロンの健康を維持する能力のための新しい化合物をスクリーニングするための効果的なツールとなり得る。

パーキンソン病(PD)は、世界的に2番目に一般的な神経変性疾患であり、治療法は知られていない。推定によると、PDの有病率は増加し続け、米国だけで2030年までに100万件を超えると予測されている。PDと戦うために現在利用可能な効果的な治療法はほとんどないので、より効果的な治療法を開発する必要があります。PDは、中脳ドーパミン(DA)ニューロン2の急速かつ進行性の損失によって特徴付けられる。PDの神経変性の根本となるメカニズムは十分に理解されていない。証拠は、アポトーシスシグナル伝達カスケードおよび最終的な細胞死の開始に寄与する酸化ストレスやミトコンドリア機能不全などの複数のメカニズムの収束の可能性を示唆している3。
このような収束機構の1つは、グルタミン酸媒介性興奮毒性がPD4を含む複数の神経変性疾患に関与している。グルタミン酸媒介性興奮毒性は、主に細胞内Ca2+濃度の過剰増加および最終的なアポトーシスの開始を介したNMDA受容体の刺激によって働くことと考えられているが、Ca2+-透過性AMPA受容体もまた、興奮性反応55、6、76,7に関与している。したがって、PDモデル内のグルタミン酸媒介アポトーシスに対するAMPA受容体の寄与を決定することが目的である。これは、NBQX、AMPAおよびカイネートブロッカーを用いて達成することができ、これはマイクロモル濃度でAMPA受容体8に対して選択的である。グルタミン酸媒介性興奮性およびアポトーシスシグナル伝達カスケードは、細胞死の程度を測定する理想的な下流標的であり、治療介入の潜在的な標的である。したがって、グルタミン酸媒介性カルシウム活性の調節および第一次腹側中脳症(VM)ニューロンにおける関連する下流シグナル伝達を評価するための高含有法を開発することは、ニューロンの健康を維持する能力に関する新しい治療法をスクリーニングする上で有益であろう。
ここでは、遺伝的にコード化されたカルシウム指標(GECI)、GCaMP6fを、AAV2/5とヒトシナプシン(hSyn)プロモートを用いて、生理学的および分子レベルで測定できるグルタミン酸アプリケーションに応答してマウスVM一次ニューロンのCa2+ 活性を測定するプロトコルを開発しました。この高含有スクリーニングは、VMニューロンの健康を維持するためにCa2+ 活性を調節する医薬品または治療法を発見するために適応することができる。我々は、この主要な培養モデルが、VMニューロンの健康を維持し、PDの進行を緩和する能力に基づいて、新しいPD介入をスクリーニングする効果的な方法であることを提案する。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Formalin/PBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100496-506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X NA 0.3 water-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UMPLFLN10XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm circular cover glass No. 1</td>
			<td>Phenix Research Products</td>
			<td>MS20-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X NA 0.85 oil-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO20XO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm uncoated plastic cell culture dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X NA 0.3 water-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LUMPLFLN40XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X NA 1.35 oil-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO60XO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin (sodium)</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>A-301-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td>50x stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binolcular Microscope</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>KSCXTS-1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2), anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (DNase)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose, andydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RDD016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM + GlutaMAX medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10569010</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equine serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26050088</td>
			<td>heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Illuminator, 100V</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>KSC5410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System, PES 22UM 250ML</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28199-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoview 1000 confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoview 1200 confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-chicken Alexa Fluor 594</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-rabbit Alexa Fluor 594</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks-balanced Salt Solution (HBSS) 1x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14175095</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101170-478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeraCell 150 CO2 incubator</td>
			<td>Heraeus (ThermoFisher)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ v1.52e</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS-Fine Scissors (Round Type)-S/S Str/31*8mm/13cm</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S12014-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>K-120-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2), andydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPII Mini-Peristaltic Pump, 115/230 VAC, 50/60 Hz</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MULLER Micro Forceps-Str, 0.15mm Tips, 11cm</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11014-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBQX</td>
			<td>Hello Bio</td>
			<td>HB0443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (NGS)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin 2020</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>100837-AAV1</td>
			<td>Titer: 1.00E+13 gc/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington Biomedical Corporation</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010049</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl), anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head Tubing Pieces For MPII</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>55-4148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal anti-caspase-3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl), anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>BioXtra, &#8805;99.5% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-pregnant female C57BL/6 mice</td>
			<td>Texas A&#38;M Institue for Genomic Medicine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-bore blue pipette tips P1000</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83007-380</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying spontaneous ca2+ fluxes and their downstream effects in primary mouse midbrain neurons

