Name: quantifying spontaneous ca2+ fluxes and their downstream effects in primary mouse midbrain neurons
Uploaded: 2020-09-09T14:00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons at JoVE.com

Apoyado por subvenciones de la Asociación Americana de Enfermedad de Parkinson (APDA) y NIH R01NS115809-01 a RS. Agradecemos al Instituto texas A&M de Medicina Genómica (TIGM) por proporcionar ratones embarazadas cronomeptados para generar cultivos dopaminérgicos primarios.

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	<li>Marras, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+Parkinson's+disease+across+North+America.">Prevalence of Parkinson's disease across North America.</a> NPJ Parkinson's Disease. 4, 21 (2018).</li><li>Poewe, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson+disease.">Parkinson disease.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013 (2017).</li><li>Mehta, A., Prabhakar, M., Kumar, P., Deshmukh, R., Sharma, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxicity:+bridge+to+various+triggers+in+neurodegenerative+disorders.">Excitotoxicity: bridge to various triggers in neurodegenerative disorders.</a> European Journal of Pharmacology. 698 (1-3), 6-18 (2013).</li><li>Ambrosi, G., Cerri, S., Blandini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+further+update+on+the+role+of+excitotoxicity+in+the+pathogenesis+of+Parkinson's+disease.">A further update on the role of excitotoxicity in the pathogenesis of Parkinson's disease.</a> Journal of Neural Transmission (Vienna). 121 (8), 849-859 (2014).</li><li>Dong, X. X., Wang, Y., Qin, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+excitotoxicity+and+their+relevance+to+pathogenesis+of+neurodegenerative+diseases.">Molecular mechanisms of excitotoxicity and their relevance to pathogenesis of neurodegenerative diseases.</a> Acta Pharmaceutica Sinica B. 30 (4), 379-387 (2009).</li><li>Vieira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxicity+through+Ca2+-permeable+AMPA+receptors+requires+Ca2+-dependent+JNK+activation.">Excitotoxicity through Ca2+-permeable AMPA receptors requires Ca2+-dependent JNK activation.</a> Neurobiology of Disease. 40 (3), 645-655 (2010).</li><li>Sebe, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)-Permeable+AMPARs+Mediate+Glutamatergic+Transmission+and+Excitotoxic+Damage+at+the+Hair+Cell+Ribbon+Synapse.">Ca(2+)-Permeable AMPARs Mediate Glutamatergic Transmission and Excitotoxic Damage at the Hair Cell Ribbon Synapse.</a> Journal of Neuroscience. 37 (25), 6162-6175 (2017).</li><li>Brickley, S. G., Farrant, M., Swanson, G. T., Cull-Candy, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNQX+increases+GABA-mediated+synaptic+transmission+in+the+cerebellum+by+an+AMPA/kainate+receptor-independent+mechanism.">CNQX increases GABA-mediated synaptic transmission in the cerebellum by an AMPA/kainate receptor-independent mechanism.</a> Neuropharmacology. 41 (6), 730-736 (2001).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smoking-Relevant+Nicotine+Concentration+Attenuates+the+Unfolded+Protein+Response+in+Dopaminergic+Neurons.">Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).</li><li>Henley, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+Identification+of+Living+Dopaminergic+Neurons+in+Midbrain+Cultures+Using+RNA+Sequencing+and+TH-promoter-driven+eGFP+Expression.">Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e54981 (2017).</li><li>Douhou, A., Troadec, J. D., Ruberg, M., Raisman-Vozari, R., Michel, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+promotion+of+mesencephalic+dopaminergic+neurons+by+depolarizing+concentrations+of+K++requires+concurrent+inactivation+of+NMDA+or+AMPA/kainate+receptors.">Survival promotion of mesencephalic dopaminergic neurons by depolarizing concentrations of K+ requires concurrent inactivation of NMDA or AMPA/kainate receptors.</a> Journal of Neurochemistry. 78 (1), 163-174 (2001).</li><li>Lavaur, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+noble+gas+xenon+provides+protection+and+trophic+stimulation+to+midbrain+dopamine+neurons.">The noble gas xenon provides protection and trophic stimulation to midbrain dopamine neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 142 (1), 14-28 (2017).