Name: quantifying spontaneous ca2+ fluxes and their downstream effects in primary mouse midbrain neurons
Uploaded: 2020-09-09T14:00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons at JoVE.com

Amerikan Parkinson Hastalığı Derneği (APDA) ve NIH R01NS115809-01 RS hibe tarafından desteklenir. Texas A&M Genomik Tıp Enstitüsü'ne (TIGM) birincil dopaminerjik kültürler oluşturmak için zamanlanmış hamile fareler sağladığı için teşekkür ederiz.

<ol>
	<li>Marras, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+of+Parkinson's+disease+across+North+America.">Prevalence of Parkinson's disease across North America.</a> NPJ Parkinson's Disease. 4, 21 (2018).</li><li>Poewe, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parkinson+disease.">Parkinson disease.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3, 17013 (2017).</li><li>Mehta, A., Prabhakar, M., Kumar, P., Deshmukh, R., Sharma, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxicity:+bridge+to+various+triggers+in+neurodegenerative+disorders.">Excitotoxicity: bridge to various triggers in neurodegenerative disorders.</a> European Journal of Pharmacology. 698 (1-3), 6-18 (2013).</li><li>Ambrosi, G., Cerri, S., Blandini, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+further+update+on+the+role+of+excitotoxicity+in+the+pathogenesis+of+Parkinson's+disease.">A further update on the role of excitotoxicity in the pathogenesis of Parkinson's disease.</a> Journal of Neural Transmission (Vienna). 121 (8), 849-859 (2014).</li><li>Dong, X. X., Wang, Y., Qin, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+excitotoxicity+and+their+relevance+to+pathogenesis+of+neurodegenerative+diseases.">Molecular mechanisms of excitotoxicity and their relevance to pathogenesis of neurodegenerative diseases.</a> Acta Pharmaceutica Sinica B. 30 (4), 379-387 (2009).</li><li>Vieira, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxicity+through+Ca2+-permeable+AMPA+receptors+requires+Ca2+-dependent+JNK+activation.">Excitotoxicity through Ca2+-permeable AMPA receptors requires Ca2+-dependent JNK activation.</a> Neurobiology of Disease. 40 (3), 645-655 (2010).</li><li>Sebe, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)-Permeable+AMPARs+Mediate+Glutamatergic+Transmission+and+Excitotoxic+Damage+at+the+Hair+Cell+Ribbon+Synapse.">Ca(2+)-Permeable AMPARs Mediate Glutamatergic Transmission and Excitotoxic Damage at the Hair Cell Ribbon Synapse.</a> Journal of Neuroscience. 37 (25), 6162-6175 (2017).</li><li>Brickley, S. G., Farrant, M., Swanson, G. T., Cull-Candy, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CNQX+increases+GABA-mediated+synaptic+transmission+in+the+cerebellum+by+an+AMPA/kainate+receptor-independent+mechanism.">CNQX increases GABA-mediated synaptic transmission in the cerebellum by an AMPA/kainate receptor-independent mechanism.</a> Neuropharmacology. 41 (6), 730-736 (2001).</li><li>Srinivasan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smoking-Relevant+Nicotine+Concentration+Attenuates+the+Unfolded+Protein+Response+in+Dopaminergic+Neurons.">Smoking-Relevant Nicotine Concentration Attenuates the Unfolded Protein Response in Dopaminergic Neurons.</a> Journal of Neuroscience. 36 (1), 65-79 (2016).</li><li>Henley, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reliable+Identification+of+Living+Dopaminergic+Neurons+in+Midbrain+Cultures+Using+RNA+Sequencing+and+TH-promoter-driven+eGFP+Expression.">Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression.</a> Journal of Visualized Experiments. (120), e54981 (2017).</li><li>Douhou, A., Troadec, J. D., Ruberg, M., Raisman-Vozari, R., Michel, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+promotion+of+mesencephalic+dopaminergic+neurons+by+depolarizing+concentrations+of+K++requires+concurrent+inactivation+of+NMDA+or+AMPA/kainate+receptors.">Survival promotion of mesencephalic dopaminergic neurons by depolarizing concentrations of K+ requires concurrent inactivation of NMDA or AMPA/kainate receptors.