Name: quantifying spontaneous ca2+ fluxes and their downstream effects in primary mouse midbrain neurons
Uploaded: 2020-09-09T14:00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons at JoVE.com

Støttet av tilskudd fra American Parkinson Disease Association (APDA) og NIH R01NS115809-01 til RS. Vi takker Texas A&M Institute for Genomic Medicine (TIGM) for å gi tidsbevisste gravide mus for å generere primære dopaminerge kulturer.

<ol>
	<li>Marras, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+Parkinson's+disease+across+North+America.">Prevalence of Parkinson's disease across North America.</a> NPJ Parkinson's Disease. 4, 21 (2018).</li><li>Poewe, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson+disease.">Parkinson disease.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013 (2017).</li><li>Mehta, A., Prabhakar, M., Kumar, P., Deshmukh, R., Sharma, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxicity:+bridge+to+various+triggers+in+neurodegenerative+disorders.">Excitotoxicity: bridge to various triggers in neurodegenerative disorders.</a> European Journal of Pharmacology. 698 (1-3), 6-18 (2013).</li><li>Ambrosi, G., Cerri, S., Blandini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+further+update+on+the+role+of+excitotoxicity+in+the+pathogenesis+of+Parkinson's+disease.">A further update on the role of excitotoxicity in the pathogenesis of Parkinson's disease.</a> Journal of Neural Transmission (Vienna). 121 (8), 849-859 (2014).</li><li>Dong, X. X., Wang, Y., Qin, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+excitotoxicity+and+their+relevance+to+pathogenesis+of+neurodegenerative+diseases.">Molecular mechanisms of excitotoxicity and their relevance to pathogenesis of neurodegenerative diseases.</a> Acta Pharmaceutica Sinica B. 30 (4), 379-387 (2009).</li><li>Vieira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxicity+through+Ca2+-permeable+AMPA+receptors+requires+Ca2+-dependent+JNK+activation.">Excitotoxicity through Ca2+-permeable AMPA receptors requires Ca2+-dependent JNK activation.</a> Neurobiology of Disease. 40 (3), 645-655 (2010).</li><li>Sebe, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)-Permeable+AMPARs+Mediate+Glutamatergic+Transmission+and+Excitotoxic+Damage+at+the+Hair+Cell+Ribbon+Synapse.">Ca(2+)-Permeable AMPARs Mediate Glutamatergic Transmission and Excitotoxic Damage at the Hair Cell Ribbon Synapse.</a> Journal of Neuroscience. 37 (25), 6162-6175 (2017).</li><li>Brickley, S. G., Farrant, M., Swanson, G. T., Cull-Candy, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNQX+increases+GABA-mediated+synaptic+transmission+in+the+cerebellum+by+an+AMPA/kainate+receptor-independent+mechanism.">CNQX increases GABA-mediated synaptic transmission in the cerebellum by an AMPA/kainate receptor-independent mechanism.</a> Neuropharmacology. 41 (6), 730-736 (2001).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smoking-Relevant+Nicotine+Concentration+Attenuates+the+Unfolded+Protein+Response+in+Dopaminergic+Neurons.">Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).</li><li>Henley, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+Identification+of+Living+Dopaminergic+Neurons+in+Midbrain+Cultures+Using+RNA+Sequencing+and+TH-promoter-driven+eGFP+Expression.">Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e54981 (2017).</li><li>Douhou, A., Troadec, J. D., Ruberg, M., Raisman-Vozari, R., Michel, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+promotion+of+mesencephalic+dopaminergic+neurons+by+depolarizing+concentrations+of+K++requires+concurrent+inactivation+of+NMDA+or+AMPA/kainate+receptors.">Survival promotion of mesencephalic dopaminergic neurons by depolarizing concentrations of K+ requires concurrent inactivation of NMDA or AMPA/kainate receptors.</a> Journal of Neurochemistry. 