Name: quantifying spontaneous ca2+ fluxes and their downstream effects in primary mouse midbrain neurons
Uploaded: 2020-09-09T14:00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons at JoVE.com

Stöds av bidrag från American Parkinson Disease Association (APDA) och NIH R01NS115809-01 till RS. Vi tackar Texas A & M Institute for Genomic Medicine (TIGM) för att tillhandahålla tidsfördredande dräktiga möss för att generera primära dopaminerga kulturer.

<ol>
	<li>Marras, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+Parkinson's+disease+across+North+America.">Prevalence of Parkinson's disease across North America.</a> NPJ Parkinson's Disease. 4, 21 (2018).</li><li>Poewe, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson+disease.">Parkinson disease.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013 (2017).</li><li>Mehta, A., Prabhakar, M., Kumar, P., Deshmukh, R., Sharma, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxicity:+bridge+to+various+triggers+in+neurodegenerative+disorders.">Excitotoxicity: bridge to various triggers in neurodegenerative disorders.</a> European Journal of Pharmacology. 698 (1-3), 6-18 (2013).</li><li>Ambrosi, G., Cerri, S., Blandini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+further+update+on+the+role+of+excitotoxicity+in+the+pathogenesis+of+Parkinson's+disease.">A further update on the role of excitotoxicity in the pathogenesis of Parkinson's disease.</a> Journal of Neural Transmission (Vienna). 121 (8), 849-859 (2014).</li><li>Dong, X. X., Wang, Y., Qin, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+excitotoxicity+and+their+relevance+to+pathogenesis+of+neurodegenerative+diseases.">Molecular mechanisms of excitotoxicity and their relevance to pathogenesis of neurodegenerative diseases.</a> Acta Pharmaceutica Sinica B. 30 (4), 379-387 (2009).</li><li>Vieira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxicity+through+Ca2+-permeable+AMPA+receptors+requires+Ca2+-dependent+JNK+activation.">Excitotoxicity through Ca2+-permeable AMPA receptors requires Ca2+-dependent JNK activation.</a> Neurobiology of Disease. 40 (3), 645-655 (2010).</li><li>Sebe, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)-Permeable+AMPARs+Mediate+Glutamatergic+Transmission+and+Excitotoxic+Damage+at+the+Hair+Cell+Ribbon+Synapse.">Ca(2+)-Permeable AMPARs Mediate Glutamatergic Transmission and Excitotoxic Damage at the Hair Cell Ribbon Synapse.</a> Journal of Neuroscience. 37 (25), 6162-6175 (2017).</li><li>Brickley, S. G., Farrant, M., Swanson, G. T., Cull-Candy, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNQX+increases+GABA-mediated+synaptic+transmission+in+the+cerebellum+by+an+AMPA/kainate+receptor-independent+mechanism.">CNQX increases GABA-mediated synaptic transmission in the cerebellum by an AMPA/kainate receptor-independent mechanism.</a> Neuropharmacology. 41 (6), 730-736 (2001).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smoking-Relevant+Nicotine+Concentration+Attenuates+the+Unfolded+Protein+Response+in+Dopaminergic+Neurons.">Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).</li><li>Henley, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+Identification+of+Living+Dopaminergic+Neurons+in+Midbrain+Cultures+Using+RNA+Sequencing+and+TH-promoter-driven+eGFP+Expression.">Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e54981 (2017).</li><li>Douhou, A., Troadec, J. D., Ruberg, M., Raisman-Vozari, R., Michel, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+promotion+of+mesencephalic+dopaminergic+neurons+by+depolarizing+concentrations+of+K++requires+concurrent+inactivation+of+NMDA+or+AMPA/kainate+receptors.">Survival promotion of mesencephalic dopaminergic neurons by depolarizing concentrations of K+ requires concurrent inactivation of NMDA or AMPA/kainate receptors.</a> Journal of Neurochemistry. 78 (1), 163-174 (2001).