</a> Journal of Neurochemistry. 78 (1), 163-174 (2001).</li><li>Lavaur, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+noble+gas+xenon+provides+protection+and+trophic+stimulation+to+midbrain+dopamine+neurons.">The noble gas xenon provides protection and trophic stimulation to midbrain dopamine neurons.</a> Journal of Neurochemistry. 142 (1), 14-28 (2017).</li><li>Kritis, A. A., Stamoula, E. G., Paniskaki, K. A., Vavilis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Researching+glutamate+-+induced+cytotoxicity+in+different+cell+lines:+a+comparative/collective+analysis/study.">Researching glutamate - induced cytotoxicity in different cell lines: a comparative/collective analysis/study.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 91 (2015).</li><li>Gupta, K., Hardingham, G. E., Chandran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-dependent+glutamate+excitotoxicity+in+human+embryonic+stem+cell-derived+neurons.">NMDA receptor-dependent glutamate excitotoxicity in human embryonic stem cell-derived neurons.</a> Neuroscience Letters. 543, 95-100 (2013).</li><li>Surmeier, D. J., Obeso, J. A., Halliday, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+neuronal+vulnerability+in+Parkinson+disease.">Selective neuronal vulnerability in Parkinson disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 18 (2), 101-113 (2017).</li><li>Ramirez, J. M., Tryba, A. K., Pena, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacemaker+neurons+and+neuronal+networks:+an+integrative+view.">Pacemaker neurons and neuronal networks: an integrative view.</a> Current Opinion in Neurobiology. 14 (6), 665-674 (2004).</li><li>Guzman, J. N., Sanchez-Padilla, J., Chan, C. S., Surmeier, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+pacemaking+in+substantia+nigra+dopaminergic+neurons.">Robust pacemaking in substantia nigra dopaminergic neurons.</a> Journal of Neuroscience. 29 (35), 11011-11019 (2009).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Biz nöronlarda glutamat aracılı apoptoz un yüksek içerikli analizi için uzun vadeli primer ventral mesensefalik (VM) hücre kültür sistemi açıklar. Çalışmalar PD modelleri bağlamında eksitotoksik mekanizmaları açıklamak için birincil orta beyin dopaminerjik kültürler istihdam var11,12. Bu çalışmada, Ca2+ aktivitesini ölçmek ve bu aktiviteyi apoptotik sinyal basamaklarının başlatılması gibi aşağı moleküler değişikliklerle ilişkilendirmek için Genetik Olarak Kodlanmış Kalsiyum Göstergeleri (GECIs) kullanarak kombinatoryal bir yaklaşım kullanıyoruz4. Yöntemin diğer benzer hücre kültür sistemlerine birden çok avantajı vardır. Parkinson hastalığı bağlamında eksitotoksisiteye özel bir ilgi miz olduğu için primer VM hücre kültürlerini kullanmak idealdir. Gridded coverslips veya th immünboyama ile birlikte motorlu XY mikroskop aşaması gibi farklı alan tehcir teknikleri kullanarak, doğrudan ventral orta beyin nöronlarda glutamat aracılı apoptoz hücre tipi özel etkileri inceleyebilirsiniz. Ayrıca, 3 haftalık hücre kültürü modeli nöronların tam geliştirmek için izin verir, olgun moleküler profil, yetişkin DA nöronlar yansıtan9. Önceki yöntemler ağırlıklı olarak glutamat aracılı eksitotoksisite13,,14aşağıdaki moleküler değişiklikler üzerinde duruldu. Model tanımlanan hücre tiplerinde downstream moleküler olaylar ile nöronal fizyolojisi akut değişiklikler ilişkilendirmek için yeteneği benzersizdir. Birincil kültür modelinin bir sınırlama diseksiyon tekniği tüm ventral orta beyin yakalar olduğunu, DA ve GABAerjik nöronlar yanı sıra SNc ve VTA gelen nöronlar da dahil olmak üzere. Kanıtlar şimdi SNc DA nöronlar komşu VTA DA nöronlar ile karşılaştırıldığında kalsiyum ve nihai hücre ölümüne seçici güvenlik açığı olduğunu göstermektedir15. Ne yazık ki, embriyonik kültürlerde VTA nöronlar SNc ayırt embriyonik beyinde bu yapıları tanımlamak için birkaç anatomik işaretleri ile zor kanıtlamıştır.