78 (1), 163-174 (2001).</li><li>Lavaur, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+noble+gas+xenon+provides+protection+and+trophic+stimulation+to+midbrain+dopamine+neurons.">The noble gas xenon provides protection and trophic stimulation to midbrain dopamine neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 142 (1), 14-28 (2017).</li><li>Kritis, A. A., Stamoula, E. G., Paniskaki, K. A., Vavilis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Researching+glutamate+-+induced+cytotoxicity+in+different+cell+lines:+a+comparative/collective+analysis/study.">Researching glutamate - induced cytotoxicity in different cell lines: a comparative/collective analysis/study.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 91 (2015).</li><li>Gupta, K., Hardingham, G. E., Chandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-dependent+glutamate+excitotoxicity+in+human+embryonic+stem+cell-derived+neurons.">NMDA receptor-dependent glutamate excitotoxicity in human embryonic stem cell-derived neurons.</a> Neuroscience Letters. 543, 95-100 (2013).</li><li>Surmeier, D. J., Obeso, J. A., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+neuronal+vulnerability+in+Parkinson+disease.">Selective neuronal vulnerability in Parkinson disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (2), 101-113 (2017).</li><li>Ramirez, J. M., Tryba, A. K., Pena, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacemaker+neurons+and+neuronal+networks:+an+integrative+view.">Pacemaker neurons and neuronal networks: an integrative view.</a> Current Opinion in Neurobiology. 14 (6), 665-674 (2004).</li><li>Guzman, J. N., Sanchez-Padilla, J., Chan, C. S., Surmeier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+pacemaking+in+substantia+nigra+dopaminergic+neurons.">Robust pacemaking in substantia nigra dopaminergic neurons.</a> Journal of Neuroscience. 29 (35), 11011-11019 (2009).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Vi beskriver et langsiktig primært ventral mesencephalic (VM) cellekultursystem for analyse av høyt innhold av glutamat-mediert apoptose i nevroner. Studier har brukt primære midbrain dopaminerge kulturer for å belyse eksoksiske mekanismer i sammenheng medPD-modeller 11,12. I denne studien bruker vi en kombinatorisk tilnærming ved hjelp av genetisk kodede kalsiumindikatorer (GECIer) for å måle Ca2 + aktivitet og videre knytte denne aktiviteten til nedstrøms molekylære endringer, for eksempel initiering av apoptotiske signalkaskader4. Metoden har flere fordeler med andre lignende cellekultursystemer. Som vi har spesiell interesse for excitotoxicity i sammenheng med Parkinsons sykdom, ved hjelp av primære VM cellekulturer er ideelt. Ved å bruke ulike feltflyttingsteknikker, for eksempel gridded coverslips eller et motorisert XY-mikroskopstadium kombinert med TH-immunstaining, kan vi direkte studere celletypenspesifikke effekter av glutamatmediert apoptose i ventrale midbrainnevroner. I tillegg gjør den 3-ukers cellekulturmodellen det mulig for nevroner å utvikle sin fulle, modne molekylære profil, noe som gjenspeiler voksne DA-nevroner9. Tidligere metoder har hovedsakelig fokusert på molekylære endringer etter glutamat-mediert excitotoxicity13,14. Modellen er unik i sin evne til å korrelere akutte endringer i nevronal fysiologi med nedstrøms molekylære hendelser i identifiserte celletyper. En begrensning av den primære kulturmodellen er at disseksjonsteknikken fanger hele ventrale midbrain, inkludert DA og GABAergic nevroner samt nevroner fra SNc og VTA. Bevis tyder nå på at DA nevroner av SNc har selektiv sårbarhet for kalsium og eventuell celledød sammenlignet med DA nevroner av nabo VTA15. Dessverre har differensiering av SNc fra VTA-nevroner i embryonale kulturer vist seg vanskelig med få anatomiske landemerker for å definere disse strukturene i den embryonale hjernen.