</li><li>Lavaur, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+noble+gas+xenon+provides+protection+and+trophic+stimulation+to+midbrain+dopamine+neurons.">The noble gas xenon provides protection and trophic stimulation to midbrain dopamine neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 142 (1), 14-28 (2017).</li><li>Kritis, A. A., Stamoula, E. G., Paniskaki, K. A., Vavilis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Researching+glutamate+-+induced+cytotoxicity+in+different+cell+lines:+a+comparative/collective+analysis/study.">Researching glutamate - induced cytotoxicity in different cell lines: a comparative/collective analysis/study.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 91 (2015).</li><li>Gupta, K., Hardingham, G. E., Chandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-dependent+glutamate+excitotoxicity+in+human+embryonic+stem+cell-derived+neurons.">NMDA receptor-dependent glutamate excitotoxicity in human embryonic stem cell-derived neurons.</a> Neuroscience Letters. 543, 95-100 (2013).</li><li>Surmeier, D. J., Obeso, J. A., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+neuronal+vulnerability+in+Parkinson+disease.">Selective neuronal vulnerability in Parkinson disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (2), 101-113 (2017).</li><li>Ramirez, J. M., Tryba, A. K., Pena, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacemaker+neurons+and+neuronal+networks:+an+integrative+view.">Pacemaker neurons and neuronal networks: an integrative view.</a> Current Opinion in Neurobiology. 14 (6), 665-674 (2004).</li><li>Guzman, J. N., Sanchez-Padilla, J., Chan, C. S., Surmeier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+pacemaking+in+substantia+nigra+dopaminergic+neurons.">Robust pacemaking in substantia nigra dopaminergic neurons.</a> Journal of Neuroscience. 29 (35), 11011-11019 (2009).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Vi beskriver en långsiktig primära ventrala mesencephalic (VM) cell kultur system för hög innehållsinnehåll analys av glutamat-medierad apoptos i nervceller. Studier har anställt primära midbrain dopaminerga kulturer att belysa excitotoxiska mekanismer i samband med PD-modeller11,12. I denna studie använder vi en kombinatorisk metod med hjälp av genetiskt kodade Kalcium indikatorer (GECIs) för att mäta Ca2 + aktivitet och ytterligare associera denna verksamhet med nedströms molekylära förändringar, såsom inledande av apoptotiska signalering kaskader4. Metoden har flera fördelar med andra liknande cellodlingssystem. Som vi har särskilt intresse för excitotoxicitet inom ramen för Parkinsons sjukdom, med hjälp av primära VM cellkulturer är idealisk. Genom att använda olika fält omlokalisering tekniker, såsom gridded coverslips eller en motoriserad XY mikroskop skede kombinerat med TH immunfärgning, kan vi direkt studera celltyp specifika effekter av glutamat-medierad apoptos i ventrala mellanhjärnan nervceller. Dessutom, den 3-veckors cellkultur modell gör det möjligt för nervceller att utveckla sin fulla, mogna molekylär profil, vilket återspeglar vuxna DA nervceller9. Tidigare metoder har främst fokuserat på molekylära förändringar efter glutamat-medierad excitotoxicitet13,14. Modellen är unik i sin förmåga att korrelera akuta förändringar i neuronal fysiologi med nedströms molekylära händelser i identifierade celltyper. En begränsning av den primära odlingsmodellen är att dissektionstekniken fångar hela ventrala mellanhjärnan, inklusive DA och GABAergic nervceller samt nervceller från SNc och VTA. Bevis tyder nu på att DA nervceller av SNc har selektiv sårbarhet för kalcium och eventuell celldöd jämfört med DA nervceller i angränsande VTA15. Tyvärr har differentiering SNc från VTA nervceller i embryonala kulturer visat sig svårt med få anatomiska landmärken att definiera dessa strukturer i den embryonala hjärnan.