Birincil kültür tekniğinin heterojen spontan Ca2+ aktivitesinin sayısallaştırılmasına olanak sağladığını göstermişiz (Şekil 1). Bu nedenle, bu tonik aktif hücreleri incelemek için ideal bir hücre kültürü sistemi modeli, orta beyin pacemaking dopaminerjik nöronlar gibi, neokortikal nöronlar, ve suprachiasmatic çekirdek GABAerjik nöronlar (SCN)16,17. Çoğu uygulamada, Ca2+ görüntüleme elektrofizyoloji ile aynı zamansal çözünürlüğe ulaşmaz. Bu nedenle, tek bir Ca2 + olay nöronal eylem potansiyelleri bir patlama benzer olması muhtemeldir. Bu, Ca2+ görüntülemenin hız yapma hücrelerinde anormal patlama aktivitesinin nispeten doğru ölçütlerine izin verdiği ve bu nedenle Ca2+aracılıeksitotoksik hücre ölümünün yüksek içerikli ekranı için uygun olduğu şeklinde yorumlanabilir.
Spontan Ca2+ etkinliğini elde etmek ve sürdürmek için protokoldeki iki önemli noktayı ele almak önemlidir. Birincisi, diseksiyondan sonra hücrelerin kaplama yoğunluğudur. Primer VM nöronlar için, önceki çalışmalarda yaklaşık 100.000 hücre/ cm29,,10kullandık. Protokolü 200.000 hücre/cm2yoğunluklu bir yoğunluk tabakasına uyarladık, bu da heterojen bir spontan aktivite aralığı oluşturur ve her kapak kaymasında bulunan dopaminerjik VM nöronların sayısını artırır. Farklı pacemaking nöronlar farklı ateşleme özellikleri olduğundan16, kaplama yoğunluğu çalışılan hücre tipine özelleştirilmiş ve spontan aktivite ideal düzeyde elde etmek için optimize edilmesi gerekir. İkinci atv viral enfeksiyon aşağıdaki kuluçka süresi. Kaplama yoğunluğu gibi, bu araştırma sorusu ve kullanılan AAV türü belirli bağlamına bağlı olacaktır. Burada kullanılan özel AAV için, viral enfeksiyon sonrası 5 günlük kuluçka, Ca2+ aktivitesini kaydetmek için GCaMP floresansında dinamik değişikliklere olanak tanıyan istenilen protein ekspresyonu seviyelerini elde etmek için idealdir. Birçok faktör ne kadar hızlı ve verimli bir AAV kargo ifade edeceğini belirlemek, çok bu yöntemin kapsamı dışında, ama kısaca, bu organizatör aktivitesi ve kargo proteinolgunve kıvrımlar oranı dikkate almak önemlidir.
Yöntemin bir diğer avantajı da formatta, ifade vektörlerinde, görüntüleme ekipmanlarının kullanımına ve ele alınabilecek bilimsel soruların çeşitliliğine önemli ölçüde esneklik sağlamasıdır. Buna ek olarak, yöntem PH glutamat aracılı eksitotoksisite çevreleyen özel soruların geniş bir yelpazede içine soruşturma sağlar, ve sinir sistemi disfonksiyon diğer modeller. Örneğin, glutamat aracılı eksitotoksisite birden fazla reseptör ve sinyal basamaklariçerir 5. Yöntemi kullanarak ve ŞEKIL 1'dekiNBQX AMPAR blokeri ile gösterildiği gibi, eksitotoksik glutamat yanıtının spesifik bileşenlerini fizyolojik ve moleküler düzeyde incelemek mümkündür. İkinci haberci sistemlerinin inhibitörlerini kullanan benzer bir yaklaşım, eksitotoksisiteye olan katkılarını belirlemek için kullanılabilir. Ayrıca, burada kullanılan AAVs hücre özel organizatörleri veya nörotransmitter salınımı gibi diğer parametreleri ölçmek için kullanılabilecek AAV ifade optogenetik sensörler ile GECIs ifade adapte edilebilir.
Birincil embriyonik diseksiyonlar ve konfokal görüntüleme dışında, protokolün büyük bir kısmı özel eğitim gerektirmeyen temel laboratuvar becerilerini kullanır. Bu nedenle, modeliçin sınırlamalar embriyonik diseksiyon tekniğinin zorluk içerir, hücrelerin olgunluğa ulaşmak için kültürlü zaman uzunluğu, ve bir konfokal mikroskop erişim, ya da benzer görüntüleme cihazları. Yöntemin birçok faydası ve esnekliği bu sınırlamalara ağır basar, bu da sinir sistemi bozukluklarında glutamat aracılı eksitotoksisite rolünü incelemek için ideal bir modeldir. Son olarak, Bu model anti-apoptotik etkileri ve DA nöron sağlığını korumak için yeteneklerini yeni bileşikler ekraniçin etkili bir araç olabilir.

