Name: oxygen-induced retinopathy model for ischemic retinal diseases in rodents
Uploaded: 2020-09-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents at JoVE.com

Vi takker Marianne Karlsberg, Anne Mari Haapaniemi, Päivi Partanen og Anne Kankkunen for fremragende teknisk support. Dette arbejde blev finansieret af Finlands Akademi, Päivikki og Sakari Sohlberg Foundation, Tampere Tuberculosis Foundation, Finnish Medical Foundation, Pirkanmaa Hospital District Research Foundation og Tampere University Hospital Research Fund.

Den her beskrevne protokol er godkendt af Finlands nationale dyresundhedskomité (protokolnummer ESAVI/9520/2020 og ESAVI/6421/04.10.07/2017).
1. Forsøgsdyr og mus OIR model induktion
BEMÆRK: Brug tidsmåttede dyr, f.eks. almindeligt anvendte C57BL/6J-mus, til at få hvalpe født samme dag. Brug plejedæmninger, f.eks. 129 stamme (129S1/SvImJ eller 129S3/SvIM) ammende dæmninger, til at pleje hvalpene under og efter induktion af hyperoxi. Alternativt kan du sørge f...

Sværhedsgraden af sygdom fænotype er afhængig af både stammen og endda sælger i både mus og rotte OIR modeller23. Dette tyder på, at der er en bred genotypisk variation i patologisk udvikling. Generelt udvikler pigmenterede gnavere mere alvorlig fænotype end albinoerne. F.eks. revasculariseres nethindevaculaturen af albino BALB/c hurtigt efter hyperoxi og udvikler slet ikke NV24. Tilsvarende viser pigmenterede Brune Norge rotter hos rotter mere alvorlig patologi end...