Vi visar att den primära odlingstekniken möjliggör kvantifiering av heterogen spontan Ca2+ aktivitet (Figur 1). Därför är detta en idealisk cellkultur systemmodell för att studera tonically aktiva celler, såsom pacemaking dopaminerga nervceller i mellanhjärnan, neokortikala nervceller, och GABAergic nervceller av suprachiasmatic kärnan (SCN)16,17. I de flesta tillämpningar uppnår Ca2+ imaging inte samma temporala upplösning som elektrofysiologi. Därför är det troligt att en enda Ca2 + händelse är analog med en explosion av neuronala åtgärder potentialer. Detta kan tolkas som att Ca2 + imaging möjliggör relativt korrekta åtgärder av onormal sprängning verksamhet i pacemaking celler och är därför lämpligt för en hög halt skärm av Ca2 +-medierad excitotoxiska celldöd.
För att uppnå och upprätthålla spontan Ca2+-aktivitet är det viktigt att ta itu med två viktiga punkter i protokollet. Först är plätering densitet av cellerna efter dissektion. För primära VM nervceller, tidigare studier har använt runt 100.000 celler/cm29,10. Vi har anpassat protokollet till plattan en densitet av 200.000 celler/cm2, vilket skapar ett heterogent utbud av spontan aktivitet och ökar antalet dopaminerga VM nervceller som finns på varje täckplatta. Eftersom olika pacemaking nervceller har distinkta bränning egenskaper16, den plätering densitet måste anpassas till celltyp som studeras och optimeras för att uppnå idealiska nivåer av spontan aktivitet. Andra är inkubationstiden efter virusinfektion av AAV. Liksom plätering densitet, kommer detta att vara beroende av det specifika sammanhanget för forskningen fråga och typ av AAV som används. För de specifika AAV som används här, 5 dagar av inkubation efter virusinfektion är idealisk för att uppnå de önskade proteinuttryck nivåer, vilket möjliggör dynamiska förändringar i GCaMP fluorescens i syfte att registrera Ca2 + aktivitet. Många faktorer avgör hur snabbt och effektivt en AAV kommer att uttrycka sin last, varav mycket ligger utanför ramen för denna metod, men kortfattat, det är viktigt att överväga promotor aktivitet och den hastighet med vilken lastprotein mognar och veck.
En annan fördel med metoden är att den möjliggör avsevärd flexibilitet i format, uttrycksvektorer, användning av bildåtergivningsutrustning, och den rad vetenskapliga frågor som kan behandlas. Dessutom möjliggör metoden utredning av ett brett spektrum av specifika frågor som omger glutamat-medierad excitotoxicitet i PD, och andra modeller av nervsystemet dysfunktion. Till exempel, glutamat-medierad excitotoxicitet innebär flera receptorer och signalering kaskader5. Genom att använda metoden, och som visats med AMPAR-blockeraren, NBQX i figur 1, är det möjligt att dissekera ut specifika komponenter i det excitotoxiska glutamatsvaret på en fysiologisk och molekylär nivå. Möjligen, en liknande metod med hjälp av hämmare av andra budbärare system kan användas för att bestämma deras bidrag till excitotoxicity. Dessutom kan de AAV som används här anpassas för att uttrycka GECIs med cellspecifika initiativtagare eller AAV-uttryckta optogenetiska sensorer som kan användas för att mäta andra parametrar såsom signalsubstansfrigöring.
Bortsett från primära embryonala dissektioner och confocal bildbehandling, mycket av protokollet använder grundläggande laboratoriekunskaper som inte kräver specialiserad utbildning. Därför är begränsningarna för modellen inkluderar svårigheten av den embryonala dissekeringstekniken, den tidslängd cellerna måste odlas för att nå mognad, och tillgång till en konfokal mikroskop, eller liknande bildåtergivningsapparat. Metodens många fördelar och flexibilitet överväger dessa begränsningar, vilket gör detta till en idealisk modell för att studera rollen glutamat-medierad excitotoxicitet vid störningar i nervsystemet. Slutligen, denna modell kan vara ett effektivt verktyg för att skärmen nya föreningar för anti-apoptotiska effekter och deras förmåga att bevara DA neuron hälsa.