Parkinson Hastalığı (PH) bilinen bir tedavisi ile, dünya çapında ikinci en yaygın nörodejeneratif bozukluktur. Tahminler, PD yaygınlığının artmaya devam edeceğini ve sadece AMERIKA BirleşikDevletleri'nde2030 yılına kadar 1 milyon tanıyı aşacağını göstermektedir 1. Ph ile mücadele için şu anda mevcut birkaç etkili tedaviler ile, daha etkili tedaviler geliştirmek için acil bir ihtiyaç vardır. PH orta beyin dopamin hızlı ve ilerleyici kaybı ile karakterizedir (DA) nöronlar2. PH'de nörodejenerasyonun altında yatan mekanizmalar tam olarak anlaşılamamıştır. Kanıtlar oksidatif stres ve mitokondriyal disfonksiyon, vb apoptotic sinyal basamaklar ve nihai hücre ölümü başlatılmasına katkıda gibi birden fazla mekanizma, olası bir yakınsama göstermektedir3.
Böyle bir yakınsak mekanizma, glutamat aracılı eksitotoksisite pd4dahil olmak üzere birden fazla nörodejeneratif hastalıklar, karıştığı olmuştur. Glutamat aracılı eksitotoksisite hücre içi Ca2 + konsantrasyonu ve apoptoz nihai inisiyasyon aşırı bir artış yoluyla NMDA reseptörlerinin uyarılması yoluyla esas olarak çalışmak için düşünülse de, Ca2 +-geçirgen AMPA reseptörleri de eksitotoksik yanıt karıştığı olmuştur5,6,7. Bu nedenle, bir PD modeli içinde glutamat aracılı apoptosis AMPA reseptörlerinin katkısını belirlemek için ilgi çekicidir. Bu NBQX kullanılarak elde edilebilir, Bir AMPA ve kainate bloker, hangi mikromolar konsantrasyonlarda AMPAreseptörleriiçin seçici 8 . Glutamat aracılı eksitotoksisite ve apoptotik sinyal basamakları hücre ölümünün derecesini ölçmek için ideal bir aşağı akım hedef ve terapötik müdahale için potansiyel bir hedeftir. Bu nedenle, kalsiyum aktivitesi nin glutamat aracılı modülasyonunun değerlendirilmesi için yüksek içerikli bir yöntem geliştirmek ve primer ventral mesensefalik (VM) nöronlarda ilişkili downstream sinyalizasyonu nöronal sağlığı koruma yetenekleri ne kadar yeni tedavi yöntemlerinin taranması açısından değerli olacaktır.
Burada, fizyolojik ve moleküler düzeyde ölçülebilen glutamat uygulamasına yanıt olarak fare VM primer nöronların Ca2+ aktivitesini ölçmek için insan sinapsin (hSyn) promotörü ile AAV2/5 kullanarak genetik olarak kodlanmış kalsiyum indikatörü (GECI), GCaMP6f'ı ifade ettiğimiz bir protokol geliştirdik. Bu yüksek içerikli tarama, VM nöronların sağlığını korumak için Ca2+ aktivitesini modüle eden ilaç veya tedavileri keşfetmek için uyarlanabilir. Bu birincil kültür modelinin, VM nöronların sağlığını koruma ve PH'nin ilerlemesini azaltma yeteneklerine dayalı yeni PD müdahaleleri için etkili bir yol olduğunu öneriyoruz.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10% Formalin/PBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100496-506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X NA 0.3 water-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UMPLFLN10XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm circular cover glass No. 1</td>
			<td>Phenix Research Products</td>
			<td>MS20-121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20X NA 0.85 oil-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO20XO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm uncoated plastic cell culture dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25382-348</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X NA 0.3 water-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>LUMPLFLN40XW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60X NA 1.35 oil-immersion objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UPLSAPO60XO</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin (sodium)</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>A-301-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td>50x stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binolcular Microscope</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>KSCXTS-1121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride (CaCl2), anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746495</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken polyclonal anti-Tyrosine Hydroxylase</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab76442</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclease I (DNase)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glucose, andydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>RDD016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM + GlutaMAX medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10569010</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equine serum</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>26050088</td>
			<td>heat-inactivated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiber Optic Illuminator, 100V</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>KSC5410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter System, PES 22UM 250ML</td>
			<td>VWR</td>
			<td>28199-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoview 1000 confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoview 1200 confocal microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX supplement</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-chicken Alexa Fluor 594</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat polyclonal anti-rabbit Alexa Fluor 594</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks-balanced Salt Solution (HBSS) 1x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14175095</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101170-478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeraCell 150 CO2 incubator</td>
			<td>Heraeus (ThermoFisher)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ v1.52e</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IRIS-Fine Scissors (Round Type)-S/S Str/31*8mm/13cm</td>
			<td>RWD</td>
			<td>S12014-13</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin monosulfate</td>
			<td>Gold Bio</td>
			<td>K-120-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamic acid</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97061-634</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride (MgCl2), andydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPII Mini-Peristaltic Pump, 115/230 VAC, 50/60 Hz</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-2027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MULLER Micro Forceps-Str, 0.15mm Tips, 11cm</td>
			<td>RWD</td>
			<td>F11014-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NBQX</td>
			<td>Hello Bio</td>
			<td>HB0443</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal medium</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>21103049</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum (NGS)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7481</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Origin 2020</td>
			<td>OriginLab</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV.Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>100837-AAV1</td>
			<td>Titer: 1.00E+13 gc/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Worthington Biomedical Corporation</td>
			<td>LS003126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin streptomycin</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>15140122</td>
			<td>10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10010049</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4832</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-ornithine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride (KCl), anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746436</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pump Head Tubing Pieces For MPII</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>55-4148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit monoclonal anti-caspase-3</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride (NaCl), anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746398</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7903</td>
			<td>BioXtra, &#8805;99.5% (GC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-pregnant female C57BL/6 mice</td>
			<td>Texas A&#38;M Institue for Genomic Medicine</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-bore blue pipette tips P1000</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83007-380</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying spontaneous ca2+ fluxes and their downstream effects in primary mouse midbrain neurons