Pålidelige og reproducerbare eksperimentelle modeller er nødvendige for at studere patologien bag angiogene øjensygdomme og for at udvikle nye terapeutiske til disse ødelæggende sygdomme. Patologisk angiogenese er kendetegnende for våd aldersrelateret makuladegeneration (AMD) og for mange iskæmiske nethindesygdomme blandt dem retinopati af prematurity (ROP), proliferativ diabetisk retinopati (PDR) og retinale vene okklusion (RVO)1,2,3,4. Humane og gnaver nethinder følge et lignende udviklingsmønster, som både menneskelige og gnaver nethinden er blandt de sidste væv, der er vaskulære. Før nethindens vaskulatur er helt udviklet, modtager nethinden sin næringsstofforsyning fra hyaloid vaskulatur, som igen regresserer, når nethindens vaskulatur begynder at udvikle1,2. Hos mennesker er nethindevakulær udvikling afsluttet før fødslen, mens væksten af nethindevakulature hos gnavere sker efter fødslen. Da nethinden vaskulær udvikling sker postnatally hos gnavere, giver det et ideelt modelsystem til at studere angiogenese2,3. De nyfødte gnavere har en avascular nethinde, der udvikler sig gradvist, indtil fuldstændig vaskulær nethinden udvikling er opnået ved udgangen af tredje postnatal uge4. De voksende blodkar af neonatal mus er plast, og de gennemgår regression under hyperoxia stimulus5.
ROP er den hyppigste årsag til barndommen blindhed i vestlige lande, da det påvirker næsten 70% af de for tidligt fødte spædbørn med fødselsvægt under 1.250 g6,7. ROP forekommer hos for tidligt fødte spædbørn, der er født før nethindefartøjer fuldføre deres normale vækst. ROP skrider frem i to faser: I fase I forsinker præmature fødsel nethindens vaskulære vækst, hvor den ufærdige vaskularisering af den udviklende nethinde efter fase II forårsager hypoxi, hvilket fremkalder udtryk for angiogene vækstfaktorer, der stimulerer ny og unormal vækst iblodkarrene 8. OIR-modellen har været en udbredt model til at studere patofysiologien af ROP og andre iskæmiske retinopatier samt til at teste nye lægemiddelkandidater2,3,9. Det betragtes bredt som en reproducerbar model til gennemførelse af proof-of-concept-undersøgelser for potentielle antiangiogene lægemidler til okulære såvel som ikke-okulære sygdomme. De to gnaver modeller, dvs mus og rotte OIR adskiller sig i deres model induktion og sygdom fænotype. Rottemodellen efterligner ROP-fænotype mere præcist, men musemodellen giver en mere robust, hurtig og reproducerbar model til nethindeneovascularisering (NV). I musemodellen udvikler NV sig til den centrale nethinde. Denne patologiske udlæsning er vigtig i farmakologiske effektundersøgelser for mange iskæmiske retinopatier, såsom PDR, RV og eksudativ AMD samt for ikke-okulære, angiogene sygdomme som kræft. Desuden gør tilgængeligheden af genetisk manipulerede (transgene og knockout) mus musen OIR-modellen til en mere populær mulighed. Men hverken mus eller rotte OIR model skaber nethindefibrose, som er typisk i sygdomme hos mennesker.
Forståelsen af, at høje iltniveauer bidrager til udviklingen af ROP i 1950'erne10,11 førte til udviklingen af dyremodeller. De første undersøgelser om virkningen af ilt på nethindevakulaturen blev udført i 195012,13,14 og indtil 1990'erne var der mange forbedringer af OIR-modellen. Forskningen af Smith et al. i 1994 satte en standard for den nuværende mus OIR model, der adskiller hyaloidopati fra retinopati15. En bred vedtagelse af metoden til at kvantificere vaso-udslettelse og patologisk NV af Connor et al. (2009) yderligere øget sin popularitet16. I denne model placeres mus ved 75% ilt (O2)i 5 dage ved P7, efterfulgt af 5 dage under normoxiske forhold. Hyperoxi fra P7 til P12 forårsager nethindevakulature at regressere i det centrale nethinden. Når man vender tilbage til normoxiske tilstande, bliver avascular nethinden hypoksisk (Figur 1A). På grund af de hypoksiske stimuli i den avaskulære centrale nethinde spirer nogle af nethindens blodkar mod det glasagtige og danner præretinal NV, kaldet præretinal tufts2,3. Disse tufts er umodne, og hyperpermeable. Mængden af NV topper ved P17, hvorefter den går tilbage. Nethinden er fuldt revascularized og NV er fuldt regresseret af P23 - P25 (Figur 2A)2,3.
OIR-modellen for rotter (ved hjælp af forskellige niveauer af O2) blev første gang beskrevet i 1990'erne og viste, at varierende O2-niveauer ved 80% og 40% forårsager mere udtalt NV end under 80% O2 konstant eksponering17. Senere blev det opdaget, at den intermitterende hypoxi model, hvor O2 er cyklet fra hyperoxi (50%) hypoxi (10-12 %), forårsager endnu mere NV end 80/40% O2 model18. I 50/10%-modellen udsættes rotteunger for 50% i 24 timer, efterfulgt af 24 timer i 10% O2. Disse cyklusser fortsættes indtil P14, hvor rotterungerne returneres til normoxiske tilstande (figur 1B). Som hos humane ROP-patienter udvikler avascularområderne i rottemodellen sig til nethindens periferi på grund af umodne nethindevakulære plexus (Figur 3).
I begge modeller er de vigtigste parametre, der normalt kvantificeres, størrelsen af AVA og NV. Disse parametre analyseres typisk fra nethindebeslag, hvor endotelcellerne er mærket4,16. Tidligere blev mængden af præretinal NV evalueret fra nethinde tværsnit ved at tælle blodkar eller vaskulære cellekerner, der strækker sig til glasagtige over den indre begrænsende membran. Den største begrænsning af denne fremgangsmåde er, at det ikke er muligt at kvantificere ava'erne.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>33 gauge, Small Hub RN Needle</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>7803-05, 10mm, 25&#176;, PS4</td>
			<td>For intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe Inc.</td>
			<td></td>
			<td>For image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air pump air100</td>
			<td>Eheim GmbH &#38; Co. KG.</td>
			<td>143207</td>
			<td>For inhalation anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaesthesia unit 410 AP</td>
			<td>Univentor Ltd.</td>
			<td>2360309</td>
