Name: quantifying spontaneous ca2+ fluxes and their downstream effects in primary mouse midbrain neurons
Uploaded: 2020-09-09T14:00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons at JoVE.com

미국 파킨슨 병 협회 (APDA)와 NIH R01NS15809-01RS의 보조금에 의해 지원됩니다. 텍사스 유전체 의학 연구소 (TIGM)는 1 차적인 도파민 문화를 생성하기 위하여 시간 조정된 임신 마우스를 제공한 것을 감사합니다.

<ol>
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우리는 뉴런에서 글루타민산 매개 세포석증의 고함량 분석을 위한 장기 1 차적인 1차 복부 심폐(VM) 세포 배양 시스템을 기술합니다. 연구는 PD 모델 의 맥락에서 엑시토 독성 메커니즘을 해명하기 위해 기본 중뇌 도파민 문화를사용하였다 11,,12. 이 연구에서는, 우리는 Ca2+ 활동을 측정하고 더 apoptotic 신호 캐스케이드4의개시와 같은 다운스트림 분자 변화와 이 활동을 연관시키기 위하여 유전으로 인코딩된 칼슘 표시기(GECIs)를 사용하여 조합접근을 채택합니다. 이 방법은 다른 유사한 세포 배양 시스템에 여러 가지 장점이 있습니다. 우리는 파킨슨 병의 맥락 내에서 흥분 독성에 특히 관심이 있기 때문에, 1 차적인 VM 세포 배양을 사용하는 것이 이상적입니다. TH 면역염색과 결합된 격자 표지또는 전동 XY 현미경 단계와 같은 다른 필드 재배치 기술을 사용하여, 우리는 복부 중뇌 뉴런에서 글루타민산 매개 세포 세포 세포의 특정 효과를 직접 연구할 수 있습니다. 또한, 3 주 세포 배양 모델은 뉴런이 성인 DA 뉴런9을반영하여 전체, 성숙한 분자 프로파일을 개발할 수 있게 합니다. 이전 방법은 주로 글루타민산 매개 흥분 독성13,,14에따른 분자 변화에 초점을 맞추고 있다. 이 모델은 뉴런 생리학의 급성 변화와 확인된 세포 유형의 다운스트림 분자 사건과 상관 관계를 맺는 능력이 독특합니다. 1 차 배양 모델의 한 가지 제한은 해부 기술이 전체 복부 중뇌를 캡처한다는 것입니다, DA와 GABAergic 뉴런뿐만 아니라 SNc와 VTA에서 뉴런을 포함. 증거는 지금 SNc의 DA 뉴런이 이웃 VTA15의DA 뉴런에 비해 칼슘과 최종 세포 사멸에 선택적 취약점이 있음을 시사한다. 불행히도, 배아 배양 배양에서 VTA 뉴런에서 SNc를 차별화하는 것은 배아 뇌에서 이러한 구조를 정의하는 몇 가지 해부학 적 랜드 마크와 어려운 입증했다.
우리는 기본 배양 기술이 이종 자발적인 Ca2+ 활동의 정량화를 허용한다는 것을 보여줍니다(도 1). 따라서, 이것은 중뇌의 페이스메이킹 도파민간 뉴런, 신코르티컬 뉴런, 및 수막핵(SCN)16,,17의GABAergic 뉴런과 같은 톤활성 세포를 연구하는 이상적인 세포 배양 시스템 모델이다. 대부분의 응용 프로그램에서 Ca2+ 이미징은 전기 생리학과 동일한 시간적 해결을 달성하지 못합니다. 따라서 단일 Ca2+ 이벤트는 신경 작용 잠재력의 파열과 유사할 수 있습니다. 이는 Ca2+ 이미징이 페이스메이킹 세포에서 비정상적인 파열 활성을 비교적 정확하게 측정할 수 있으며 따라서 Ca2+-매개엑시토독성 세포 사멸의 고함량 스크린에 적합하다는 것을 의미하기 위해 해석될 수 있다.