Parkinsons sjukdom (PD) är den näst vanligaste neurodegenerativa sjukdomen i världen, utan kända botemedel. Uppskattningar tyder på att PD prevalensen kommer att fortsätta att öka och beräknas överträffa 1 miljon diagnoser till år 2030 i USA ensam1. Med få effektiva behandlingar som för närvarande finns tillgängliga för att bekämpa PD, det finns ett trängande behov av att utveckla effektivare terapier. PD kännetecknas av en snabb och progressiv förlust av midbrain dopamin (DA) nervceller2. De mekanismer som ligger bakom neurodegeneration i PD är dåligt förstådda. Bevis tyder på en trolig konvergens av flera mekanismer, såsom oxidativ stress och mitokondriell dysfunktion, etc. som bidrar till inledandet av apoptotiska signalering kaskader och eventuell celldöd3.
En sådan konvergent mekanism, glutamat-medierad excitotoxicitet har varit inblandad i flera neurodegenerativa sjukdomar, inklusive PD4. Medan glutamat-medierad excitotoxicitet tros fungera främst genom stimulering av NMDA-receptorer via en överdriven ökning av intracellulära Ca2 + koncentration och eventuell initiering av apoptos, Ca2 +-permeabla AMPA receptorer har också varit inblandad i det excitotoxiska svaret5,6,7. Därför är det av intresse att bestämma bidraget av AMPA-receptorer till glutamat-medierad apoptos inom en PD-modell. Detta kan uppnås med hjälp av NBQX, en AMPA och kainate blockerare, som vid mikromolarkoncentrationer är selektiv för AMPA-receptorer8. Glutamat-medierad excitotoxicity och apoptotiska signalering kaskader är ett idealiskt nedströms mål att mäta omfattningen av celldöd, och en potentiell mål för terapeutisk intervention. Därför utveckla en hög innehållsmetod för att bedöma glutamat-medierad modulering av kalcium aktivitet och associerade nedströms signalering i primära ventrala mesencephalic (VM) nervceller skulle vara värdefullt för screening nya behandlingsmetoder på deras förmåga att bevara neuronal hälsa.
Här har vi utvecklat ett protokoll där vi uttrycker den genetiskt kodade kalciumindikatorn (GECI), GCaMP6f, med hjälp av AAV2/5 med human synapsin (hSyn) promotor för att mäta Ca2 + aktiviteten hos mus VM primära nervceller som svar på glutamat ansökan som kan mätas på den fysiologiska och molekylär nivå. Denna hög innehållsliga screening kan anpassas för att upptäcka läkemedel eller behandlingar som modulerar Ca2 + aktivitet för att bevara hälsan hos VM nervceller. Vi föreslår att denna primära kulturmodell är ett effektivt sätt att screena för nya PD-interventioner, baserat på deras förmåga att bevara hälsan hos VM nervceller och mildra utvecklingen av PD.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Formalin/PBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100496-506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X NA 0.3 water-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UMPLFLN10XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm circular cover glass No. 1</td>
			<td>Phenix Research Products</td>
			<td>MS20-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X NA 0.85 oil-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO20XO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm uncoated plastic cell culture dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X NA 0.3 water-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LUMPLFLN40XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X NA 1.35 oil-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO60XO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin (sodium)</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>A-301-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td>50x stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binolcular Microscope</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>KSCXTS-1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2), anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (DNase)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose, andydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RDD016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM + GlutaMAX medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10569010</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equine serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26050088</td>
			<td>heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Illuminator, 100V</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>KSC5410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System, PES 22UM 250ML</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28199-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoview 1000 confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoview 1200 confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-chicken Alexa Fluor 594</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-rabbit Alexa Fluor 594</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks-balanced Salt Solution (HBSS) 1x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14175095</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101170-478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeraCell 150 CO2 incubator</td>
			<td>Heraeus (ThermoFisher)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ v1.52e</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS-Fine Scissors (Round Type)-S/S Str/31*8mm/13cm</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S12014-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>K-120-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2), andydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPII Mini-Peristaltic Pump, 115/230 VAC, 50/60 Hz</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MULLER Micro Forceps-Str, 0.15mm Tips, 11cm</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11014-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBQX</td>
			<td>Hello Bio</td>
			<td>HB0443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (NGS)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin 2020</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>100837-AAV1</td>
			<td>Titer: 1.00E+13 gc/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington Biomedical Corporation</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010049</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl), anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head Tubing Pieces For MPII</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>55-4148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal anti-caspase-3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl), anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>BioXtra, &#8805;99.5% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-pregnant female C57BL/6 mice</td>
			<td>Texas A&#38;M Institue for Genomic Medicine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-bore blue pipette tips P1000</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83007-380</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying spontaneous ca2+ fluxes and their downstream effects in primary mouse midbrain neurons