			<td>For inhalation anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnalaR NORMAPUR Soda lime</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>22666.362</td>
			<td>For CO2 control during model induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attane Vet 1000 mg/g</td>
			<td>VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY</td>
			<td>vnr 17 05 79</td>
			<td>For inhalation anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For preparation of flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celeris D430 ERG system</td>
			<td>Diagnosys LLC</td>
			<td>121</td>
			<td>For in vivo ERG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes</td>
			<td>Greiner Bio-One International GmbH</td>
			<td>664 160</td>
			<td>For preparation of flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cepetor Vet 1 mg/mL</td>
			<td>VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY</td>
			<td>vnr 08 78 96</td>
			<td>For anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15165452</td>
			<td>For preparation of flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 Controlled InVivo Cabinet, Aninal Filtrarion System and Dehumidifier</td>
			<td>Coy Laboratory Products</td>
			<td></td>
			<td>Closed system for disease model induction, optional for semi-closed system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E702 O2 sensor</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>E207, 1801901</td>
			<td>For oxygen level measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envisu R2200 Spectral Domain Optical Coherence Tomograph (SD-OCT)</td>
			<td>Bioptigen, Inc.</td>
			<td>BPN000668</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye spears</td>
			<td>Beaver-Visitec International, Inc.</td>
			<td>0008685</td>
			<td>For intravitreal injection and in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexilux 600LL Cold light source</td>
			<td>Mikron</td>
			<td>11140</td>
			<td>For intravitreal injection or tissue collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein sodium salt</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>F6377-100G</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Exhaust unit (+Double 3-way valve, mouse and rat face masks, UNOsorb filter)</td>
			<td>UNO Roestvaststaal BV</td>
			<td>GEX 17015249</td>
			<td>For inhalation anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe, Model 65 RN</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>7633-01</td>
			<td>For intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRA2 Retina angiograph (FA)</td>
			<td>Heidelberg Engineering GmbH</td>
			<td>Spec-KT-05488</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>I21411</td>
			<td>For labeling retinal vasculature on flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketaminol Vet 50 mg/mL</td>
			<td>Intervet International B.V.</td>
			<td>vnr 51 14 85</td>
			<td>For anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medicinal Oxygen gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For disease model induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice C57BL/6JRj</td>
			<td>Janvier Labs</td>
			<td></td>
			<td>Also other strains possible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td>For preparation of flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minims Povidone Iodine 5% (unit)</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb U.K Limited</td>
			<td>vnr 24 11 304</td>
			<td>For intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For disease model induction (rat)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oftan Chlora 10 mg/g</td>
			<td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td>
			<td>vnr 55 01 11</td>
			<td>For intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml</td>
			<td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td>
			<td>vnr 55 03 43</td>
			<td>For in vivo ERG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oftan Obucain 4 mg/ml</td>
			<td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td>
			<td>vnr 55 03 50</td>
			<td>For intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oftan Tropicamid 5 mg/ml</td>
			<td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td>
			<td>vnr 04 12 36</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProOx Model 110 O2 controller and animal chamber</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>803</td>
			<td>For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProOx Model P360 O2 controller and animal chamber</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>538</td>
			<td>For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rats CD(SD)</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td>Also other strains possible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Revertor 5 mg/mL</td>
			<td>VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY</td>
			<td>vnr 13 04 97</td>
			<td>For anaesthesia reversal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For humidity control during model induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Systane Ultra 10ml</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>Tamro 2050250</td>
			<td>For hydration of the eye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Systane Ultra unit 0.7ml</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>Tamro 2064871</td>
			<td>For hydration of the eye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1343-9108</td>
			<td>For preparation of flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VENTI-Line VL 180 PRIME Drying oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VL180S 170301</td>
			<td>For drying silica gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiScope SZT350 Stereomicroscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td>481067</td>
			<td>For intravitreal injection or tissue collection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oxygen-induced retinopathy model for ischemic retinal diseases in rodents