</li><li>Kritis, A. A., Stamoula, E. G., Paniskaki, K. A., Vavilis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Researching+glutamate+-+induced+cytotoxicity+in+different+cell+lines:+a+comparative/collective+analysis/study.">Researching glutamate - induced cytotoxicity in different cell lines: a comparative/collective analysis/study.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 91 (2015).</li><li>Gupta, K., Hardingham, G. E., Chandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-dependent+glutamate+excitotoxicity+in+human+embryonic+stem+cell-derived+neurons.">NMDA receptor-dependent glutamate excitotoxicity in human embryonic stem cell-derived neurons.</a> Neuroscience Letters. 543, 95-100 (2013).</li><li>Surmeier, D. J., Obeso, J. A., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+neuronal+vulnerability+in+Parkinson+disease.">Selective neuronal vulnerability in Parkinson disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (2), 101-113 (2017).</li><li>Ramirez, J. M., Tryba, A. K., Pena, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacemaker+neurons+and+neuronal+networks:+an+integrative+view.">Pacemaker neurons and neuronal networks: an integrative view.</a> Current Opinion in Neurobiology. 14 (6), 665-674 (2004).</li><li>Guzman, J. N., Sanchez-Padilla, J., Chan, C. S., Surmeier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+pacemaking+in+substantia+nigra+dopaminergic+neurons.">Robust pacemaking in substantia nigra dopaminergic neurons.</a> Journal of Neuroscience. 29 (35), 11011-11019 (2009).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Describimos un sistema de cultivo celular mesencéfalo (VM) primario a largo plazo para el análisis de alto contenido de apoptosis mediada por glutamato en las neuronas. Los estudios han empleado cultivos dopaminérgicos primarios de cerebro medio para dilucidar los mecanismos excitotóxicos en el contexto de los modelos de DP11,12. En este estudio, empleamos un enfoque combinatorio utilizando Indicadores de Calcio Genéticamente Codificados (GECI) para medir la actividad de Ca2+ y asociar aún más esta actividad con cambios moleculares posteriores, como el inicio de cascadas de señalización apoptótica4. El método tiene múltiples ventajas para otros sistemas de cultivo celular similares. Como tenemos especial interés en la excitotoxicidad en el contexto de la enfermedad de Parkinson, el uso de cultivos celulares de VM primarias es ideal. Mediante el uso de diferentes técnicas de reubicación de campo, como cubreobjetos cuadriculados o una etapa motorizada del microscopio XY combinada con inmunosutención TH, podemos estudiar directamente los efectos específicos del tipo de célula de la apoptosis mediado con glutamato en las neuronas ventrales de cerebro medio. Además, el modelo de cultivo celular de 3 semanas permite que las neuronas desarrollen su perfil molecular completo y maduro, reflejando las neuronas adultas del DA9. Los métodos anteriores se han centrado principalmente en los cambios moleculares tras la excitotoxicidad mediada por glutamato13,14. El modelo es único en su capacidad para correlacionar cambios agudos en la fisiología neuronal con eventos moleculares posteriores en tipos celulares identificados. Una limitación del modelo de cultivo primario es que la técnica de disección captura todo el cerebro medio ventral, incluyendo DA y las neuronas GABAérgicas, así como las neuronas de la CS y VTA. La evidencia ahora sugiere que las neuronas DA de la SC tienen vulnerabilidad selectiva al calcio y eventual muerte celular en comparación con las neuronas DA de la vecina VTA15. Desafortunadamente, la diferenciación de SNc de las neuronas VTA en cultivos embrionarios ha resultado difícil con pocos puntos de referencia anatómicos para definir estas estructuras en el cerebro embrionario.
