Name: oxygen-induced retinopathy model for ischemic retinal diseases in rodents
Uploaded: 2020-09-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents at JoVE.com

אנו מודים למריאן קרלסברג, אן מארי הפנימי, פיבי פרטנן ואן קנקונן על תמיכה טכנית מצוינת. עבודה זו מומנה על ידי האקדמיה של פינלנד, Päivikki ו Sakari סולברג קרן, טמפרה שחפת קרן, קרן רפואית פינית, קרן המחקר המחוזית בית החולים Pirkanmaa וקרן המחקר של בית החולים אוניברסיטת טמפרה.

הפרוטוקול המתואר כאן אושר על ידי הוועדה הלאומית לאתיקה של בעלי חיים בפינלנד (מספר פרוטוקול ESAVI/9520/2020 ו- ESAVI/6421/04.10.07/2017).
1. אינדוקציה של מודל OIR של בעלי חיים ועכבר ניסיוניים
הערה: השתמש בבעלי חיים שהזדווגו בזמן, למשל, עכברי C57BL/6J נפוצים, כדי לקבל גורים שנולדו באותו י?...

חומרת פנוטיפ המחלה תלויה הן בזן ואפילו בספק בדגמי OIR של עכברים וחולדות23. הדבר מצביע על כך שקיימת שונות גנוטיפית רחבה בהתפתחות הפתולוגית. באופן כללי, מכרסמים פיגמנטיים מפתחים פנוטיפ חמור יותר מאשר אלה לבקן. לדוגמה, כלי הדם ברשתית של לבקן BALB / c revascularizes במהירות לאחר hyperoxia ואינו מפ?...