자발적인 Ca2+ 활동을 달성하고 유지 관리하려면 프로토콜의 두 가지 핵심 사항을 해결하는 것이 중요합니다. 첫 번째는 해부 다음 세포의 도금 밀도입니다. 1 차적인 VM 뉴런을 위해, 이전 연구 결과는 약 100,000 세포/cm29,,10을사용했습니다. 우리는 200,000 세포 /cm2의밀도를 플레이트 프로토콜을 조정하여 이종성 범위의 자발적 인 활성을 생성하고 각 커버 슬립에 존재하는 도파민 성 VM 뉴런의 수를 증가시킵니다. 다른 페이스 메이킹 뉴런은 뚜렷한 발사 특성을 가지고 있기 때문에16,도금 밀도는 연구되고 자발적 인 활동의 이상적인 수준을 달성하기 위해 최적화되는 세포 유형에 사용자 정의 할 필요가있다. 두 번째는 AAV의 바이러스 감염 에 따른 잠복기입니다. 도금 밀도처럼, 이것은 연구 질문의 특정 컨텍스트와 사용되는 AAV의 유형에 따라 달라집니다. 여기서 사용되는 특정 AAV의 경우, 바이러스 감염 에 따른 5일 간의 배양은 원하는 단백질 발현 수준을 달성하는 데 이상적이며, 이는 Ca2+ 활성을 기록하기 위해 GCaMP 형광의 동적 변화를 허용한다. 많은 요인이 AAV가화물을 얼마나 빠르고 효율적으로 표현할 것인지를 결정하며, 그 중 상당수는 이 방법의 범위를 벗어났지만, 간단히 말해서, 프로모터 활동과 화물 단백질이 성숙하고 접는 속도를 고려하는 것이 중요합니다.
이 방법의 또 다른 장점은 형식, 발현 벡터, 이미징 장비 사용 및 해결할 수 있는 과학적 질문의 범위에서 상당한 유연성을 허용한다는 것입니다. 또한, 이 방법은 PD의 글루타메이트 매개 흥분 독성및 신경계 기능 장애의 다른 모델을 둘러싸는 광범위한 특정 질문에 대한 문의를 가능하게 합니다. 예를 들어, 글루타민산 매개 흥분독성은 다중 수용체와 신호 캐스케이드5를포함한다. 상기 방법을 이용하여, AMPAR 차단제, NBQX를 도 1에서,생리학적 및 분자 수준에서 엑시토독성 글루타민반응의 특정 성분을 해부할 수 있다. 생각할 수 있는, 두 번째 메신저 시스템의 억제제를 사용 하 여 비슷한 접근 흥분 독성에 그들의 기여를 결정 하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 여기에 사용되는 AAV는 신경 전달 물질 방출과 같은 다른 매개 변수를 측정하는 데 사용할 수있는 세포 특정 프로모터 또는 AAV 발현 광유전학 센서로 GECI를 발현하도록 적응 될 수 있습니다.
1 차적인 배아 해부 및 공초점 화상 진찰을 제외하고, 프로토콜의 대부분은 특수 교육을 필요로 하지 않는 기본적인 실험실 기술을 이용합니다. 따라서, 모델에 대한 제한은 배아 해부 기술의 난이도, 세포가 성숙에 도달하기 위해 배양되어야 하는 시간의 길이, 및 공초점 현미경, 또는 유사한 이미징 장치에 대한 접근을 포함한다. 이 방법의 많은 이점과 유연성은 이러한 한계보다 더 중요하므로 신경계 장애에서 글루타메이트 매개 흥분 독성을 연구하기에 이상적인 모델입니다. 마지막으로,이 모델은 안티 세포 효과 와 DA 뉴런 건강을 보존 하는 그들의 능력에 대 한 새로운 화합물을 스크린 하는 효과적인 도구가 될 수 있습니다.