Vi viser at den primære kulturteknikken tillater kvantifisering av heterogen spontan Ca2 + aktivitet (figur 1). Derfor er dette en ideell cellekultursystemmodell for å studere tonisk aktive celler, for eksempel pacemaking dopaminerge nevroner i midbrain, neokortikale nevroner og GABAergiske nevroner i suprachiasmatic kjernen (SCN)16,17. I de fleste applikasjoner oppnår ca2 + bildebehandling ikke samme temporal oppløsning som elektrofysiologi. Derfor er det sannsynlig at en enkelt Ca2 + hendelse er analog med et utbrudd av nevronale virkningspotensialer. Dette kan tolkes slik at Ca2 + bildebehandling gir mulighet for relativt nøyaktige målinger av unormal sprengningsaktivitet i pacemaking celler og er derfor egnet for en høyinnholdsskjerm av Ca2 +-mediert eksoksisk celledød.
For å oppnå og opprettholde spontan Ca2 + aktivitet, er det viktig å ta opp to viktige punkter i protokollen. Først er plating tettheten av cellene etter disseksjon. For primære VM nevroner, tidligere studier har brukt rundt 100.000 celler/cm29,,10. Vi har tilpasset protokollen til plate en tetthet på 200.000 celler / cm2, noe som skaper et heterogent spekter av spontan aktivitet og øker antall dopaminerge VM nevroner tilstede på hver coverlip. Siden ulike pacemaking nevroner har forskjellige avfyring egenskaper16, plating tetthet må tilpasses celletypen blir studert og optimalisert for å oppnå ideelle nivåer av spontan aktivitet. For det andre er inkubasjonstiden etter virusinfeksjon av AAVs. Som plating tetthet, dette vil være avhengig av den spesifikke konteksten av forskningsspørsmålet og type AAV som brukes. For den spesifikke AAV brukes her, 5 dager med inkubasjon etter virusinfeksjon er ideell for å oppnå ønsket protein uttrykk nivåer, som gjør det mulig for dynamiske endringer i GCaMP fluorescens for å registrere Ca2 + aktivitet. Mange faktorer bestemmer hvor raskt og effektivt en AAV vil uttrykke sin last, hvorav mye er utenfor omfanget av denne metoden, men kort er det viktig å vurdere arrangøraktivitet og hastigheten som lastproteinet modnes og bretter seg.
En annen fordel med metoden er at den gir betydelig fleksibilitet i format, uttrykksvektorer, bruk av bildeutstyr og utvalget av vitenskapelige spørsmål som kan tas opp. I tillegg gjør metoden det mulig å granske et bredt spekter av spesifikke spørsmål som omgir glutamat-mediert spenning i PD, og andre modeller av nervesystemet dysfunksjon. Glutamat-mediert eksitoksisitet innebærer for eksempel flere reseptorer og signaliserer kaskader5. Ved å bruke metoden, og som demonstrert med AMPAR-blokkeringen, NBQX i figur 1,er det mulig å dissekere ut spesifikke komponenter i den eksoksiske glutamatresponsen på fysiologisk og molekylært nivå. Tenkelig, en lignende tilnærming ved hjelp av hemmere av andre messenger systemer kan brukes til å bestemme deres bidrag til excitotoxicity. I tillegg kan AAVs som brukes her tilpasses for å uttrykke GECIer med cellespesifikke arrangører eller AAV-uttrykte optogenetiske sensorer som kan brukes til å måle andre parametere som nevrotransmitterutgivelse.
Bortsett fra primære embryonale disseksjoner og konokkal avbildning, bruker mye av protokollen grunnleggende laboratorieferdigheter som ikke krever spesialisert opplæring. Derfor inkluderer begrensningene til modellen vanskeligheten med den embryonale disseksjonsteknikken, hvor lenge cellene må dyrkes for å nå modenhet, og tilgang til et konokkalt mikroskop eller lignende bildeapparat. De mange fordelene og fleksibiliteten ved metoden oppveier disse begrensningene, noe som gjør dette til en ideell modell for å studere rollen glutamat-mediert excitotoxicity i nervesystemet lidelser. Til slutt kan denne modellen være et effektivt verktøy for å screene nye forbindelser for anti-apoptotiske effekter og deres evne til å bevare DA neuron helse.