מודלים ניסיוניים אמינים ומשוחזרים נדרשים כדי לחקור את הפתולוגיה שמאחורי מחלות עיניים אנגיוגניות ולפתח טיפולים חדשניים למחלות הרסניות אלה. אנגיוגנזה פתולוגית היא סימן ההיכר לניוון מקולרי רטוב הקשור לגיל (AMD) ועבור מחלות רשתית איסכמיות רבות ביניהן רטינופתיה של פגות (ROP), רטינופתיה סוכרתית מתפשטת (PDR) וחסימה של ורידים ברשתית (RVO)1,2,3,4. רשתית אנושית ומכרסמים בצע דפוס דומה של התפתחות, כמו רשתית הן אנושי מכרסמים הם בין הרקמות האחרונות כי הם vascularized. לפני כלי הדם ברשתית התפתחה לחלוטין, הרשתית מקבלת את אספקת התזונה שלה מן כלי הדם לשון, אשר, בתורו, רגרסיה כאשר כלי הדם ברשתית מתחיל לפתח1,2. אצל בני אדם, התפתחות כלי הדם ברשתית הושלמה לפני הלידה, ואילו מכרסמים הצמיחה של כלי הדם ברשתית מתרחשת לאחר הלידה. מאז התפתחות כלי הדם ברשתית מתרחשת לאחר הלידה מכרסמים, הוא מספק מערכת מודל אידיאלי ללמוד את אנגיוגנזה2,3. מכרסמים שזה עתה נולד יש רשתית כלי הדם המתפתחת בהדרגה עד פיתוח רשתית כלי הדם המלא מושגת עד סוף השבוע השלישי לאחר הלידה4. כלי הדם הגדלים של עכבר יילודים הם פלסטיק, והם עוברים רגרסיה במהלך גירוי hyperoxia5.
ROP היא הגורם המוביל לעיוורון בילדות במדינות המערב, שכן היא משפיעה על כמעט 70% מהפגים עם משקל לידה מתחת לגיל 1,250גרם 6,7. ROP מתרחשת אצל פגים שנולדים לפני כלי הרשתית להשלים את הצמיחה הרגילה שלהם. ROP מתקדמת בשני שלבים: בשלב I, לידה מוקדמת מעכבת את צמיחת כלי הדם ברשתית שבו לאחר שלב II, כלי הדם הלא גמורים של הרשתית המתפתחת גורמים להיפוקסיה, אשר גורמת לביטוי של גורמי גדילה אנגיוגניים הממריצים צמיחה חדשה ולא תקינה של כליהדם 8. מודל OIR היה מודל נפוץ לחקור את הפתופיזיולוגיה של ROP רטינופתיות איסכמיות אחרות, כמו גם כדי לבדוק מועמדים לתרופה הרומן2,3,9. זה נחשב באופן נרחב כמודל לשחזור לביצוע מחקרים הוכחת הרעיון עבור תרופות אנטי אנגיוגניות פוטנציאליות למחלות עיניים, כמו גם שאינם עינית. שני דגמי מכרסמים כלומר, עכבר וחולדה OIR שונים במודל שלהם אינדוקציה ומחלות פנוטיפ. מודל החולדה מחקה פנוטיפ ROP בצורה מדויקת יותר, אך מודל העכבר מספק מודל חזק יותר, מהיר יותר וניתן לשחזור עבור neovascularization הרשתית (NV). במודל העכבר, NV מפתחת לרשתית המרכזית. קריאה פתולוגית זו חשובה במחקרי יעילות פרמקולוגית עבור רטינופתיות איסכמיות רבות, כגון PDR, קרוואנים ו- AMD אקסוידטיבי, כמו גם למחלות אנגיוגניות שאינן עיניות כגון סרטן. יתר על כן, הזמינות של עכברים שעברו מניפולציה גנטית (מהונדסת ונוקאאוט) הופכת את דגם OIR של העכבר לאפשרות פופולרית יותר. עם זאת, לא עכבר ולא עכברוש מודל OIR יוצר פיברוזיס ברשתית, אשר אופייני במחלות אנושיות.
ההבנה כי רמות חמצן גבוהות תורמות להתפתחות ROP בשנות החמישים10,11 הוביל לפיתוח מודלים של בעלי חיים. המחקרים הראשונים על השפעת החמצן על כלי הדם ברשתית נעשו בשנת 195012,13,14 ועד שנות התשעים היו עידונים רבים למודל OIR. המחקר של סמית ואח 'בשנת 1994 קבע תקן עבור מודל OIR העכבר הנוכחי המפריד בין עצם הלשון לרטינופתיה15. אימוץ רחב של השיטה לכמת vaso-השמדת NV פתולוגי על ידי קונור ואח '(2009) עוד יותר הגדיל את הפופולריות שלה16. במודל זה, עכברים ממוקמים ב 75% חמצן (O2) במשך 5 ימים ב P7, ואחריו 5 ימים בתנאים נורמוקסיים. Hyperoxia מ P7 כדי P12 גורם כלי הדם ברשתית לסגת ברשתית המרכזית. עם החזרה לתנאים הנורמוקסיים, הרשתית הופכת להיפוקסית (איור 1A). בשל הגירויים ההיפוקסיים של הרשתית המרכזית, חלק מכלי הדם ברשתית צומחים לכיוון הזגוגית, ויוצרים NV preretinal, הנקרא tufts preretinal2,3. ציצים אלה אינם בוגרים, ו hyperpermeable. כמות פסגות NV ב P17, לאחר מכן הוא נסוג. הרשתית היא revascularized מלא NV הוא נסוג לחלוטין על ידי P23 - P25 (איור 2A)2,3.
מודל OIR עכברוש (באמצעות רמות משתנות של O2) תואר לראשונה בשנות התשעים מראה כי משתנה O2 רמות ב 80% ו 40% לגרום NV בולט יותר מאשר תחת 80% O2 חשיפה מתמדת17. מאוחר יותר התגלה כי מודל היפוקסיה לסירוגין, שבו O 2 הוא רכב עלאופניים מ hyperoxia (50%) כדי היפוקסיה (10-12%), גורם אפילו יותר NV מאשר 80/40% O2 מודל18. במודל 50/10%, גורי חולדות חשופים ל -50% במשך 24 שעות, ואחריו 24 שעות ב -10% O2. מחזורים אלה נמשכים עד P14, כאשר גורי החולדות מוחזרים לתנאים נורמוקסיים (איור 1B). כמו בחולי ROP אנושיים, במודל החולדה מתפתחים אזורי החוליות לפריפריה של הרשתית בגלל מקלעת כלי דם רשתית לא בוגרת (איור 3).
בשני הדגמים, הפרמטרים העיקריים שבדרך כלל מכמתים הם בגודל של AVA ו- NV. פרמטרים אלה מנותחים בדרך כלל מן תושבות שטוחות ברשתית שבו תאי האנדותל מסומנים4,16. בעבר כמות NV preretinal הוערך חתכים ברשתית על ידי ספירת כלי דם או גרעיני תא כלי הדם המשתרעים זגוגית מעל הממברנה המגבילה הפנימית. המגבלה העיקרית של גישה זו היא שלא ניתן לכמת את ה- AVAs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>33 gauge, Small Hub RN Needle</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>7803-05, 10mm, 25&#176;, PS4</td>
			<td>For intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe Inc.</td>
			<td></td>
			<td>For image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air pump air100</td>
			<td>Eheim GmbH &#38; Co. KG.</td>
			<td>143207</td>
			<td>For inhalation anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaesthesia unit 410 AP</td>
			<td>Univentor Ltd.</td>
			<td>2360309</td>
			<td>For inhalation anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnalaR NORMAPUR Soda lime</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>22666.362</td>
			<td>For CO2 control during model induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attane Vet 1000 mg/g</td>
			<td>VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY</td>
			<td>vnr 17 05 79</td>
			<td>For inhalation anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For preparation of flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celeris D430 ERG system</td>
			<td>Diagnosys LLC</td>
			<td>121</td>