파킨슨 병 (PD)은 알려진 치료법이없는 전 세계적으로 두 번째로 흔한 신경 퇴행성 질환입니다. 추정에 따르면 PD 보급은 계속 증가할 것이며 2030년까지미국에서만100만 개의 진단을 능가할 것으로 예상됩니다. 현재 PD를 퇴치하기 위해 사용할 수있는 몇 가지 효과적인 치료와 함께, 더 효과적인 치료를 개발하는 절박한 필요가있다. PD는 중뇌 도파민 (DA) 뉴런2의신속하고 점진적 인 손실을 특징으로한다. PD에서 신경 변성의 기초가 되는 기계장치는 제대로 이해되지 않습니다. 증거는 산화 스트레스 및 미토콘드리아 기능 장애 등과 같은 여러 메커니즘의 가능성이 수렴을 시사하며, 이는 세포 사멸 신호 캐스케이드 및 최종 세포 사멸 의 개시에 기여한다3.
이러한 수렴 메커니즘 중 하나, 글루타민산 매개 발췌 독성은 PD4를포함한 여러 신경 퇴행성 질환에 연루되었다. 글루타메이트 매개 흥분독성은 세포내 Ca2+ 농도 및 종말 개시의 과도한 증가를 통해 NMDA 수용체의 자극을 통해 주로 작동하도록 생각되지만, Ca2+투과성 AMPA 수용체도 발독 반응5,,6,,7에연루되어 있다. 따라서, PD 모델 내에서 글루타민산염 매개 세포사멸에 AMPA 수용체의 기여를 결정하는 것이 흥미로하다. 이는 AMPA 및 kainate 차단제인 NBQX를 사용하여 달성될 수 있으며, 이는 마이크로몰라 농도에서 AMPA 수용체8에대해 선택적이다. 글루타민산매개 엑시토토독성 및 세포사멸 신호 캐스케이드는 세포 사멸의 정도를 측정하는 이상적인 다운스트림 표적이며 치료 개입을 위한 잠재적인 표적이다. 따라서, 1차 복부 심폐(VM) 뉴런에서 글루타메이트 매개 변조 및 관련 다운스트림 신호 조절을 평가하기 위한 고함량 방법을 개발하는 것은 뉴런 건강을 보존하는 능력에 대한 새로운 치료 방법을 선별하는 데 유용할 것이다.
여기서, 우리는 인간 시냅신(hSyn) 프로모터와 AAV2/5를 사용하여 생리학적 및 분자 수준에서 측정할 수 있는 글루타민트 애플리케이션에 대응하여 마우스 VM 1차 뉴런의Ca2+ 활성을 측정하는 유전자 코딩된 칼슘 표시기(GECI), GCaMP6f를 발현하는 프로토콜을 개발했습니다. 이 고함량 스크리닝은 VM 뉴런의 건강을 보존하기 위해 Ca2+ 활동을 조절하는 제약 또는 치료법을 발견하기 위해 조정할 수 있습니다. 우리는이 기본 문화 모델은 VM 뉴런의 건강을 보존하고 PD의 진행을 완화하는 능력에 따라 새로운 PD 개입을 선별하는 효과적인 방법이라고 제안합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Formalin/PBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100496-506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X NA 0.3 water-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UMPLFLN10XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm circular cover glass No. 1</td>
			<td>Phenix Research Products</td>
			<td>MS20-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X NA 0.85 oil-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO20XO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm uncoated plastic cell culture dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X NA 0.3 water-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LUMPLFLN40XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X NA 1.35 oil-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO60XO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin (sodium)</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>A-301-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td>50x stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binolcular Microscope</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>KSCXTS-1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2), anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (DNase)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose, andydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RDD016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM + GlutaMAX medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10569010</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equine serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26050088</td>
			<td>heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Illuminator, 100V</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>KSC5410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System, PES 22UM 250ML</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28199-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoview 1000 confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoview 1200 confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-chicken Alexa Fluor 594</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-rabbit Alexa Fluor 594</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks-balanced Salt Solution (HBSS) 1x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14175095</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101170-478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeraCell 150 CO2 incubator</td>
			<td>Heraeus (ThermoFisher)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ v1.52e</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS-Fine Scissors (Round Type)-S/S Str/31*8mm/13cm</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S12014-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>K-120-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2), andydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPII Mini-Peristaltic Pump, 115/230 VAC, 50/60 Hz</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MULLER Micro Forceps-Str, 0.15mm Tips, 11cm</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11014-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBQX</td>
			<td>Hello Bio</td>
			<td>HB0443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (NGS)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin 2020</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>100837-AAV1</td>
			<td>Titer: 1.00E+13 gc/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington Biomedical Corporation</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010049</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl), anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head Tubing Pieces For MPII</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>55-4148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal anti-caspase-3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl), anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>BioXtra, &#8805;99.5% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-pregnant female C57BL/6 mice</td>
			<td>Texas A&#38;M Institue for Genomic Medicine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-bore blue pipette tips P1000</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83007-380</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying spontaneous ca2+ fluxes and their downstream effects in primary mouse midbrain neurons