Parkinsons sykdom (PD) er den nest vanligste nevrodegenerative lidelsen over hele verden, uten kjent kur. Estimater tyder på at PD-utbredelsen vil fortsette å øke og forventes å overgå 1 million diagnoser innen år 2030 i USA alene1. Med få effektive behandlinger som for tiden er tilgjengelige for å bekjempe PD, er det et presserende behov for å utvikle mer effektive terapier. PD er preget av et raskt og progressivt tap av midbrain dopamin (DA) nevroner2. Mekanismene som ligger til grunn for nevrodegenerasjon i PD er dårlig forstått. Bevis tyder på en sannsynlig konvergens av flere mekanismer, som oksidativt stress og mitokondriedysfunksjon, etc. som bidrar til initiering av apoptotiske signalkaskader og eventueltcelledød 3.
En slik konvergent mekanisme, glutamat-mediert excitotoxicity har vært innblandet i flere nevrodegenerative sykdommer, inkludert PD4. Mens glutamat-mediert excitotoxicity antas å fungere hovedsakelig gjennom stimulering av NMDA reseptorer via en overdreven økning i intracellulær Ca2 + konsentrasjon og eventuell initiering av apoptose, Ca2 +-permeable AMPA reseptorer har også vært innblandet i eksoksikoksiøs respons5,6,7. Derfor er det av interesse å bestemme bidraget fra AMPA-reseptorer til glutamat-mediert apoptose i en PD-modell. Dette kan oppnås ved hjelp av NBQX, en AMPA og kainate blokkering, som ved mikromolarkonsentrasjoner er selektiv for AMPAreseptorer 8. Glutamat-mediert excitotoxicity og apoptotiske signalkaskader er et ideelt nedstrøms mål for å måle omfanget av celledød, og et potensielt mål for terapeutisk intervensjon. Derfor, utvikle en høyinnhold metode for å vurdere glutamat-mediert modulering av kalsiumaktivitet og tilhørende nedstrøms signalering i primære ventral mesencephalic (VM) nevroner ville være verdifull for screening nye behandlingsmetoder på deres evne til å bevare nevronal helse.
Her har vi utviklet en protokoll der vi uttrykker den genetisk kodede kalsiumindikatoren (GECI), GCaMP6f, ved hjelp av AAV2/5 med den menneskelige synapsin (hSyn) promotor for å måle Ca2 + aktiviteten til mus VM primære nevroner som svar på glutamat applikasjon som kan måles på fysiologisk og molekylært nivå. Denne høyinnholdsscreeningen kan tilpasses for å oppdage legemidler eller behandlinger som modulerer Ca2 + aktivitet for å bevare helsen til VM-nevroner. Vi foreslår at denne primære kulturmodellen er en effektiv måte å screene for nye PD-intervensjoner, basert på deres evne til å bevare helsen til VM-nevroner og redusere utviklingen av PD.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Formalin/PBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100496-506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X NA 0.3 water-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UMPLFLN10XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm circular cover glass No. 1</td>
			<td>Phenix Research Products</td>
			<td>MS20-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X NA 0.85 oil-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO20XO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm uncoated plastic cell culture dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X NA 0.3 water-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LUMPLFLN40XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X NA 1.35 oil-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO60XO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin (sodium)</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>A-301-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td>50x stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binolcular Microscope</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>KSCXTS-1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2), anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (DNase)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose, andydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RDD016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM + GlutaMAX medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10569010</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equine serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26050088</td>
			<td>heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Illuminator, 100V</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>KSC5410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System, PES 22UM 250ML</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28199-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoview 1000 confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoview 1200 confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-chicken Alexa Fluor 594</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-rabbit Alexa Fluor 594</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks-balanced Salt Solution (HBSS) 1x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14175095</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101170-478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeraCell 150 CO2 incubator</td>
			<td>Heraeus (ThermoFisher)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ v1.52e</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS-Fine Scissors (Round Type)-S/S Str/31*8mm/13cm</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S12014-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>K-120-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2), andydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPII Mini-Peristaltic Pump, 115/230 VAC, 50/60 Hz</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MULLER Micro Forceps-Str, 0.15mm Tips, 11cm</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11014-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBQX</td>
			<td>Hello Bio</td>
			<td>HB0443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (NGS)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin 2020</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>100837-AAV1</td>
			<td>Titer: 1.00E+13 gc/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington Biomedical Corporation</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010049</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl), anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head Tubing Pieces For MPII</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>55-4148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal anti-caspase-3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl), anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>BioXtra, &#8805;99.5% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-pregnant female C57BL/6 mice</td>
			<td>Texas A&#38;M Institue for Genomic Medicine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-bore blue pipette tips P1000</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83007-380</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying spontaneous ca2+ fluxes and their downstream effects in primary mouse midbrain neurons