Demostramos que la técnica de cultivo primario permite cuantificar la actividad espontánea heterogénea de Ca2+ (Figura 1). Por lo tanto, este es un modelo de sistema de cultivo celular ideal para estudiar las células activas tonónicamente, como las neuronas dopaminérgicas de marca de ritmo del cerebro medio, las neuronas neocorticales, y las neuronas GABAérgicas del núcleo supraquiasmático (SCN)16,,17. En la mayoría de las aplicaciones, las imágenes Ca2+ no logran la misma resolución temporal que la electrofisiología. Por lo tanto, es probable que un solo evento de Ca2+ sea análogo a una ráfaga de potenciales de acción neuronal. Esto puede interpretarse en el punto de cual significa que las imágenes de Ca2+ permiten medidas relativamente precisas de la actividad de estallido anormal en las células de marca de ritmo y, por lo tanto, es apropiada para una pantalla de alto contenido de muerte celular excitotóxica mediada de Ca2+.
Para lograr y mantener la actividad espontánea de Ca2+, es importante abordar dos puntos clave en el protocolo. En primer lugar es la densidad de chapado de las células después de la disección. Para las neuronas VM primarias, estudios previos han utilizado alrededor de 100.000 células/cm29,10. Hemos adaptado el protocolo para placar una densidad de 200.000 células/cm2,lo que crea un rango heterogéneo de actividad espontánea y aumenta el número de neuronas VM dopaminérgicas presentes en cada cubierta. Dado que las diferentes neuronas de marcapasos tienen propiedades de disparo distintas16, la densidad de chapado debe ser personalizada al tipo de célula que se está estudiando y optimizando con el fin de lograr niveles ideales de actividad espontánea. En segundo lugar, el tiempo de incubación después de la infección viral de los AAV. Al igual que la densidad de chapado, esto dependerá del contexto específico de la pregunta de investigación y el tipo de AAV que se utiliza. Para el AAV específico utilizado aquí, 5 días de incubación después de la infección viral es ideal para lograr los niveles deseados de expresión de proteínas, lo que permite cambios dinámicos en la fluorescencia GCaMP con el fin de registrar la actividad de Ca2+. Muchos factores determinan la rapidez y eficiencia con la que un AAV expresará su carga, gran parte de la cual está fuera del alcance de este método, pero brevemente, es importante considerar la actividad promotora y la velocidad a la que la proteína de carga madura y se pliega.
Otra ventaja del método es que permite una flexibilidad considerable en el formato, los vectores de expresión, el uso de equipos de imágenes y la gama de cuestiones científicas que se pueden abordar. Además, el método permite la investigación de una amplia gama de preguntas específicas que rodean la excitotoxicidad mediada por glutamato en la DP, y otros modelos de disfunción del sistema nervioso. Por ejemplo, la excitotoxicidad mediada por glutamato implica múltiples receptores y cascadas de señalización5. Mediante el uso del método, y como se demuestra con el bloqueador AMPAR, NBQX en la Figura 1, es posible diseccionar componentes específicos de la respuesta glutamato excitotóxica a nivel fisiológico y molecular. Concebiblemente, un enfoque similar utilizando inhibidores de los segundos sistemas de mensajería podría utilizarse para determinar su contribución a la excitotoxicidad. Además, los AAV utilizados aquí podrían adaptarse para expresar los GECI con promotores específicos de la célula o sensores optogenéticos expresados por AAV que podrían utilizarse para medir otros parámetros como la liberación de neurotransmisores.
Aparte de las disecciones embrionarias primarias y las imágenes confocales, gran parte del protocolo utiliza habilidades básicas de laboratorio que no requieren entrenamiento especializado. Por lo tanto, las limitaciones al modelo incluyen la dificultad de la técnica de disección embrionaria, el tiempo que las células deben ser cultivadas para alcanzar la madurez, y el acceso a un microscopio confocal, o un aparato de imagen similar. Los muchos beneficios y flexibilidad del método superan estas limitaciones, lo que hace de este un modelo ideal para estudiar el papel de excitotoxicidad mediada por glutamato en trastornos del sistema nervioso. Por último, este modelo podría ser una herramienta eficaz para la pantalla de compuestos nuevos para efectos anti-apoptóticos y su capacidad para preservar la salud de las neuronas DA.