パーキンソン病(PD)は、ドーパミン作動性(DA)ニューロンの変性によって引き起こされる壊滅的な神経変性疾患である。グルタミン酸受容体の異常な活性化による過剰なCa2+ 流入は、DA興奮毒性をもたらし、DAニューロン喪失の重要なメカニズムとして同定されている。本研究では、ED14マウス胚のマウス腹側中頭症(VM)から中脳ニューロンを単離、解離、培養する。その後、ヒトニューロン特異的シナプシンプロモーターhSynの制御下で、遺伝的にコードされたカルシウム指標であるGCaMP6fを発現するアデノ関連ウイルス(AAV)を用いて、長期の一次マウス中脳培養物に感染する。ライブ共焦点イメージングを用いて、培養マウス中脳ニューロンがAAV-hSyn-GCaMP6fによって検出された自発的なCa2+ フラックスを表示することを示す。グルタミン酸を中脳培養に浴用に適用すると、ニューロン内の細胞内Ca2+ の異常な上昇を引き起こし、これは免疫染色によって示されるように、DAニューロンにおけるカスパーゼ3活性化を伴う。一次マウスDAニューロンにおけるグルタミン酸媒介アポトーシスを同定する技術は、DAニューロンの健康を維持する薬物の高含有スクリーニングに重要な用途を有する。

細胞の初期培養後、14 DIVで1μLのAAV hSyn-GCaMP6fでVM培養皿を処理し、5日間のウイルス発現を許可した。撮像HEPES記録バッファの当日に、フレッシュに調製した。我々は2つの条件を使用した。1つの条件では20 μMグルタミン酸を10分間塗布し、もう一方の条件では10 μM NBQXの塗布は10 μM NBQX + 20 μMグルタミン酸の10分共同塗布に先行した。両方の条件で、代表的な痕跡に示すように、自発的なCa2+フラックスを示すGCaMP6f蛍光の異種および自発的な変化を観察した(図1A、B、補足ムービー1-2)。20 μMグルタミン酸の適用は、自発的に活性および静止したニューロンの両方に強く持続したCa2+応答を生成した(図1A、補足ムービー1)。10 μM NBQXの適用は、自発的な活動を減少させ、グルタミン酸応答を部分的に遮断した(図1B、補足ムービー2)。グルタミン酸アプリケーションが各条件でCa2+応答を刺激した程度を、曲線下の面積、ピーク振幅、および遅延を使用して定量化した。曲線下及びピーク振幅の両方がグルタミン酸及びNBQX+グルタミン酸処理条件(図1C)の両方で類似していたが、一方、応答に対する遅延は、NBQX+グルタミン酸状態(.図2A,B)において有意に増加した。グルタミン酸処理に対するCa2+応答を定量化することに加えて、グルタミン酸媒介アポトーシスの尺度として、抗カスパーゼ-3抗体で試料を固定・染色した。我々は、条件にわたってカスパーゼ-3活性化の範囲を観察した(図3A,B)。カスパーゼ-3活性化は、測定領域および平均カスパーゼ-3強度によって定量した。未処理の対照細胞と比較すると、グルタミン酸およびNBQX+グルタミン酸状態下でカスパーゼ-3活性化を有する細胞の平均面積は有意性に向かう傾向にある(図3B)。平均カスパーゼ-3強度は、未治療のコントロールと比較してグルタミン酸およびNBQX+グルタミン酸状態において有意に高かった(図3B)。これらの結果は、ニューロンのアポトーシスを、興奮性物質に対するCa2+応答を定量化し、同じ培養物群におけるカスパーゼ-3活性化などの下流アポトーシス事象の分析を追跡することによって測定できる高含有フレームワークを示す。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig01.jpg"> 図1:培養腹側の脳包系ニューロンは、自発的なCa2+活性を示し、グルタミン酸アプリケーションによって強く刺激される。(A)VMニューロンにおける自発的Ca2+活性の代表的な痕跡と20μMグルタミン酸アプリケーションに対するそれらの反応。(B) VMニューロンにおける自発的Ca2+活性の代表的な痕跡と、10 μM NBQX + 20 μMグルタミン酸アプリケーションに対するそれらの反応。(C)Ca2+トレースの曲線下の面積とピーク振幅を示す人口データ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig02v3.jpg"> 図2:NBQXによるAMPAR遮断は、培養された腹側中脳症ニューロンにおけるグルタミン酸アプリケーションへの応答を遅らせる。(A)代表Ca2+グルタミン酸(灰色)およびNBQX+グルタミン酸(青色)誘発応答の痕跡。平均Ca2+グルタミン酸(黒)およびNBQX+グルタミン酸(赤色)の痕跡が重ね合せて示されている。(B) グルタミン酸およびNBQX + グルタミン酸誘発応答に対する応答までの遅延を示す母集団データ。グルタミン酸とNBQX+グルタミン酸条件の間のパーセント変化は、右側のパネルに表示されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig02v3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig03v3.jpg"> 図3:グルタミン酸剤の適用はチロシンヒドロキシラーゼ(TH)陽性腹側中脳症ニューロンにおけるカスパーゼ-3発現を増加させる。(A)カスパーゼ-3(緑色)およびTH(赤色)に対して免疫染色されたVM培養物の代表的な共焦点像、スケールバー=10μm(B)各条件におけるDAニューロン領域および平均カスパーゼ-3発現のグレー値を示す集団データ。B<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig03v3large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足ムービー 1: 自発的な Ca2+ 活動とグルタミン酸アプリケーションへの応答. HEPES記録バッファ(0-300 s)の存在下での自発的なCa2+ フラックスは、20 μMグルタミン酸(301-600 s)の適用に続く。スケールバー= 50 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61481/Supplementary_Movie%201_glutamate_ver_2.avi" target="_blank">こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。</a>
補足ムービー2:NBQX +グルタミン酸アプリケーションへの自発的なCa2+ 活性と応答。 HEPES記録バッファ(0-300 s)の存在下での自発的なCa2+ フラックスは、10 μM NBQX(301-600 s)、10 μM NBQX + 20 μMグルタミン酸(601-900 s)の適用に続きます。スケールバー= 50 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61481/Supplementary_Movie_2_NBQX_glut.avi" target="_blank">こちらをクリックして、このビデオをダウンロードしてください。</a>