Parkinson hastalığı (PH) dopaminerjik dejenerasyonu neden yıkıcı bir nörodejeneratif hastalıktır (DA) nöronlar. Glutamat reseptörlerinin anormal aktivasyonuna bağlı aşırı Ca2+ akını DA eksitotoksisite ile sonuçlanır ve DA nöron kaybı için önemli bir mekanizma olarak tanımlanmışlardır. Bu çalışmada, ED14 fare embriyolarının fare ventral mesensefalonundan (VM) orta beyin nöronlarını izole ediyoruz, ayrıştırıyoruz ve kültürümüz var. Daha sonra bir adeno-ilişkili virüs ile uzun vadeli birincil fare orta beyin kültürleri enfekte (AAV) genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi ifade, GCaMP6f insan nöron özgü sinapsin organizatörü kontrolü altında, hSyn. Canlı konfokal görüntüleme kullanarak, kültürlü fare orta beyin nöronların AAV-hSyn-GCaMP6f tarafından saptanır spontan Ca2+ akıları gösterdiğini gösteriyoruz. Orta beyin kültürleri glutamat Banyo uygulaması nöronlar içinde hücre içi Ca2 + anormal yükselmelere neden olur ve bu DA nöronlarda kaspas-3 aktivasyonu eşlik eder, immünboyama ile gösterildiği gibi. Primer fare DA nöronlarında glutamat aracılı apoptozu belirleme teknikleri, DA nöron sağlığını koruyan ilaçların yüksek içerikli taraması için önemli uygulamalara sahiptir.