La enfermedad de Parkinson es el segundo trastorno neurodegenerativo más común en todo el mundo, sin cura conocida. Las estimaciones sugieren que la prevalencia de los datos sobre el rendimiento seguirá aumentando y se prevé que supere los 1 millón de diagnósticos para el año 2030 solo en los Estados Unidos1. Con pocos tratamientos eficaces disponibles actualmente para combatir la DP, existe una necesidad apremiante de desarrollar terapias más eficaces. La DP se caracteriza por una pérdida rápida y progresiva de las neuronas de dopamina de cerebro medio (DA)2. Los mecanismos que subyacen a la neurodegeneración en la DP no se entienden bien. La evidencia sugiere una convergencia probable de múltiples mecanismos, tales como estrés oxidativo y disfunción mitocondrial, etc. que contribuyen al inicio de cascadas de señalización apoptótica y eventual muerte celular3.
Uno de estos mecanismos convergentes, la excitotoxicidad mediada por glutamato ha estado implicada en múltiples enfermedades neurodegenerativas, incluyendo PD4. Mientras que la excitotoxicidad mediada por glutamato se piensa para trabajar principalmente a través de la estimulación de los receptores NMDA a través de un aumento excesivo en la concentración intracelular Ca2 + y el inicio eventual de la apoptosis, Ca2 +receptores AMPA permeables también han estado implicados en la respuesta excitotóxica5,6,7. Por lo tanto, es de interés determinar la contribución de los receptores AMPA a la apoptosis mediada por glutamato dentro de un modelo de DP. Esto se puede lograr utilizando NBQX, un bloqueador ampañedor y kainato, que a concentraciones micromolares es selectivo para los receptores AMPA8. La excitotoxicidad mediada por glutamato y las cascadas de señalización apoptótica son un objetivo descendente ideal para medir el alcance de la muerte celular y un posible objetivo de intervención terapéutica. Por lo tanto, el desarrollo de un método de alto contenido para evaluar la modulación mediada por glutamato de la actividad de calcio y la señalización posterior asociada en las neuronas mesencéfalas (VM) ventrales primarias sería valioso para la detección de nuevos métodos de tratamiento sobre su capacidad para preservar la salud neuronal.
Aquí, hemos desarrollado un protocolo en el que expresamos el indicador de calcio genéticamente codificado (GECI), GCaMP6f, utilizando AAV2/5 con la sinapsis humana (hSyn) promotor para medir la actividad Ca2+ de las neuronas primarias VM de ratón en respuesta a la aplicación de glutamato que se puede medir a nivel fisiológico y molecular. Este cribado de alto contenido se puede adaptar para descubrir productos farmacéuticos o tratamientos que modulan la actividad de Ca2+ para preservar la salud de las neuronas VM. Proponemos que este modelo de cultivo primario es una manera eficaz de detectar nuevas intervenciones de DP, basada en su capacidad para preservar la salud de las neuronas vm y mitigar la progresión de la DP.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Formalin/PBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100496-506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X NA 0.3 water-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UMPLFLN10XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm circular cover glass No. 1</td>
			<td>Phenix Research Products</td>
			<td>MS20-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X NA 0.85 oil-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO20XO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm uncoated plastic cell culture dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X NA 0.3 water-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LUMPLFLN40XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X NA 1.35 oil-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO60XO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin (sodium)</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>A-301-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td>50x stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binolcular Microscope</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>KSCXTS-1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2), anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (DNase)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose, andydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RDD016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM + GlutaMAX medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10569010</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equine serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26050088</td>
			<td>heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Illuminator, 100V</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>KSC5410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System, PES 22UM 250ML</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28199-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoview 1000 confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoview 1200 confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-chicken Alexa Fluor 594</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-rabbit Alexa Fluor 594</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks-balanced Salt Solution (HBSS) 1x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14175095</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101170-478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeraCell 150 CO2 incubator</td>
			<td>Heraeus (ThermoFisher)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ v1.52e</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS-Fine Scissors (Round Type)-S/S Str/31*8mm/13cm</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S12014-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>K-120-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2), andydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPII Mini-Peristaltic Pump, 115/230 VAC, 50/60 Hz</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MULLER Micro Forceps-Str, 0.15mm Tips, 11cm</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11014-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBQX</td>
			<td>Hello Bio</td>
			<td>HB0443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (NGS)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin 2020</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>100837-AAV1</td>
			<td>Titer: 1.00E+13 gc/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington Biomedical Corporation</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010049</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl), anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head Tubing Pieces For MPII</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>55-4148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal anti-caspase-3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl), anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>BioXtra, &#8805;99.5% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-pregnant female C57BL/6 mice</td>
			<td>Texas A&#38;M Institue for Genomic Medicine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-bore blue pipette tips P1000</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83007-380</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying spontaneous ca2+ fluxes and their downstream effects in primary mouse midbrain neurons