Parkinsons sykdom (PD) er en ødeleggende nevrodegenerativ lidelse forårsaket av degenerasjon av dopaminerge (DA) nevroner. Overdreven Ca2 + tilstrømning på grunn av unormal aktivering av glutamatreseptorer resulterer i DA excitotoxicity og har blitt identifisert som en viktig mekanisme for DA neuron tap. I denne studien isolerer vi, dissosierer og kultur midbrain nevroner fra musen ventral mesencephalon (VM) av ED14 mus embryoer. Vi smitter deretter de langsiktige primære musemidbrainkulturene med et adeno-assosiert virus (AAV) som uttrykker en genetisk kodet kalsiumindikator, GCaMP6f under kontroll av den menneskelige nevronspesifikke synapsinarrangøren, hSyn. Ved hjelp av live confocal imaging viser vi at kultiverte musemidbrainnevroner viser spontane Ca2 + flukser oppdaget av AAV-hSyn-GCaMP6f. Bath anvendelse av glutamat til midbrain kulturer forårsaker unormale økninger i intracellulær Ca2 + i nevroner og dette er ledsaget av caspase-3 aktivering i DA nevroner, som demonstrert ved immunostaining. Teknikkene for å identifisere glutamat-mediert apoptose i primær mus DA nevroner har viktige anvendelser for høyt innhold screening av legemidler som bevarer DA neuron helse.