파킨슨 병 (PD)은 도파민 (DA) 뉴런의 퇴행성으로 인한 치명적인 신경 퇴행성 질환입니다. 글루타민산 수용체의 비정상적인 활성화로 인한 과도한 Ca2+ 유입은 DA 절제독성을 초래하고 DA 뉴런 손실을 위한 중요한 메커니즘으로 확인되었습니다. 이 연구에서는, 우리는 ED14 마우스 배아의 마우스 복부 심뇌 mesencephalon (VM)에서 격리, 해리, 및 배양 중뇌 뉴런. 그런 다음 유전적으로 인코딩된 칼슘 지표를 발현하는 아데노 관련 바이러스(AAV)로 장기 1차 마우스 중뇌 배양을 감염시키고, GCaMP6f는 인간 뉴런 특이적 시냅신 프로모터, hSyn의 통제 하에 있다. 라이브 공초점 이미징을 사용하여, 우리는 배양 마우스 중뇌 뉴런이 AAV-hSyn-GCaMP6f에 의해 검출된 자발적인 Ca2+ 플럭스를 표시한다는 것을 보여줍니다. 중뇌 배양에 조미료의 목욕 응용 프로그램은 뉴런 내에서 세포 내 Ca2 + 비정상적인 고도를 일으키는 원인이되며, 이것은 면역 염색에 의해 입증 된 바와 같이, DA 뉴런에서 caspase-3 활성화를 동반한다. 1 차 마우스 DA 뉴런에서 글루타민산 매개 세포사멸을 식별하는 기술은 DA 뉴런 건강을 보존하는 약물의 높은 함량 선별에 대한 중요한 응용 프로그램이 있습니다.