La enfermedad de Parkinson es un trastorno neurodegenerativo devastador causado por la degeneración de las neuronas dopaminérgicas (DA). La afluencia excesiva de Ca2+ debido a la activación anormal de los receptores de glutamato da lugar a la excitotoxicidad da y se ha identificado como un mecanismo importante para la pérdida de neuronas DA. En este estudio, aislamos, disociamos y cultivamos neuronas de cerebro medio del mesencéfalo ventral (VM) del ED14 embriones de ratón. Luego infectamos los cultivos primarios de cerebro medio del ratón primario a largo plazo con un virus asociado a la adeno (AAV) que expresa un indicador de calcio genéticamente codificado, GCaMP6f bajo el control del promotor de sinapsina específico de la neurona humana, hSyn. Usando imágenes confocales en vivo, mostramos que las neuronas cultivadas de ratón de cerebro medio muestran flujos espontáneos de Ca2+ detectados por AAV-hSyn-GCaMP6f. La aplicación de baño de glutamato a cultivos de cerebro medio causa elevaciones anormales en Ca2+ intracelulares dentro de las neuronas y esto se acompaña de la activación de la caspasa-3 en las neuronas DA, como lo demuestra la inmunostaining. Las técnicas para identificar la apoptosis mediada por glutamato en las neuronas primarias de DA de ratón tienen aplicaciones importantes para el cribado de alto contenido de fármacos que preservan la salud de las neuronas DA.