			<td>For in vivo ERG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes</td>
			<td>Greiner Bio-One International GmbH</td>
			<td>664 160</td>
			<td>For preparation of flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cepetor Vet 1 mg/mL</td>
			<td>VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY</td>
			<td>vnr 08 78 96</td>
			<td>For anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15165452</td>
			<td>For preparation of flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 Controlled InVivo Cabinet, Aninal Filtrarion System and Dehumidifier</td>
			<td>Coy Laboratory Products</td>
			<td></td>
			<td>Closed system for disease model induction, optional for semi-closed system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E702 O2 sensor</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>E207, 1801901</td>
			<td>For oxygen level measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envisu R2200 Spectral Domain Optical Coherence Tomograph (SD-OCT)</td>
			<td>Bioptigen, Inc.</td>
			<td>BPN000668</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye spears</td>
			<td>Beaver-Visitec International, Inc.</td>
			<td>0008685</td>
			<td>For intravitreal injection and in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexilux 600LL Cold light source</td>
			<td>Mikron</td>
			<td>11140</td>
			<td>For intravitreal injection or tissue collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein sodium salt</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>F6377-100G</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Exhaust unit (+Double 3-way valve, mouse and rat face masks, UNOsorb filter)</td>
			<td>UNO Roestvaststaal BV</td>
			<td>GEX 17015249</td>
			<td>For inhalation anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe, Model 65 RN</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>7633-01</td>
			<td>For intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRA2 Retina angiograph (FA)</td>
			<td>Heidelberg Engineering GmbH</td>
			<td>Spec-KT-05488</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>I21411</td>
			<td>For labeling retinal vasculature on flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketaminol Vet 50 mg/mL</td>
			<td>Intervet International B.V.</td>
			<td>vnr 51 14 85</td>
			<td>For anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medicinal Oxygen gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For disease model induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice C57BL/6JRj</td>
			<td>Janvier Labs</td>
			<td></td>
			<td>Also other strains possible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td>For preparation of flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minims Povidone Iodine 5% (unit)</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb U.K Limited</td>
			<td>vnr 24 11 304</td>
			<td>For intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For disease model induction (rat)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oftan Chlora 10 mg/g</td>
			<td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td>
			<td>vnr 55 01 11</td>
			<td>For intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml</td>
			<td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td>
			<td>vnr 55 03 43</td>
			<td>For in vivo ERG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oftan Obucain 4 mg/ml</td>
			<td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td>
			<td>vnr 55 03 50</td>
			<td>For intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oftan Tropicamid 5 mg/ml</td>
			<td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td>
			<td>vnr 04 12 36</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProOx Model 110 O2 controller and animal chamber</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>803</td>
			<td>For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProOx Model P360 O2 controller and animal chamber</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>538</td>
			<td>For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rats CD(SD)</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td>Also other strains possible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Revertor 5 mg/mL</td>
			<td>VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY</td>
			<td>vnr 13 04 97</td>
			<td>For anaesthesia reversal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For humidity control during model induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Systane Ultra 10ml</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>Tamro 2050250</td>
			<td>For hydration of the eye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Systane Ultra unit 0.7ml</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>Tamro 2064871</td>
			<td>For hydration of the eye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1343-9108</td>
			<td>For preparation of flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VENTI-Line VL 180 PRIME Drying oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VL180S 170301</td>
			<td>For drying silica gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiScope SZT350 Stereomicroscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td>481067</td>
			<td>For intravitreal injection or tissue collection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oxygen-induced retinopathy model for ischemic retinal diseases in rodents