세포의 초기 배양에 따라, 우리는 AAV hSyn-GCaMP6f의 1 μL로 14 DIV에서 VM 배양 접시를 처리하고 바이러스 성 발현5 일 동안 허용했습니다. 영상 촬영 당일 HEPES 레코딩 버퍼는 신선하게 준비하였다. 우리는 두 가지 조건을 사용했습니다. 한 조건에서 20 μM 글루타메이트는 10분 동안 적용되었고, 다른 조건에서는 10μM NBQX 의 5분 이면에 10μM NBQX + 20 μM 글루타메이트의 10분 공동 적용이 선행되었다. 두 조건 모두에서, 우리는 GCaMP6f 형광의 이종및 자발적인 변화를 관찰, 이는 자발적인 Ca2 + 플럭스를 나타내는, 대표 흔적에 도시된 바와 같이(그림 1A, B, 보충 영화 1-2). 20 μM 글루타메이트의 적용은 자발적으로 활성 및 정지 성 뉴런 모두에서 견고하고 지속적인 Ca2+ 반응을 생성(그림 1A, 보충 영화 1). 10 μM NBQX의 응용 프로그램은 자발적인 활성을 감소시키고 글루타민반응(도 1B, 보충 동영상 2)을부분적으로 차단하였다. 각 조건에서 조미료 응용 프로그램이 Ca2+ 응답을 자극하는 정도는 곡선 아래 영역, 피크 진폭 및 반응할 대기 시간을 사용하여 정량화되었습니다. 곡선 및 피크 진폭 아래의 두 영역모두 글루타민산염 및 NBQX + 글루타민처리조건(도 1C)과유사했으며, 응답에 대한 대기 시간은 NBQX + 글루타민트 상태(도2A,B)에서크게 증가하였다.. 글루타민처리에 대한 Ca2+ 반응을 정량화하는 것 외에도 글루타민트 매개 석립증의 척도로서 항 카스파스-3 항체로 샘플을 고정하고 염색했습니다. 조건에 걸쳐 카스파제-3 활성화의 범위를관찰하였다(그림 3A, B). Caspase-3 활성화는 측정 영역 및 평균 caspase-3 강도에 의해 정량화되었다. 처리되지 않은 대조군 세포와 비교했을 때, 글루타민산염 및 NBQX + 글루타민트 조건 하에서 caspase-3 활성화를 갖는 세포의 평균 영역은 유의성(도3B)으로경향하였다. 평균 caspase-3 강도는 처리되지 않은 대조군(도 3B)에비해 글루타민트 및 NBQX + 글루타민트 조건에서 상당히 높았다. 이러한 결과는 함께 엑시토독성 제제에 대한 Ca2+ 반응을 정량화하여 뉴런의 세포멸을 측정하고 동일한 배양 집합에서 caspase-3 활성화와 같은 다운스트림 세포 분석의 분석을 통해 측정할 수 있는 고함량 프레임워크를 보여 줍니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig01.jpg"> 그림 1: 배양 된 복부 심연 성 뉴런은 자발적인 Ca2+ 활동을 표시하고 글루타민트 응용 프로그램에 의해 강력하게 자극됩니다. (A)VM 뉴런에서 자발적인 Ca2+ 활성의 대표적인 흔적과 20 μM 글루타메이트 응용 프로그램에 대한 반응. (B)VM 뉴런에서 자발적인 Ca2+ 활성의 대표적인 흔적과 10 μM NBQX + 20 μM 글루타메이트 애플리케이션에 대한 반응. (C)Ca2+ 추적의 곡선 및 피크 진폭 아래 영역을 나타내는 인구 데이터. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig02v3.jpg"> 그림 2: NBQX를 가진 AMPAR 봉쇄는 배양된 복부 심전도 뉴런에서 글루타민제 응용에 대한 반응을 지연시다. (A)대표 Ca2+ 글루타민산염(회색) 및 NBQX + 글루타민트(파란색)의 흔적이 응답을 불러 일으켰습니다. 글루타민트(블랙)와 NBQX + 글루타메이트(빨간색)의 평균 Ca2+ 흔적이 오버레이된 것으로 나타났다. (B)글루타민산염 및 NBQX + 글루타메이트에 대한 응답에 대한 대기 시간을 나타내는 인구 데이터가 응답을 불러 일으켰습니다. 글루타민트와 NBQX + 글루타민트 조건 사이의 백분율 변화가 오른쪽 패널에 표시됩니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig02v3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig03v3.jpg"> 그림 3: 글루타민트 응용 프로그램은 티로신 하이드록실라제(TH) 양성 복부 심폐성 뉴런에서 caspase-3 발현을 증가시킨다. (A)VM 배양물의 대표적인 공초점 이미지는 카스파제-3(녹색) 및 TH(빨간색), 스케일 바 = 10 μm.(B)각 조건에서 caspase-3 발현의 평균 회색 값을 나타내는 인구 데이터를 갖는다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig03v3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보조 영화 1: 자발적인 Ca2+ 활동 및 글루타민트 응용 프로그램에 대한 응답. HEPES 레코딩 버퍼(0-300s)가 있는 경우 자발적인 Ca2+ 플럭스가 20μM 글루타메이트(301-600s)를 적용합니다. 스케일 바 = 50 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61481/Supplementary_Movie%201_glutamate_ver_2.avi" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보조 영화 2: 자발적인 Ca2+ 활동 및 NBQX + 글루타민트 응용 프로그램에 대한 응답. HEPES 레코딩 버퍼(0-300s)가 있는 경우 자발적인 Ca2+ 플럭스 10 μM NBQX(301-600s) 및 10 μM NBQX + 20 μM 글루타메이트(601-900s)를 적용한다. 스케일 바 = 50 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61481/Supplementary_Movie_2_NBQX_glut.avi" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