Hücrelerin ilk birliş sonra, 14 DIV de VM kültür yemekleri tedavi 1 μL AAV hSyn-GCaMP6f ve viral ifade 5 gün için izin. Görüntüleme gününde HEPES kayıt tamponu taze olarak hazırlandı. İki şart kullandık; bir koşulda 10 dakika boyunca 20 μM glutamat uygulanırken, diğer durumda 10 μM NBQX uygulaması5 dk 10 min co-uygulama dan önce 10 μM NBQX + 20 μM glutamat uygulandı. Her iki durumda da GCaMP6f floresansında, temsili izlerde gösterildiği gibi spontan Ca2+ akılarını gösteren heterojen ve spontan değişiklikler gözlendik (Şekil 1A,B, Ek Film 1-2). Uygulama 20 μM glutamat spontan aktif ve quiescent nöronlarda sağlam ve sürekli Ca2 + yanıt üretti(Şekil 1A, Ek Film 1). 10 μM NBQX uygulaması spontan aktiviteyi azalttı ve glutamat yanıtını kısmen engelledi (Şekil 1B, Ek Film 2). Glutamat uygulamasının her koşulda Ca2+ yanıtını uyardığı ölçüde eğrinin altındaki alan, tepe genliği ve yanıt gecikmesi kullanılarak ölçüldü. Eğri nin altındaki her iki alan ve pik genlik hem glutamat hem de NBQX + glutamat tedavi edilen durumlar için benzerdi (Şekil 1C),Yanıt gecikmesi Ise NBQX + glutamat durumunda(Şekil 2A,B). Ca2+ yanıtını glutamat tedavisine ölçmenin yanı sıra, glutamat aracılı apoptozun bir ölçüsü olarak bir anti-caspase-3 antikor ile numuneleri sabitledik ve boyadı. Koşullar arasında bir dizi kaspas-3 aktivasyonu gözlemledik(Şekil 3A,B). Caspase-3 aktivasyonu ölçüm alanı ve ortalama caspase-3 yoğunluğu ile ölçüldü. İşlenmemiş kontrol hücreleri ile karşılaştırıldığında, glutamat ve NBQX + glutamat koşulları altında kaspaz-3 aktivasyonu olan hücrelerin ortalama alan önemi ne doğru eğilimli(Şekil 3B). İşlenmemiş kontrollere göre glutamat ve NBQX + glutamat koşullarında ortalama kaspas-3 şiddeti anlamlı olarak yüksekti (Şekil 3B). Bu sonuçlar birlikte, eksitotoksik ajanlara Göre Ca2+ yanıtlarının ölçülebileceği ve aynı kültür kümesinde caspase-3 aktivasyonu gibi aşağı akım apoptotik olayların analizi ile takip edilebilen yüksek içerikli bir çerçeve göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig01.jpg"> Şekil 1: Kültürlü ventral mesensefalik nöronlar spontan Ca2+ aktivitesini gösterir ler ve glutamat uygulaması ile sağlam bir şekilde uyarılırlar. (A) VM nöronlarında spontan Ca2+ aktivitesinin ve 20 μM Glutamat uygulamasına yanıtlarının temsilcisi izleri. (B) VM nöronlarında spontan Ca2+ aktivitesinin ve bunların 10 μM NBQX + 20 μM Glutamat uygulamasına yanıtının temsilcisi izleri. (C) Ca2+ izlerinin eğri ve tepe genliğini altındaki alanı gösteren nüfus verileri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig02v3.jpg"> Şekil 2: NBQX ile AMPAR bloku kültürlü ventral mesensefalik nöronlarda glutamat uygulamasına yanıtı geciktirir. (A) Temsilci Ca2+ glutamat (gri) ve NBQX + glutamat (mavi) uyarılmış yanıtlar izleri. Ortalama Ca2+ glutamat (siyah) ve NBQX + glutamat (kırmızı) izleri overlaid gösterilir. (B) Glutamat ve NBQX + glutamat için yanıt gecikmesi gösteren nüfus verileri uyarılmış yanıtları. Sağ panelde glutamat ve NBQX + glutamat koşulları arasındaki yüzde değişim görüntülenir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig02v3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61481/61481fig03v3.jpg"> Şekil 3: Glutamat uygulaması tirozin hidroksilaz (TH) pozitif ventral mesensefalik nöronlarda caspase-3 ekspresyonunu arttırır. (A) VM kültürlerinin temsili konfokal görüntüleri kaspaz-3 (yeşil) ve TH (kırmızı), ölçek çubuğu = 10 μm. (B) Da nöron alanını gösteren nüfus verileri ve her durumda kaspaz-3 ifadesinin ortalama gri değeri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61481/61481fig03v3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Film 1: Spontan Ca2+ aktivitesi ve glutamat uygulamasına yanıt. HEPES kayıt tamponu (0-300 s) varlığında spontan Ca2+ akıları ve ardından 20 μM glutamat (301-600 s) uygulaması. Ölçek çubuğu = 50 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61481/Supplementary_Movie%201_glutamate_ver_2.avi" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>
Ek Film 2: Spontan Ca2+ aktivitesi ve NBQX + glutamat uygulamasına yanıt. HEPES kayıt tamponu (0-300 s) varlığında spontan Ca2+ akıları ve ardından 10 μM NBQX (301-600 s) ve 10 μM NBQX + 20 μM glutamat (601-900 s) uygulama. Ölçek çubuğu = 50 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61481/Supplementary_Movie_2_NBQX_glut.avi" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons at JoVE.com