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Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

ここでは、中脳ニューロンのin vitro Ca2+ フラックスを測定するプロトコルと、プライマリマウス中脳培養を用いたカスパーゼ-3に対するその下流の影響を提示する。このモデルは、中脳ニューロンにおける異常なCa2+ 活性に関連する病態生理学的変化を研究し、抗アポトーシス特性の新しい治療法をスクリーニングするために使用することができる。

主マウス中脳ニューロンにおける自発的Ca2+ フラックスとその下流効果の定量化

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx ...

このプロトコルは、パーキンソン病で失われるドーパミン作動性ニューロンのカルシウムフラックスを定量化します。これは、異常なカルシウムがパーキンソン病でドーパミン作動性ニューロン喪失を引き起こす方法を理解するのに役立ちます.初めて、培養された一次中脳ニューロンにおける自発的なカルシウムフラックスを実証する。この方法は、カルシウム媒介アポトーシスに関与する特定の受容体寄与を解剖するために使用することができる。我々の方法は、パーキンソン病のための特定の、効果的な神経保護化合物を発見するための高含有薬物スクリーンのための道を提供する。これらの神経保護化合物はドーパミン作動性ニューロンのカルシウム媒介アポトーシスを防ぐだろう.まず、1皿あたり1マイクロリットルのhSyn-GCaMP6f AAVで無血清DMEM培地を1ミリリットル調製します。各皿から細胞培養培地を吸引し、hSyn-GCaMP6fで調製したDMEMの1ミリリットルに交換する。37°Cのインキュベーターに1時間戻します。インキュベーション後、培地をAAVで吸引し、3ミリリットルの細胞培養培地に交換する。5~7日間、摂氏37度でインキュベートします。ウイルス感染のこの期間を通じて2〜3日ごとに培地を変更する。HEPES記録バッファーの1リットル、20マイクロモルグルタミン酸記録バッファーの200ミリリットル、および原稿の方向に従って10マイクロモルNBQX記録バッファの200ミリリットルを調製する。滅菌35ミリメートルペトリ皿を3ミリリットルの記録バッファで満たします。インキュベーターから感染した培養物とペトリ皿を取り、慎重に細かい先端鉗子で1カバースリップの端をつかみ、記録バッファで皿に移します。残りのカバースリップを培地に入れて摂氏37度のインキュベーターに戻し、録音バッファーで皿を共焦点顕微鏡に運びます。イメージング ソフトウェアを起動します。初期化中に、蠕動ポンプを起動し、記録バッファにラインを入れます。その後、毎分2ミリリットルに流れを較正します。感染したカバースリップをペトリ皿から細かい鉗子で記録浴に移します。10X水浸しの目的と明視野光を使用して、焦点の平面を見つけ、ニューロン細胞体の高密度の領域を探し、40Xの目的に切り替えてサンプルを再び焦点を合わせます。[色素]リストウィンドウで、AlexaFluor 488を選択して適用します。蛍光色素の露出過多や写真の漂白を防ぐために、低HVとレーザーパワー設定から始めます。AlexaFluor 488チャンネルの場合は、HVを500に、ゲインを1xに、オフセットをゼロに設定します。488 レーザーラインの電力を 5% に設定します。