여기에서 우리는 시험관 외 Ca에서 측정 하는 프로토콜을 제시2+ 중간 뇌 뉴런에서 플럭스와 1 차 마우스 중간 두뇌 문화를 사용 하 여 caspase-3에 그들의 다운 스트림 효과. 이 모델은 중뇌 뉴런에서 비정상적인 Ca2+ 활동과 관련된 병리학적 변화를 연구하고, 세포세포 항세포 특성에 대한 새로운 치료법을 선별하기 위해 사용될 수 있다.

기본 마우스 중뇌 뉴런에서 자발적인 Ca2+ 플럭스와 다운스트림 효과를 정량화

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx ...

이 프로토콜은 파킨슨 병에서 손실되는 도파민성 뉴런에서 칼슘 플럭스를 정량화합니다. 이것은 이상한 칼슘이 파킨슨 병에서 도파민성 뉴런 손실을 일으키는 방법을 이해하는 데 유용합니다. 처음으로, 우리는 배양 된 1 차적인 중뇌 뉴런에서 자발적인 칼슘 플럭스를 보여줍니다.이 방법은 칼슘 매개 세포사멸에 관여하는 특정 수용체 기여를 해부하는 데 사용할 수 있습니다. 우리의 방법은 파킨슨 병에 대한 구체적이고 효과적인 신경 보호 화합물을 발견 할 수있는 고함량 약물 화면에 대한 길을 제공합니다. 이러한 신경 보호 화합물 도파민 성 뉴런에서 칼슘 매개 석 각멸을 방지 할 것 이다.요리 당 hSyn-GCaMP6f AAV의 마이크로 리터 1개와 함께 세럼이 없는 DMEM 배지 1밀리리터를 준비하여 시작합니다. 각 접시에서 세포 배양 배지를 흡인하고 준비된 DMEM의 1밀리리터로 hSyn-GCaMP6f로 대체한다. 1시간 동안 섭씨 37도 인큐베이터에 다시 접시를 넣습니다.인큐베이션 후, 배지를 AAV로 흡인시키고 세포 배양 배지의 3밀리리터로 대체한다. 5~7일 동안 섭씨 37도에서 요리를 배양합니다. 바이러스 감염의이 기간 동안 매 2 ~ 3 일 마다 매체를 변경.HEPES 레코딩 버퍼 1리터, 20개의 마이크로몰라 글루타메이트 레코딩 버퍼 200밀리리터, 원고 지시에 따라 10마이크로몰러 NBQX 레코딩 버퍼 200밀리리터를 준비한다. 멸균 35밀리미터 페트리 접시에 레코딩 버퍼 3밀리리터를 채웁니다. 인큐베이터에서 감염된 배양물로 페트리 접시를 가져 간 다음, 조심스럽게 미세 한 팁 집게로 하나의 커버 슬립의 가장자리를 잡고 녹음 버퍼와 접시에 전송합니다.나머지 커버 슬립을 37도 인큐베이터에 다시 넣고 레코딩 버퍼로 접시를 공초점 현미경으로 운반합니다. 이미징 소프트웨어를 시작합니다. 초기화하는 동안 연동 펌프를 시작하고 라인을 레코딩 버퍼에 넣습니다.그런 다음 흐름을 분당 2 밀리리터로 보정합니다. 감염된 커버 슬립을 페트리 접시에서 미세한 집게로 녹음 욕조로 옮기습니다. 10X 수분 침수 목표와 밝은 조명을 사용하여 초점 평면을 찾아 뉴런 세포 체의 밀도가 높은 영역을 찾은 다음 40X 목표로 전환하여 시료에 다시 초점을 맞춥니다.염료 목록 창에서 AlexaFluor 488을 선택하고 적용합니다. 형광의 과다 노출 및 사진 표백을 방지하기 위해 낮은 HV 및 레이저 전원 설정으로 시작합니다. AlexaFluor 488 채널의 경우 HV를 500으로 설정하고 게인을 1x로 설정하고 오프셋을 0으로 설정합니다.488 레이저 라인의 전력을 5%로 설정합니다. 핀홀 크기를 300 마이크로미터로 늘리고 초점 x2 스캐닝 옵션을 사용하여 방출 신호를 하위 수준으로 최적으로 조정합니다. 그런 다음 각 채널의 최적의 가시성을 위해 설정을 조정할 수 있습니다.현미경 설정이 최적화되면 스테이지를 이동하여 GCaMP6f 형광의 자발적인 변화를 표시하는 여러 세포가 있는 영역을 찾고 이미징을 위해 원하는 평면에 집중합니다. 클립 직사각형 도구를 사용하여 이미징 프레임을 1초 미만의 프레임 간격으로 달성할 수 있는 크기로 잘라냅니다. 간격 창을 값1.0값과 Num 창을 600으로 설정합니다.t 시리즈 동영상을 캡처하려면 시간 옵션을 선택한 다음 Xyt 검색 옵션을 사용하여 이미징을 시작합니다. 이미징 진행률 막대를 보고 HEPES 레코딩 버퍼에서 적절한 시점의 20 마이크로몰러 글루타메이트 레코딩 버퍼로 라인을 이동합니다. 이미징이 완료되면 시리즈 완료 버튼을 선택하고 완성된 t 시리즈 동영상을 저장합니다.