Parkinsons sjukdom (PD) är en förödande neurodegenerativa störning som orsakas av degeneration av dopaminerga (DA) nervceller. Överdriven Ca2 + tillströmningen på grund av onormal aktivering av glutamat receptorer resulterar i DA excitotoxicitet och har identifierats som en viktig mekanism för DA neuron förlust. I denna studie isolerar vi, separerar och odlar midbrain nervceller från musen ventrala mesencephalon (VM) av ED14 mus embryon. Vi infekterar sedan de långsiktiga primära mus midbrain kulturer med en adeno-associerade virus (AAV) uttrycker en genetiskt kodad kalcium indikator, GCaMP6f under kontroll av den mänskliga neuron-specifika synapsin promotorn, hSyn. Använda levande confocal imaging, vi visar att odlade mus midbrain nervceller visa spontana Ca2 + fluxes upptäckts av AAV-hSyn-GCaMP6f. Bad tillämpning av glutamat till midbrain kulturer orsakar onormala höjder i intracellulära Ca2 + inom nervceller och detta åtföljs av kaspas-3 aktivering i DA nervceller, vilket framgår av immunfärgning. De tekniker för att identifiera glutamat-medierad apoptos i primär mus DA nervceller har viktiga tillämpningar för hög halt screening av läkemedel som bevarar DA neuron hälsa.