Etter første dyrking av celler, behandlet vi VM kultur retter på 14 DIV med 1 μL AAV hSyn-GCaMP6f og tillatt for 5 dager med viraluttrykk. På dagen for avbildning hepes opptak buffer ble utarbeidet frisk. Vi brukte to forhold; i en tilstand 20 μM glutamat ble påført i 10 min, mens i den andre tilstanden 5 min av 10 μM NBQX søknad forut for en 10 min co-applikasjon av 10 μM NBQX + 20 μM glutamat. Under begge forhold observerte vi heterogene og spontane endringer i GCaMP6f fluorescens, noe som indikerer spontan Ca2 + flukser, som vist i de representative sporene (Figur 1A, B, Supplerende Film 1-2). Anvendelse av 20 μM glutamat genererte en robust og vedvarende Ca2 + respons i både spontant aktive og quiescent nevroner (Figur 1A, Supplerende Movie 1). Påføring av 10 μM NBQX redusert spontan aktivitet, og delvis blokkert glutamat respons (Figur 1B, Supplerende Movie 2). I hvilken grad glutamatsøknad stimulerte en Ca2 + respons i hver tilstand ble kvantifisert ved hjelp av området under kurven, topp amplitude og ventetid for å svare. Begge områder under kurven og maksimal amplitude var like for både glutamat og NBQX + glutamat behandlede forhold (figur 1C), mens ventetiden til respons ble betydelig økt i NBQX + glutamat tilstand (figur 2A, B). I tillegg til å kvantifisere Ca2+ respons på glutamatbehandling, fikset og farget vi prøver med et anti-caspase-3 antistoff som et mål på glutamatmediert apoptose. Vi observerte en rekke caspase-3 aktivering på tvers av forholdene (Figur 3A, B). Caspase-3 aktivering ble kvantifisert ved måleområde og gjennomsnittlig caspase-3 intensitet. Sammenlignet med ubehandlede kontrollceller, det gjennomsnittlige området av celler med caspase-3 aktivering under glutamat og NBQX + glutamat forhold trended mot betydning (Figur 3B). Gjennomsnittlig caspase-3 intensitet var signifikant høyere i glutamat og NBQX + glutamat forhold sammenlignet med ubehandlede kontroller (figur 3B). Sammen viser disse resultatene et rammeverk med høyt innhold der apoptose av nevroner kan måles ved å kvantifisere Ca2 + svar på eksoksikotiske midler og følges opp med en analyse av nedstrøms apoptotiske hendelser som caspase-3 aktivering i samme sett med kulturer.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig01.jpg"> Figur 1: Kultiverte ventrale mesencephalic nevroner viser spontan Ca2 + aktivitet og stimuleres robust av glutamat applikasjon. (A)Representative spor av spontan Ca2 + aktivitet i VM nevroner og deres respons på 20 μM Glutamat søknad. (B)Representative spor av spontan Ca2 + aktivitet i VM nevroner og deres respons på 10 μM NBQX + 20 μM Glutamat søknad. (C) Befolkningsdata som viser område under kurven og maksimal amplitude på Ca2 + spor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig01large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig02v3.jpg"> Figur 2: AMPAR-blokade med NBQX forsinker respons på glutamatapplikasjon i kultiverte ventrale mesencephalic nevroner. (A)Representant Ca2 + spor av glutamat (grå) og NBQX + glutamat (blå) fremkalte svar. Gjennomsnittlig Ca2 + spor av glutamat (svart) og NBQX + glutamat (rød) er vist overlaid. (B)Befolkningsdata som viser ventetid til respons for glutamat og NBQX + glutamat fremkalte responser. Prosentvis endring mellom glutamat og NBQX + glutamatforhold vises i høyre panel. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig02v3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig03v3.jpg"> Figur 3: Glutamatapplikasjon øker caspase-3-uttrykket i tyrosinhydroksylase (TH) positive ventrale mesencephalic nevroner. (A) Representative konfokale bilder av VM kulturer immunostained for caspase-3 (grønn) og TH (rød), skala bar = 10 μm. (B) Befolkningsdata som viser DA neuron område og gjennomsnittlig grå verdi av caspase-3 uttrykk i hver tilstand. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig03v3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Supplerende film 1: Spontan Ca2 + aktivitet og respons på glutamat søknad. Spontan Ca2 + flukser i nærvær av HEPES-opptaksbuffer (0-300 s) etterfulgt av påføring av 20 μM glutamat (301-600 s). Scale bar = 50 μm. Vennligst <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61481/Supplementary_Movie%201_glutamate_ver_2.avi" target="_blank">klikk her for å laste ned denne videoen.</a>
Supplerende film 2: Spontan Ca2+ aktivitet og respons på NBQX + glutamatapplikasjon. Spontan Ca2 + flukser i nærvær av HEPES-opptaksbuffer (0-300 s) etterfulgt av påføring av 10 μM NBQX (301-600 s) og 10 μM NBQX + 20 μM glutamat (601-900 s). Scale bar = 50 μm. Vennligst <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61481/Supplementary_Movie_2_NBQX_glut.avi" target="_blank">klikk her for å laste ned denne videoen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons at JoVE.com