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Burada in vitro Ca 2+ akıları orta beyin nöronlar ve caspase-3 üzerinde downstream etkilerini birincil fare orta beyin kültürleri kullanarak ölçmek için bir protokol sokuldu. Bu model, orta beyin nöronlarında anormal Ca2+ aktivitesi ile ilgili patofizyolojik değişiklikleri incelemek ve anti-apoptotik özellikler için yeni terapötikleri taramak için kullanılabilir.

Primer Fare Orta Beyin Nöronlarında Spontan Ca2+ Akılarının ve Downstream Etkilerinin Ölçülmesi

Parkinson&#8217;s disease (PD) is a devastating neurodegenerative disorder caused by the degeneration of dopaminergic (DA) neurons. Excessive Ca2+ influx ...

Bu protokol, Parkinson hastalığında kaybolan dopaminerjik nöronlarda kalsiyum akılarını ölçer. Bu anormal kalsiyum Parkinson hastalığında dopaminerjik nöron kaybına neden olduğunu anlamak için yararlıdır. İlk defa, kültürlü birincil orta beyin nöronlarında spontan kalsiyum akıları gösteriyoruz.Bu yöntem kalsiyum aracılı apoptozda yer alan spesifik reseptör katkılarını incelemek için kullanılabilir. Yöntemimiz Parkinson hastalığı için özel ve etkili nöroprotektif bileşikler keşfetmek için yüksek içerikli ilaç ekranları için bir cadde sağlar. Bu nöroprotektif bileşikler dopaminerjik nöronda kalsiyum aracılı apoptoz önleyeceği.Bir mililitre serumsuz DMEM ortamını, her yemek başına bir mikrolitre hSyn-GCaMP6f AAV ile hazırlayarak başlayın. Her yemekten hücre kültürü ortamını aspire edin ve hazırladığım DMEM'in bir mililitresini hSyn-GCaMP6f ile değiştirin. Bulaşıkları bir saat liğine 37 santigrat derecelik kuvöze geri yerleştirin.Kuluçkadan sonra, aTV ile orta aspire ve hücre kültürü orta üç mililitre ile değiştirin. Bulaşıkları 37 derecede 5-7 gün kuluçkaya yatırın. Viral enfeksiyon bu dönemde her iki veya üç günde bir orta değiştirme.HEPES kayıt tamponunun bir litresini, 20 mikromolar glutamat kayıt tamponunun 200 mililitresini ve el yazması yönlere göre 200 mililitre 10 mikromolar NBQX kayıt tamponu hazırlayın. Steril 35 milimetrelik Petri kabını üç mililitre kayıt tamponuyla doldurun. Kuvözden enfekte kültürlerile Petri çanak alın, sonra dikkatle ince uç forceps ile bir kapak kayma kenarına kapmak ve kayıt tampon ile çanak içine aktarın.Kalan kapak fişini orta geri 37 derece lik inkübatöre yerleştirin ve kabı nodakmikroskobun kayıt tamponuyla birlikte taşıyın. Görüntüleme yazılımını başlatın. Bu baş harfe dönüşürken, peristaltik pompayı çalıştırın ve hattı kayıt tamponuna yerleştirin.Daha sonra akışı dakikada iki mililitreye kalibre edin. Enfekte kapak fişini Petri kabından ince çifenerlerle kayıt banyosuna aktarın. 10X su daldırma hedefi ve brightfield ışığı kullanarak, odak düzlemi bulmak ve nöron hücre organlarının yüksek yoğunluklu bir bölge aramak, sonra 40X objektif geçiş ve örnek yeniden odaklama.Boyalar listesi penceresinde AlexaFluor 488'i seçin ve uygulayın. Floroforların aşırı pozlamasını ve fotoğraf beyazlatmalarını önlemek için düşük HV ve lazer güç ayarlarıile başlayın. AlexaFluor 488 kanalı için HV'yi 500'e, kazancı 1x'e ve mahsupı sıfıra ayarlayın.488 lazer hattı için gücü %5'e ayarlayın. İğne deliği boyutunu 300 mikrometreye yükseltin ve emisyon sinyallerini subsatürasyon seviyelerine en iyi şekilde ayarlamak için odak x2 tarama seçeneğini kullanın. Ayarlar daha sonra her kanalın en iyi görünürlüğü için ayarlanabilir.Mikroskop ayarları optimize edildikten sonra, sahneyi GCaMP6f floresansında spontan değişiklikler gösteren birden fazla hücreye sahip bir bölgeyi bulmak için hareket ettirin ve görüntüleme için istenilen düzleme odaklanın. Görüntüleme çerçevesini bir saniyenin altında bir kare aralığına ulaşabilecek bir boyuta çekmek için Küçükler düzeltme aracını kullanın. Aralık penceresini 1,0 değerine, Num penceresini 600'e ayarlayın.Bir t serisi filmi yakalamak için Saat seçeneğini seçin ve ardından görüntülemeye başlamak için Xyt tarama seçeneğini kullanın. Görüntüleme ilerleme çubuğunu izleyin ve hattı HEPES kayıt tamponundan uygun zaman noktasında 20 mikromolar glutamat kayıt tamponuna taşıyın. Görüntüleme tamamlandığında, dizi bitti düğmesini seçin ve bitmiş t-serisi film kaydedin.Nöron kültürü toplam 10 dakika glutamata maruz kalmış böylece ek bir beş dakika için glutamat perfuse devam edin. Görüntülenecek her kapak fişi için bu işlemi tekrarlayın. Deneyden hemen sonra kalsiyum izlerini ve nöronal hücre gövdelerini görmek mümkündür.Nöronal soma etrafında ROI istenilen sayıda çizmek için Elips aracını kullanın. İzleri görselleştirmek için Seri Analizi düğmesini kullanın. Glutamata beş dakikalık ek maruzkaldıktan sonra, ince prömiyer lerle banyodan kapak fişini çıkarın ve tüm görüntüleme tamamlanana kadar kayıt tamponuyla petri kabına geri yerleştirin.Görüntüleme gününde VM kültürleri glutamat veya glutamat ve NBQX kombinasyonu ile tedavi edildi. Her iki durumda da GCaMP6f floresansında spontan kalsiyum akılarını gösteren heterojen ve spontan değişiklikler gözlendi. Glutamat uygulaması hem spontan aktif hem de quiescent nöronlarda sağlam ve sürekli bir kalsiyum yanıtı üretti.NBQX uygulaması spontan aktiviteyi azalttı ve glutamat yanıtını kısmen engelledi. Glutamat uygulamasının her koşulda kalsiyum yanıtını uyardığı ölçüde eğrinin altındaki alan kullanılarak ölçüldü, pik genlik, ve yanıt gecikmesi. Yanıt gecikmesi NBQX ve glutamat durumu altında artmıştır.Glutamat aracılı apoptoz ölçmek için, hücreler sabit ve bir anti-Caspase-3 antikor ile lekeli edildi. Ortalama kaspas-3 şiddeti her iki tedavi koşulunda da tedavi edilmeyen kontrollere göre anlamlı olarak yüksekti. Heyecanlı toksik hücre ölümü daha ayrıntılı bir analiz kontrol ve glutamat tedavi durumda immünostain tirozin hidroksilaz pozitif dopaminerjik nöronların sayısı sayılarak yapılabilir.Bu teknik, dopaminerjik nöronda kalsiyum aracılı apoptozda yer alan farklı reseptörlerin ve demir kanallarının göreceli katkılarını anlamanın yolunu açmıştır.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Quantifying Spontaneous Ca2+ Fluxes and their Downstream Effects in Primary Mouse Midbrain Neurons