Efter inledande odling av celler, behandlade vi VM kultur rätter på 14 DIV med 1 μL av AAV hSyn-GCaMP6f och tillåts för 5 dagar av viral uttryck. På dagen för bildbehandling HEPES inspelningsbufferten var beredd färskt. Vi använde två villkor; i ett villkor 20 μM glutamat tillämpades för 10 min, medan i det andra villkoret 5 min av 10 μM NBQX ansökan föregick en 10 min co-tillämpning av 10 μM NBQX + 20 μM glutamat. I båda villkoren, vi observerade heterogena och spontana förändringar i GCaMP6f fluorescens, som indikerar spontana Ca2 + flussor, som visas i den representativa spår (Figur 1A,B, Kompletterande Movie 1-2). Tillämpning av 20 μM glutamat genererade en robust och ihållande Ca2 + svar i både spontant aktiva och quiescent nervceller (Figur 1A, Kompletterande Movie 1). Applicering av 10 μM NBQX reducerade spontan aktivitet, och blockerade delvis det glutamatiska svaret (Figur 1B, Supplemental Movie 2). I vilken utsträckning glutamat ansökan stimuleras en Ca2 + svar i varje villkor kvantifierades med hjälp av område under kurvan, topp amplitud och latens att svara. Både område under kurvan och toppamplitud var likartad för både glutamat och NBQX + glutamatbehandlade tillstånd (figur 1C), medan svarsfördröjningen ökade avsevärt i tillståndet NBQX + glutamat (Figur 2A,B). Förutom att kvantifiera Ca2 + svar på glutamat behandling, vi fast och färgade prover med en anti-caspase-3 antikropp som ett mått på glutamat-medierad apoptos. Vi observerade en rad kaspase-3 aktivering över villkoren (Figur 3A,B). Caspase-3 aktivering kvantifierades genom att mäta område och medelvärdet av caspase-3-intensitet. Vid jämförelse med obehandlade kontrollceller trendades det genomsnittliga området av celler med kaspas-3-aktivering under glutamat och NBQX + glutamatförhållanden mot signifikans (figur 3B). Medel-caspase-3-intensiteten var signifikant högre i glutamat och NBQX + glutamattillstånd jämfört med obehandlade kontroller (Figur 3B). Tillsammans visar dessa resultat en hög innehållsram där apoptos av nervceller kan mätas genom att kvantifiera Ca2 + svar på excitotoxiska medel och följas upp med en analys av nedströms apoptotiska händelser såsom caspase-3 aktivering i samma uppsättning kulturer.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig01.jpg"> Figur 1: Odlade ventrala mesencephalic nervceller visa spontana Ca2 + aktivitet och är robust stimuleras av glutamat ansökan. (A) Representativa spår av spontana Ca2 + aktivitet i VM nervceller och deras svar på 20 μM Glutamat ansökan. (B) Representativa spår av spontan Ca2+ aktivitet i VM nervceller och deras svar på 10 μM NBQX + 20 μM Glutamat ansökan. (C) Befolkningsdata som visar areal under kurvan och toppamplitud av Ca2+ spår. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig01large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig02v3.jpg"> Figur 2: AMPAR blockad med NBQX förseningar svar på glutamat ansökan i odlade ventrala mesencephalic nervceller. (A) Representant Ca2+ spår av glutamat (grå) och NBQX + glutamat (blå) framkallade svar. Genomsnittliga Ca2+ spår av glutamat (svart) och NBQX + glutamat (röd) visas överlagrad. (B) Befolkningsdata som visar latens till svar för glutamat och NBQX + glutamat framkallat svar. Procentuell förändring mellan glutamat och NBQX + glutamatförhållanden visas i den högra panelen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig02v3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig03v3.jpg"> Figur 3: Glutamat ansökan ökar caspase-3 uttryck i tyrosin hydroxylas (TH) positiva ventrala mesencephalic nervceller. (A) Representativa confocal bilder av VM kulturer immunstained för caspase-3 (grön) och TH (röd), skala bar = 10 μm. (B) Befolkningsdata som visar DA neuron område och medelvärdet grå värdet av caspase-3 uttryck i varje villkor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig03v3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
Kompletterande Film 1: Spontan Ca2 + aktivitet och svar på glutamat ansökan. Spontana Ca2+ flussen i närvaro av HEPES-inspelningsbuffert (0-300 s) följt av applicering av 20 μM glutamat (301-600 s). Skala bar = 50 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61481/Supplementary_Movie%201_glutamate_ver_2.avi" target="_blank">Vänligen klicka här för att ladda ner den här videon.</a>
Kompletterande Movie 2: Spontan Ca2 + aktivitet och svar på NBQX + glutamat ansökan. Spontana Ca2+ flussor i närvaro av HEPES-inspelningsbuffert (0-300 s) följt av applicering av 10 μM NBQX (301-600 s), och 10 μM NBQX + 20 μM glutamat (601-900 s). Skala bar = 50 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61481/Supplementary_Movie_2_NBQX_glut.avi" target="_blank">Vänligen klicka här för att ladda ner den här videon.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons at JoVE.com