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Her presenterer vi en protokoll for å måle in vitro Ca2 + fluxes i midbrain nevroner og deres nedstrøms effekter på caspase-3 ved hjelp av primær mus midbrain kulturer. Denne modellen kan brukes til å studere patofysiologiske endringer knyttet til unormal Ca2 + aktivitet i midbrain nevroner, og for å screene nye terapeutiske midler for anti-apoptotiske egenskaper.

Kvantifisere Spontan Ca2 + Fluxes og deres nedstrøms effekter i primær mus midbrain nevroner

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx ...

Denne protokollen kvantifiserer kalsiumflukser i dopaminerge nevroner, som går tapt ved Parkinsons sykdom. Dette er nyttig for å forstå hvordan unormal kalsium forårsaker dopaminerge neuron tap i Parkinsons sykdom. For første gang demonstrerer vi spontane kalsiumflukser i kultiverte primære midbrainnevroner.Denne metoden kan brukes til å dissekere spesifikke reseptorbidrag involvert i kalsiummediert apoptose. Vår metode gir en vei for høyinnholdsmedisinskjermer for å oppdage spesifikke og effektive nevrobeskyttende forbindelser for Parkinsons sykdom. Disse nevrobeskyttende forbindelsene ville forhindre kalsiummediert apoptose i dopaminerge nevron.Begynn med å forberede en milliliter serumfri DMEM medium med en mikroliter hSyn-GCaMP6f AAV per tallerken. Aspirer cellekulturmediet fra hver tallerken og erstatt det med en milliliter av den tilberedte DMEM med hSyn-GCaMP6f. Plasser rettene tilbake i 37 grader Celsius inkubator i en time.Etter inkubasjonen aspirerer mediet med AAVer og erstatter det med tre milliliter cellekulturmedium. Inkuber oppvasken ved 37 grader Celsius i fem til syv dager. Endre mediet hver to til tre dager gjennom hele denne perioden med virusinfeksjon.Forbered en liter HEPES-opptaksbuffer, 200 milliliter 20 mikromate glutamatopptaksbuffer, og 200 milliliter med 10 mikromolar NBQX-opptaksbuffer i henhold til manuskriptretninger. Fyll en steril 35 millimeter petriskål med tre milliliter av opptaksbufferen. Ta Petri parabolen med de infiserte kulturer fra inkubatoren, deretter nøye ta kanten av ett deksel slip med fine tips tang og overføre den inn i parabolen med opptaksbufferen.Plasser det gjenværende dekselet slip i medium tilbake i 37 grader Celsius inkubator og transportere parabolen med opptaksbuffer til konfokal mikroskop. Start bildeprogramvaren. Mens den initialiserer, starter du den peristaltiske pumpen og plasserer linjen i opptaksbufferen.Kalibrer deretter strømmen til to milliliter per minutt. Overfør det infiserte dekselet fra petriskålen til opptaksbadet med fine tang. Ved hjelp av 10X vann nedsenking mål og brightfield lys, finne planet av fokus og se etter en region med en høy tetthet av nevron celle legemer, deretter bytte til 40X målet og refokusere prøven.Velg og bruk AlexaFluor 488 i fargestoffer listevinduet. For å forhindre overeksponering og fotobleking av fluoroforene, start med lave HV- og laserstrøminnstillinger. For AlexaFluor 488-kanalen setter du HV til 500, forsterkning til 1x og forskyvningen til null.Sett kraften til 5 %for 488-laserlinjen. Øk pinholestørrelsen til 300 mikrometer og bruk fokus x2-skannealternativet til optimalt å justere utslippssignaler til undermetningsnivåer. Innstillingene kan deretter justeres for optimal synlighet for hver kanal.Når mikroskopinnstillingene er optimalisert, flytter du scenen for å finne et område med flere celler som viser spontane endringer i GCaMP6f fluorescens og fokuserer på ønsket plan for avbildning. Bruk klipstverktøyet til å feste bilderammen til en størrelse som kan oppnå et rammeintervall på i underkant av ett sekund. Sett intervallvinduet til en verdi på 1,0 og Num-vinduet til 600.Hvis du vil ta opp en t-seriefilm, velger du alternativet Tid og bruker deretter alternativet Xyt-skanning til å begynne å bilde. Se fremdriftslinjen for bildebehandling og flytt linjen fra HEPES-opptaksbufferen til den 20 mikromate glutamatopptaksbufferen på riktig tidspunkt. Når bildet er fullført, velger du serien ferdig-knappen og lagrer den ferdige t-seriefilmen.Fortsett å perfuse glutamat i ytterligere fem minutter slik at kulturen av nevroner har blitt utsatt for glutamat i totalt 10 minutter. Gjenta denne prosessen for hver følgeseddel som skal avbildes. Det er mulig å se kalsiumspor og nevronale cellelegemer umiddelbart etter eksperimentet.Bruk Ellipse-verktøyet til å tegne ønsket antall ROIer rundt nevronal soma. Og bruk Serieanalyse-knappen til å visualisere sporene. Etter ytterligere fem minutters eksponering for glutamat, fjern dekselet slip fra badekaret med fine tang og plasser den tilbake i Petri parabolen med opptaksbufferen til all bildebehandling er fullført.På dagen for avbildning ble VM-kulturene behandlet med enten glutamat eller en kombinasjon av glutamat og NBQX. Under begge forhold ble heterogene og spontane endringer i GCaMP6f florescence observert som indikerer spontan kalsiumfluks. Påføring av glutamat genererte en robust og vedvarende kalsiumrespons hos både spontant aktive og quiescent nevroner.Bruk av NBQX redusert spontan aktivitet, og delvis blokkert glutamat respons. I hvilken grad glutamatsøknad stimulerte en kalsiumrespons i hver tilstand ble kvantifisert ved hjelp av området under kurven, maksimal amplitude og ventetid for å svare. Ventetiden til respons økte under NBQX og glutamat tilstand.For å måle glutamat-mediert apoptose, cellene ble løst og farget med en anti-Caspase-3 antistoff. Gjennomsnittlig caspase-3 intensitet var signifikant høyere i begge behandlingsforhold sammenlignet med ubehandlede kontroller. En grundigere analyse av opphisset giftig celledød kan gjøres ved å telle antall immunotain tyrosinhydroksylasepositive dopaminerge nevroner i kontroll og glutamatbehandlet tilstand.Denne teknikken har banet vei for å forstå de relative bidragene fra forskjellige reseptorer og jernkanaler involvert i kalsiummediert apoptose i dopaminerge nevron.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Kalsium Fosfat Transfection of Primary hippocampus nevroner

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Primær Culture of Mouse dopaminerge nevroner

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

Miljø modulasjoner av antall midthjernen dopaminneuroner i voksen Mus

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescens og Bioluminesens Imaging av subcellulære Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; I Aged hippocampus nevroner

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modellering Neuronal død og forverring av musen primære lillehjernen Granule nerveceller

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Live bilder av GLUT4 Protein menneskehandel musen primære hypothalamus nevroner bruker Deconvolution mikroskopi

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Rask og spesifikk Immunomagnetic isolasjon av musen primære Oligodendrocytes

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualisere Axonal vekst kjegle kollaps og tidlig Amyloid β effekter i kulturperler musen nerveceller

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...