Después del cultivo inicial de las células, tratamos los platos de cultivo de VM a 14 DIV con 1 l de AAV hSyn-GCaMP6f y se permitió para 5 días de expresión viral. El día de la toma de imágenes, el búfer de grabación HEPES se preparó fresco. Usamos dos condiciones; en una condición se aplicó un glutamato de 20 m durante 10 min, mientras que en la otra condición se aplicaron 5 min de 10 m de aplicación NBQX precedió a una coaparación de 10 min de GLutamato NBQX + 20 m. En ambas condiciones, observamos cambios heterogéneos y espontáneos en la fluorescencia GCaMP6f, que indican flujos espontáneos de Ca2+, como se muestra en los rastros representativos(Figura 1A,B, Película Suplementaria 1-2). La aplicación de glutamato de 20 m generó una respuesta robusta y sostenida de Ca2+ tanto en neuronas espontáneamente activas como en reposo(Figura 1A, Película Suplementaria 1). La aplicación de 10 m NBQX redujo la actividad espontánea, y bloqueó parcialmente la respuesta del glutamato(Figura 1B, Película Suplementaria 2). La medida en que la aplicación de glutamato estimuló una respuesta de Ca2+ en cada condición se cuantificó utilizando el área bajo la curva, la amplitud máxima y la latencia para responder. Ambas áreas bajo la curva y la amplitud máxima fueron similares tanto para las condiciones tratadas con glutamato como para NBQX + glutamato(Figura 1C),mientras que la latencia a la respuesta se incrementó significativamente en la condición NBQX + glutamato (Figura 2A,B). Además de cuantificar la respuesta de Ca2+ al tratamiento con glutamato, fijamos y manchamos muestras con un anticuerpo anti-caspasa-3 como medida de apoptosis mediada por glutamato. Hemos observado una gama de activación de caspase-3 en todas las condiciones(Figura 3A,B). La activación de Caspase-3 se cuantificó midiendo el área y la intensidad media de la caspasa-3. En comparación con las células de control no tratadas, el área media de las células con activación de la caspasa-3 bajo glutamato y NBQX + condiciones de glutamato tendencia hacia la importancia (Figura 3B). La intensidad media de la caspasa-3 fue significativamente mayor en las condiciones de glutamato y NBQX + glutamato en comparación con los controles no tratados(Figura 3B). Juntos, estos resultados demuestran un marco de alto contenido en el que la apoptosis de las neuronas se puede medir cuantificando las respuestas de Ca2+ a los agentes excitotóxicos y se realiza un seguimiento con un análisis de eventos apoptóticos posteriores como la activación de la caspasa-3 en el mismo conjunto de cultivos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig01.jpg"> Figura 1: Las neuronas mesencéfalas ventrales cultivadas muestran actividad espontánea de Ca2+ y son fuertemente estimuladas por la aplicación de glutamato. (A) Rastros representativos de la actividad espontánea de Ca2+ en las neuronas VM y su respuesta a la aplicación de glutamato de 20 M. (B) Rastros representativos de la actividad espontánea de Ca2+ en las neuronas VM y su respuesta a la aplicación de glutamato NBQX + 20 m de 10 M. (C) Datos de población que muestran el área bajo la curva y la amplitud de pico de las trazas de Ca2+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig02v3.jpg"> Figura 2: Bloqueo AMPAR con NBQX retrasa la respuesta a la aplicación de glutamato en neuronas mesencéfalas ventrales cultivadas. (A) El Representante Ca2+ trazas de glutamato (gris) y NBQX + glutamato (azul) evocaron respuestas. Promedio Ca2+ trazas de glutamato (negro) y NBQX + glutamato (rojo) se muestran superpuestas. (B) Datos de población que muestran latencia a la respuesta para glutamato y NBQX + glutamato evocado respuestas. El porcentaje de cambio entre las condiciones de glutamato y NBQX + glutamato se muestra en el panel derecho. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig02v3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig03v3.jpg"> Figura 3: Aplicación de glutamato aumenta la expresión de caspasa-3 en las neuronas mesencéfalas ventrales positivas de tirosina (TH). (A) Imágenes confocales representativas de cultivos de VM inmunotenidos para caspasa-3 (verde) y TH (rojo), barra de escala a 10 m. (B) Datos de población que muestran el área de la neurona DA y el valor gris medio de la expresión de caspasa-3 en cada condición. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig03v3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Película Suplementaria 1: Actividad espontánea de Ca2+ y respuesta a la aplicación de glutamato. Flujos espontáneos de Ca2+ en presencia de tampón de grabación HEPES (0-300 s) seguido de la aplicación de glutamato de 20 m (301-600 s). Barra de escala de 50 m. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61481/Supplementary_Movie%201_glutamate_ver_2.avi" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este vídeo.</a>
Película Suplementaria 2: Actividad espontánea de Ca2+ y respuesta a la aplicación NBQX + glutamato. Flujos espontáneos de Ca2+ en presencia de búfer de grabación HEPES (0-300 s) seguido de la aplicación de 10 m NBQX (301-600 s), y 10 m de GLutamato NBQX + 20 m (601-900 s). Barra de escala de 50 m. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61481/Supplementary_Movie_2_NBQX_glut.avi" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este vídeo.</a>