En af de almindeligt anvendte modeller for iskæmiske retinopatier er den ilt-inducerede retinopati (OIR) model. Her beskriver vi detaljerede protokoller for OIR-modellens induktion og dens udlæsninger hos både mus og rotter. Retinal neovascularisering induceres i OIR ved at udsætte gnaverunger enten for hyperoxi (mus) eller vekslende niveauer af hyperoxi og hypoxi (rotter). De primære udlæsninger af disse modeller er størrelsen af neovaskulære (NV) og avascular (AVA) områder i nethinden. Denne prækliniske in vivo-model kan bruges til at evaluere effekten af potentielle antiangiogene lægemidler eller til at adressere specifikke geners rolle i nethindens angiogenese ved hjælp af genetisk manipulerede dyr. Modellen har en vis belastning og leverandørspecifik variation i OIR induktion, som bør tages i betragtning ved udformningen af eksperimenterne.

Det vigtigste resultat af modellen er den vaskulære fænotype: størrelsen af AVAs og mængden af NV. I musemodellen OIR forekommer vaso-udslettelsen i den centrale nethinde (Figur 2A), mens den i rottemodellen udvikler sig i periferien,dvs. Dette skyldes, at den overfladiske vaskulære plexus allerede har udviklet sig, når mus udsættes for hyperoxi, mens nethinden i rottemodellen er avascular på tidspunktet for OIR induktion (P0). Pr...

Watch this Scientific Journal Video about Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents at JoVE.com

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

Oxygen-induceret retinopati (OIR) kan bruges til at modellere iskæmiske nethindesygdomme såsom retinopati af prematurity og proliferativ diabetisk retinopati og til at tjene som model for proof-of-concept undersøgelser i evalueringen af antiangiogene lægemidler til neovaskulære sygdomme. OIR fremkalder robust og reproducerbar neovascularisering i nethinden, der kan kvantificeres.

Oxygen-induceret retinopati Model for iskæmiske retinale sygdomme hos gnavere

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Gene Transfer for Ischemic Heart Failure in a Preclinical Model

Various emerging technologies are being developed for patients with heart failure. Well-established preclinical evaluations are necessary to determine ...

A Simplified Technique for Producing an Ischemic Wound Model

En forenklet teknik til at producere et iskæmisk sår model

One major obstacle in current diabetic wound research is a lack of an ischemic wound model that can be safely used in diabetic animals. Drugs that work ...

High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

Højt indhold Screening i neurodegenerative sygdomme

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Nethindeløsning Model i Gnavere ved subretinal Injektion af Natriumhyaluronats

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Remote Limb Ischemic Preconditioning:  A Neuroprotective Technique in Rodents

Fjernbetjening Limb iskæmisk konditionering: En neuroprotektiv Teknik i Gnavere

Sublethal ischemia protects tissues against subsequent, more severe ischemia through the upregulation of endogenous mechanisms in the affected tissue. ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

Udførelse subretinale Injektioner i Gnavere at levere retinale pigmentepitel celler i suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

Kvantitativ Fundus Autofluorescens for Vurdering af retinale sygdomme

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

En akut Retinal Model for Evaluering Blood Retinal Barrier tilsidesættelse og potentielle lægemidler til behandling

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

En Ex Vivo vævskultur Model for Fibrovascular komplikationer i proliferativ diabetisk retinopati

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

A Murine Model of Ischemic Retinal Injury Induced by Transient Bilateral Common Carotid Artery Occlusion

En Murine Model af iskæmisk Retinal Skade induceret af forbigående bilaterale fælles halspulsåren Okklusion

Diverse vascular diseases such as diabetic retinopathy, occlusion of retinal veins or arteries and ocular ischemic syndrome can lead to retinal ischemia. ...