אחד המודלים הנפוצים עבור רטינופתיות איסכמיות הוא מודל רטינופתיה הנגרמת על ידי חמצן (OIR). כאן אנו מתארים פרוטוקולים מפורטים עבור אינדוקציה מודל OIR ואת הקריאות שלה הן עכברים וחולדות. neovascularization הרשתית הוא המושרה OIR על ידי חשיפת גורי מכרסמים או hyperoxia (עכברים) או לסירוגין רמות של hyperoxia והיפוקסיה (חולדות). הקריאות העיקריות של מודלים אלה הן בגודל של אזורים ניאו-וסקולריים (NV) ו- AVA (AVA) ברשתית. מודל זה preclinical in vivo יכול לשמש כדי להעריך את היעילות של תרופות אנטי אנגיוגניות פוטנציאליות או כדי לטפל בתפקיד של גנים ספציפיים אנגיוגנזה ברשתית באמצעות בעלי חיים מניפולציה גנטית. המודל יש כמה זן וריאציה ספציפית ספק אינדוקציה OIR אשר יש לקחת בחשבון בעת תכנון הניסויים.

התוצאה העיקרית של המודל היא פנוטיפ כלי הדם: גודל AVAs וכמות NV. במודל OIR של העכבר, הוואסו-השמדה מתרחש ברשתית המרכזית(איור 2A),ואילו במודל החולדה שהיא מפתחת בפריפריה, כלומר בדומה ל-ROP22 האנושי(איור 3A). הסיבה לכך היא כי מקלעת כלי הדם השטחית כבר התפתחה כאש?...

Watch this Scientific Journal Video about Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents at JoVE.com

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

רטינופתיה הנגרמת על ידי חמצן (OIR) יכולה לשמש למודל מחלות רשתית איסכמיות כגון רטינופתיה של פגות ורטינופתיה סוכרתית מתפשטת ולשמש כמודל למחקרים הוכחת הרעיון בהערכת תרופות אנטי אנגיוגניות למחלות ניאו-שריריות. OIR גורם neovascularization חזק לשחזור ברשתית שניתן לכמת.

מודל רטינופתיה הנגרמת על ידי חמצן למחלות רשתית איסכמיות במכרסמים

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Gene Transfer for Ischemic Heart Failure in a Preclinical Model

Gene Transfer לאי ספיקת לב איסכמי במודל פרה

Various emerging technologies are being developed for patients with heart failure. Well-established preclinical evaluations are necessary to determine ...

A Simplified Technique for Producing an Ischemic Wound Model

טכניקה פשוטה לייצור דגם פצע איסכמי

One major obstacle in current diabetic wound research is a lack of an ischemic wound model that can be safely used in diabetic animals. Drugs that work ...

High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

הקרנת תוכן גבוהה במחלות ניווניות

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

רשתית דגם ניתוק במכרסמים על ידי הזרקת subretinal של נתרן Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Remote Limb Ischemic Preconditioning:  A Neuroprotective Technique in Rodents

איבר מרוחק איסכמי אכשור קד: טכניקת neuroprotective במכרסמים

Sublethal ischemia protects tissues against subsequent, more severe ischemia through the upregulation of endogenous mechanisms in the affected tissue. ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

ביצוע subretinal זריקות במכרסמים כדי לספק תאי הרשתית פיגמנט האפיתל בהשעיה

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

כמותי הפונדוס autofluorescence עבור הערכת מחלות רשתית

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

במודל רשתית חריפה להערכת תרופות הפרת מכשול רשתית דם פוטנציאל הטיפול

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

מודל תרביות רקמה לשעבר Vivo עבור סיבוכים Fibrovascular Proliferative רטינופתיה סוכרתית

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

A Murine Model of Ischemic Retinal Injury Induced by Transient Bilateral Common Carotid Artery Occlusion

דגם מורין של פגיעה איסכמית ברשתית הנגרמת על ידי חסימת עורקים דו-צדדית משותפת חולפת

Diverse vascular diseases such as diabetic retinopathy, occlusion of retinal veins or arteries and ocular ischemic syndrome can lead to retinal ischemia. ...