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Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Aquí presentamos un protocolo para medir los flujos in vitro ca2+ en las neuronas de cerebro medio y sus efectos aguas abajo en la caspasa-3 utilizando cultivos primarios de cerebro medio ratón. Este modelo se puede emplear para estudiar los cambios fisiopatológicos relacionados con la actividad anormal de Ca2+ en las neuronas de cerebro medio, y para detectar nuevas terapias en busca de propiedades anti-apoptóticas.

Cuantificación de los flujos espontáneos de Ca2+ y sus efectos aguas abajo en las neuronas primarias de cerebro medio de ratón

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx ...

Este protocolo cuantifica los flujos de calcio en las neuronas dopaminérgicas, que se pierden en la enfermedad de Parkinson. Esto es útil para entender cómo el calcio anormal causa la pérdida de neuronas dopaminérgicas en la enfermedad de Parkinson. Por primera vez, demostramos flujos espontáneos de calcio en las neuronas primarias cultivadas de cerebro medio.Este método se puede utilizar para diseccionar las contribuciones específicas de los receptores implicadas en la apoptosis mediada por calcio. Nuestro método proporciona una vía para las pantallas de fármacos de alto contenido para descubrir compuestos neuroprotectores específicos y eficaces para la enfermedad de Parkinson. Estos compuestos neuroprotectores evitarían la apoptosis mediada por calcio en la neurona dopaminérgica.Comience preparando un mililitro de medio DMEM sin suero con un microlitro de AAV hSyn-GCaMP6f por plato. Aspirar el medio de cultivo celular de cada plato y reemplazarlo por un mililitro del DMEM preparado con hSyn-GCaMP6f. Coloque los platos de nuevo en la incubadora de 37 grados Centígrados durante una hora.Después de la incubación, aspirar el medio con AAVs y reemplazarlo por tres mililitros de medio de cultivo celular. Incubar los platos a 37 grados centígrados durante cinco a siete días. Cambiar el medio cada dos o tres días a lo largo de este período de infección viral.Prepare un litro del tampón de grabación HEPES, 200 mililitros de 20 tampones de grabación de glutamato micromolar y 200 mililitros de búfer de grabación NBQX de 10 micromolares según las instrucciones del manuscrito. Llene una placa estéril de 35 milímetros de Petri con tres mililitros del tampón de grabación. Tome el plato de Petri con los cultivos infectados de la incubadora, luego agarre cuidadosamente el borde de un resbalón de cubierta con fórceps de punta fina y transfiéralo al plato con el tampón de grabación.Coloque el resguardo de la cubierta restante en el medio de nuevo en la incubadora de 37 grados Celsius y transporte el plato con tampón de grabación al microscopio confocal. Inicie el software de imágenes. Mientras se está inicializando, inicie la bomba peristáltica y coloque la línea en el búfer de grabación.A continuación, calibrar el flujo a dos mililitros por minuto. Transfiera el resbalón de la cubierta infectada del plato Petri al baño de grabación con fórceps finos. Usando el objetivo de inmersión de agua 10X y la luz de campo brillante, busque el plano de enfoque y busque una región con una alta densidad de cuerpos celulares de neuronas, luego cambie al objetivo 40X y reenfoque la muestra.Seleccione y aplique AlexaFluor 488 en la ventana de lista Tintes. Con el fin de evitar la sobreexposición y el blanqueo fotográfico de los fluoróforos, comience con ajustes de baja potencia HV y láser. Para el canal AlexaFluor 488, establezca el HV en 500, la ganancia en 1x y el desplazamiento a cero.Establezca la potencia en 5% para la línea láser 488. Aumente el tamaño del agujero a 300 micrómetros y utilice la opción de escaneo de enfoque x2 para ajustar de forma óptima las señales de emisión a los niveles de subsaturación. Los ajustes se pueden ajustar para una visibilidad óptima de cada canal.Una vez optimizados los ajustes del microscopio, mueva el escenario para localizar una región con varias células que muestren cambios espontáneos