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Här presenterar vi ett protokoll för att mäta in vitro Ca2 + flussen i midbrain nervceller och deras nedströms effekter på caspase-3 med hjälp av primära mus midbrain kulturer. Denna modell kan användas för att studera pathophysiologic förändringar relaterade till onormal Ca2 + aktivitet i midbrain nervceller, och att skärmen nya therapeutics för anti-apoptotiska egenskaper.

Kvantifiera spontana Ca2 + flussmedel och deras nedströms effekter i Primär Mus Midbrain Nervceller

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx ...

Detta protokoll kvantifierar kalcium flussmedel i dopaminerga nervceller, som går förlorade vid Parkinsons sjukdom. Detta är användbart för att förstå hur onormalt kalcium orsakar dopaminerga neuron förlust vid Parkinsons sjukdom. För första gången visar vi spontana kalcium fluxes i odlade primära mellanhjärnan nervceller.Denna metod kan användas för att dissekera specifika receptor bidrag som deltar i kalcium-medierad apoptos. Vår metod ger en väg för hög innehållshalt drog skärmar för att upptäcka specifika och effektiva neuroprotektiva föreningar för Parkinsons sjukdom. Dessa neuroprotektiva föreningar skulle förhindra kalcium-medierad apoptos i dopaminerga neuron.Börja med att förbereda en milliliter av serumfritt DMEM-medium med en mikroliter av hSyn-GCaMP6f AAV per fat. Aspirera cellodlingsmediet från varje fat och ersätt det med en milliliter av det preparerade DMEM med hSyn-GCaMP6f. Placera disken tillbaka till 37 grader Celsius inkubator i en timme.Efter inkubationen aspirera du mediet med AAV och ersätt det med tre milliliter cellodlingsmedium. Inkubera disken vid 37 grader Celsius i fem till sju dagar. Ändra mediet varannan till tre dagar under hela denna period av virusinfektion.Förbered en liter av HEPES-inspelningsbufferten, 200 milliliter av 20 mikromolar glutamatinspelningsbuffert och 200 milliliter av 10 mikromolar NBQX-inspelningsbuffert enligt manuskriptriktningar. Fyll en steril 35 millimeter petriskål med tre milliliter av inspelningsbufferten. Ta petriskålen med de infekterade kulturerna från inkubatorn, ta sedan försiktigt tag i kanten av en täcksli med fina spetstippar och överför den till skålen med inspelningsbufferten.Placera den återstående locket glida i medium tillbaka i 37 grader Celsius inkubatorn och transportera skålen med inspelning buffert till confocal mikroskop. Starta bildhanteringsprogrammet. Medan det är initiering, starta peristaltic pumpen och placera linjen i inspelningen buffert.Kalibrera sedan flödet till två milliliter per minut. Överför den infekterade täckslien från petriskålen till inspelningsbadet med fina typpor. Med hjälp av 10X vatten nedsänkning objektiv och brightfield ljus, hitta planet av fokus och leta efter en region med en hög densitet av neuron cell organ, sedan byta till 40X objektiv och fokusera provet.Välj och tillämpa AlexaFluor 488 i fönstret Dyes list. För att förhindra överexponering och fotoblekning av fluorforerna, börja med låga HV- och lasereffektinställningar. För AlexaFluor 488-kanalen, ställ in HV till 500, förstärkningen till 1x och förskjutningen till noll.Ställ in strömmen till 5%för 488 laserlinjen. Öka pinholestorleken till 300 mikrometer och använd alternativet för fokus x2-skanning för att optimalt justera emissionssignalerna till delaturationsnivåer. Inställningar kan sedan justeras för optimal synlighet av varje kanal.När mikroskopinställningarna har optimerats flyttar du scenen för att lokalisera en region med flera celler som visar spontana förändringar i GCaMP6f-fluorescensen och fokuserar på det önskade planet för avbildning. Använd verktyget Clip rect för att klippa bildrutan till en storlek som kan uppnå ett ramintervall på knappt en sekund. Ställ in intervallfönstret på värdet 1,0 och Num-fönstret till 600.Om du vill fånga en t-seriefilm väljer du alternativet Tid och använder sedan Xyt-skanningsalternativet för att påbörja bildtagningen. Titta på imaging förloppsindikatorn och flytta linjen från HEPES-inspelningsbufferten till 20 mikromolarfrostmatinspelningsbufferten vid lämplig tidpunkt. När bildtagningen är klar väljer du knappen serie klar och sparar den färdiga t-seriens film.Fortsätt att granska glutamat i ytterligare fem minuter så att kulturen av nervceller har utsatts för glutamat i totalt 10 minuter. Upprepa denna process för varje omslagssli som ska avbildas. Det är möjligt att visa kalcium spår och neuronala cellkroppar omedelbart efter experimentet.Använd Ellipse verktyget för att dra önskat antal ROIs runt neuronal soma. Och använd knappen Serieanalys för att visualisera spåren. Efter den ytterligare fem minuters exponering för glutamat, ta bort locket slip från badet med fina tärnor och placera tillbaka den i Petri-skålen med inspelningen buffert tills all bildbehandling är klar.På dagen för bildbehandling, vm-kulturerna behandlades med antingen glutamat eller en kombination av glutamat och NBQX. I båda villkoren observerades heterogena och spontana förändringar i GCaMP6f florescence som indikerar spontana kalcium flussen. Tillämpning av glutamat genereras en robust och ihållande kalcium svar i både spontant aktiva och quiescent nervceller.Tillämpning av NBQX minskad spontan aktivitet, och delvis blockerade glutamat svaret. I vilken utsträckning glutamat ansökan stimuleras ett kalcium svar i varje villkor kvantifierades med hjälp av området under kurvan, topp amplitud och latens att svara. Latensen till svar ökade under villkoret NBQX och glutamat.För att mäta glutamat-medierad apoptos, var cellerna fasta och färgas med en anti-Caspase-3 antikropp. Genomsnittlig caspas-3-intensitet var signifikant högre vid båda behandlingstillstånden jämfört med obehandlade kontroller. En mer grundlig analys av upphetsade toxisk celldöd kan göras genom att räkna antalet immunostain tyrosin hydroxylase positiva dopaminerga nervceller i kontroll och glutamat behandlade tillstånd.Denna teknik har banat väg för att förstå de relativa bidragen från olika receptorer och järnkanaler som är involverade i kalciummedierad apoptos i dopaminerg neuron.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Nucleofection och Primary kultur av embryonala Mouse hippocampus och kortikala Neuroner

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

Imaging pHluorin-märkta receptor Insättning till plasmamembranet i primärt odlade mus Nervceller

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Kalciumfosfattransfektion av primär hippocampus nervceller

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Primär kultur av mus dopaminerga neuroner

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

Miljö modulation av antalet mitthjärnan dopaminneuroner i vuxna möss

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescens och Bioluminescence avbildning av Subcellulär Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; I Aged hippocampus nervceller

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modellering neuronala dödsfall och Degeneration i mus primära cerebellär Granule nervceller

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

Levande bilder av GLUT4 Protein människohandel mus primära hypotalamus nervceller använder Deconvolution mikroskopi

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Snabb och specifika immunmagnetisk isolering av mus primära oligodendrocyter

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualisera Axonal tillväxt Cone kollaps och tidiga Amyloid β effekter i odlade mus nervceller

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...