ピンホールサイズを300マイクロメートルに増やし、フォーカスx2スキャンオプションを使用して、発光信号を亜飽和レベルに最適に調整します。各チャンネルの最適な表示に合わせて設定を調整できます。顕微鏡の設定が最適化されたら、ステージを移動して、蛍光GCaMP6fの自発的な変化を示す複数の細胞を有する領域を見つけ、イメージング用の目的の平面に焦点を当てます。クリップ rect ツールを使用して、1 秒弱のフレーム間隔を達成できるサイズにイメージング フレームをクリップします。間隔ウィンドウの値を 1.0 に設定し、Num ウィンドウを 600 に設定します。t シリーズ ムービーをキャプチャするには、[時間] オプションを選択し、[Xyt スキャン] オプションを使用してイメージングを開始します。イメージング進捗バーを見て、HEPES記録バッファから適切な時点で20マイクロモルグルタミン酸記録バッファにラインを移動します。イメージングが完了したら、シリーズ完了ボタンを選択し、完成したtシリーズムービーを保存します。ニューロンの培養物が合計10分間グルタミン酸にさらされるように、さらに5分間グルタミン酸を浸透し続けます。画像を作成するカバースリップごとにこの手順を繰り返します。実験直後にカルシウムの痕跡や神経細胞の体を見ることは可能です。楕円ツールを使用して、神経細胞のソーマの周囲に所望の数の ROI を描画します。また、[系列分析] ボタンを使用してトレースを視覚化します。グルタミン酸への追加の5分間の露出の後、細かい鉗子で浴室からカバースリップを取り除き、すべてのイメージ投射が完了するまで記録バッファとペトリ皿に戻します。イメージングの日に、VM培養物をグルタミン酸またはグルタミン酸とNBQXの組み合わせで処理した。両方の条件において、GCaMP6fの蛍光の不均一および自発的変化が観察され、自発的なカルシウムフラックスを示す。グルタミン酸の適用は、自発的に活動的なニューロンと静止したニューロンの両方で堅牢で持続的なカルシウム応答を生成した。NBQXの適用は、自発的な活動を減少させ、グルタミン酸応答を部分的に遮断した。グルタミン酸塗布が各条件でカルシウム応答を刺激した程度を、曲線下の領域、ピーク振幅、および遅延を利用して定量化した。応答に対する遅延は、NBQXおよびグルタミン酸状態下で増加した。グルタミン酸媒介アポトーシスを測定するために、細胞を固定し、抗カスパーゼ-3抗体で染色した。平均カスパーゼ-3強度は、未治療の対照と比較して、両方の治療条件で有意に高かった。興奮した毒性細胞死のより徹底的な分析は、免疫染色体チロシンヒドロキシラーゼのコントロールおよびグルタミン酸処理状態における陽性ドーパミン作動性ニューロンの数を数えることによって行うことができる。この技術は、ドーパミン作動性ニューロンにおけるカルシウム媒介アポトーシスに関与する異なる受容体および鉄チャネルの相対的な寄与を理解する道を開いた。

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofectionとマウス胎児海馬および皮質ニューロンの初代培養

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イメージング初代培養マウス神経細胞における形質膜に受容体の挿入をpHluorinタグ付き

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

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