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Embriyonik Fare Hipokampal ve Kortikal nöronlar primer Nucleofection ve Kültür

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons

Görüntüleme İlköğretim Kültürlü Fare Nöronlar içinde Plazma Membran Reseptör Yerleştirme pHluorin etiketli

A better understanding of the mechanisms governing receptor trafficking between the plasma membrane (PM) and intracellular compartments requires an ...

Calcium Phosphate Transfection of Primary Hippocampal Neurons

Primer hipokampal nöronlar kalsiyum fosfat transfeksiyonu

Calcium phosphate precipitation is a convenient and economical method for transfection of cultured cells. With optimization, it is possible to use this ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Fare dopaminerjik nöronlar İlköğretim Kültür

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Environmental Modulations of the Number of Midbrain Dopamine Neurons in Adult Mice

Yetişkin Farelerde Orta beyin dopamin Nöronlar Sayısının Çevre Modülleri

Long-lasting changes in the brain or &#8216;brain plasticity&#8217; underlie adaptive behavior and brain repair following disease or injury. Furthermore, ...

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Fluorescence and Bioluminescence Imaging of Subcellular Ca2+ in Aged Hippocampal Neurons

Subselüler Ca Floresans ve Biyoparlaklık Görüntüleme<sup&gt; 2+</sup&gt; Yaşlı Hipokampal Nöronlar

Susceptibility to neuron cell death associated to neurodegeneration and ischemia are exceedingly increased in the aged brain but mechanisms responsible ...

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Modelleme nöronal ölüm ve fare birincil serebellar granül nöronlar dejenerasyon

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

Live Images of GLUT4 Protein Trafficking in Mouse Primary Hypothalamic Neurons Using Deconvolution Microscopy

GLUT4 protein Deconvolution mikroskobu kullanarak fare birincil hipotalamik nöronlarda ticareti canlı görüntüleri

Type 2 diabetes mellitus (T2DM) is a global health crisis which is characterized by insulin signaling impairment and chronic inflammation in peripheral ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

Fare birincil Oligodendrocytes hızlı ve spesifik Immunomagnetic izolasyonu

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid &#946; Effects in Cultured Mouse Neurons

Visualizing Axonal Growth Cone Collapse and Early Amyloid ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â² Effects in Cultured Mouse Neurons

Aksonal büyüme koni çöküşü ve erken amiloid β sonuç kültürlü fare nöronlar içinde görüntülenmesi

Amyloid-&#946; (A&#946;) causes memory impairments in Alzheimer's disease (AD). Although therapeutics have been shown to reduce A&#946; levels in the ...