en la fluorescencia GCaMP6f y concéntrese en el plano deseado para la toma de imágenes. Utilice la herramienta Rectificar clip para recortar el fotograma de imagen a un tamaño que pueda alcanzar un intervalo de fotogramas de poco menos de un segundo. Establezca la ventana de intervalo en un valor de 1.0 y la ventana Num en 600.Para capturar una película de la serie t, seleccione la opción Tiempo y, a continuación, utilice la opción de escaneo Xyt para comenzar la creación de imágenes. Observe la barra de progreso de la imagen y mueva la línea desde el búfer de grabación HEPES al búfer de grabación de glutamato micromolar en el punto de tiempo adecuado. Cuando se complete la creación de imágenes, seleccione el botón de la serie realizada y guarde la película de la serie t terminada.Continúe perfundiendo el glutamato durante cinco minutos adicionales para que el cultivo de las neuronas haya estado expuesto al glutamato durante un total de 10 minutos. Repita este proceso para cada hoja de portada que se va a tomar la imagen. Es posible ver rastros de calcio y cuerpos celulares neuronales inmediatamente después del experimento.Utilice la herramienta Elipse para dibujar el número deseado de ROI alrededor del soma neuronal. Y utilice el botón Análisis de serie para visualizar las trazas. Después de la exposición adicional de cinco minutos al glutamato, retire el resbalón de la cubierta del baño con fórceps finos y colóquelo de nuevo en la placa Petri con el búfer de grabación hasta que se completen todas las imágenes.El día de la toma de imágenes, los cultivos de VM fueron tratados con glutamato o una combinación de glutamato y NBQX. En ambas condiciones, se observaron cambios heterogéneos y espontáneos en la florescencia de GCaMP6f que indicaron flujos espontáneos de calcio. La aplicación del glutamato generó una respuesta de calcio robusta y sostenida en las neuronas espontáneamente activas y en reposo.La aplicación de NBQX redujo la actividad espontánea y bloqueó parcialmente la respuesta del glutamato. La medida en que la aplicación de glutamato estimuló una respuesta de calcio en cada condición se cuantificó utilizando el área debajo de la curva, la amplitud máxima y la latencia para responder. La latencia a la respuesta aumentó bajo la condición nbQX y glutamato.Para medir la apoptosis mediada por glutamato, las células se fijaron y se tiñeron con un anticuerpo anti-Caspasa-3. La intensidad media de la caspasa-3 fue significativamente mayor en ambas condiciones de tratamiento en comparación con los controles no tratados. Un análisis más exhaustivo de la muerte de células tóxicas excitadas se puede hacer contando el número de inmunosustina hidroxilasa positivas neuronas dopaminérgicas en control y condición tratada con glutamato.Esta técnica ha allanado el camino para entender las contribuciones relativas de diferentes receptores y canales de hierro involucrados en la apoptosis mediada por calcio en la neurona dopaminérgica.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection y cultivos primarios de neuronas del hipocampo de embriones de ratón y corticales

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Investigación

Neurociencias

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

Formación de imágenes pHluorin-etiquetados Inserción del receptor a la membrana plasmática en neuronas primarias de ratón en cultivo

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Fosfato de Calcio La transfección de Primaria neuronas del hipocampo

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Cultivo primario de ratón neuronas dopaminérgicas

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

Modulaciones Ambientales del Número de dopamina mesencéfalo neuronas en ratones adultos

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescencia y bioluminiscencia de imágenes de subcelular Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Envejecido en las neuronas del hipocampo

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

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