뉴런의 문화가 총 10 분 동안 글루타민에 노출되도록 추가 5 분 동안 글루타민을 퍼프합니다. 각 커버 슬립에 대해 이 프로세스를 반복하여 이미지화합니다. 실험 직후 칼슘 흔적과 신경 세포 체를 볼 수 있다.타원 도구를 사용하여 신경 소종 주위에 원하는 수의 ROI를 그립니다. 그리고 계열 분석 버튼을 사용하여 추적을 시각화합니다. 글루타민에 추가로 5 분 노출 후, 미세 한 포셉목욕에서 커버 슬립을 제거하고 모든 이미징이 완료 될 때까지 기록 버퍼와 페트리 접시에 다시 배치합니다.이미징 의 날에, VM 배양은 글루타민트 또는 글루타민산염과 NBQX의 조합으로 취급되었습니다. 두 조건 모두에서, GCaMP6f 꽃에 있는 이기종 및 자발적인 변경은 자발적인 칼슘 플럭스를 나타내는 관찰되었습니다. 글루타민의 응용 프로그램은 자발적으로 활성 및 정지 뉴런 모두에서 강력하고 지속적인 칼슘 반응을 생성했다.NBQX의 응용 프로그램은 자발적인 활동을 감소시키고 글루타민트 반응을 부분적으로 차단했습니다. 글루타민병 적용이 각 조건에서 칼슘 반응을 자극하는 정도는 곡선 아래 영역, 피크 진폭 및 반응할 대기 시간을 사용하여 정량화되었다. 응답에 대한 대기 시간은 NBQX 및 글루타민트 조건하에서 증가했습니다.글루타민산 매개 세포사멸을 측정하기 위해 세포는 항 카스파제-3 항체로 고정되고 염색되었다. 평균 caspase-3 강도 치료 되지 않은 컨트롤에 비해 두 치료 조건에서 상당히 높았다. 흥분된 독성 세포 사멸의 보다 철저한 분석은 면역스테인 티로신 하이드록실라제 양성 도파민성 뉴런의 수를 조절 및 글루타민산 처리 상태에서 계산하여 수행될 수 있다.이 기술은 도파민성 뉴런에서 칼슘 매개 세포사멸에 관여하는 다른 수용체와 철 채널의 상대적 기여를 이해하는 길을 열었습니다.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection 및 배아 마우스 Hippocampal과 두피 뉴런의 주요 문화

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

연구

신경과학

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

이미징은 기본 양식 마우스 뉴런의 플라즈마 막에 수용체 삽입을 pHluorin 태그

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

차 해마 신경 세포의 칼슘 인산염 형질

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

마우스 도파민 뉴런의 차 문화

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

성인 마우스의 중간 뇌 도파민 뉴런의 수의 환경 변조

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

하는 세포 칼슘의 형광 및 생물 발광 영상<sup&gt; 2 +</sup&gt; 노인 해마 신경 세포에서

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

신경 죽음 및 마우스 기본 소 뇌과 립 신경에 변성을 모델링

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

마우스 기본 Hypothalamic 뉴런 Deconvolution 현미경을 사용 하 여 매매 GLUT4 단백질의 라이브 이미지

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

마우스 기본 Oligodendrocytes의 신속 하 고 구체적인 Immunomagnetic 절연

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Effects in Cultured Mouse Neurons

시각화 Axonal 성장 콘 붕괴 교양된 마우스 신경에 있는 초기 아 밀 로이드 β 효과

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...