Name: oxygen-induced retinopathy model for ischemic retinal diseases in rodents
Uploaded: 2020-09-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents at JoVE.com

Ringraziamo Marianne Karlsberg, Anne Mari Haapaniemi, Päivi Partanen e Anne Kankkunen per l'eccellente supporto tecnico. Questo lavoro è stato finanziato dall'Accademia di Finlandia, dalla Fondazione Päivikki e Sakari Sohlberg, dalla Fondazione per la tubercolosi di Tampere, dalla Fondazione medica finlandese, dalla Fondazione per la ricerca distrettuale ospedaliera di Pirkanmaa e dal Fondo di ricerca ospedaliera dell'Università di Tampere.

Il protocollo qui descritto è stato approvato dal Comitato Nazionale di Etica Animale della Finlandia (numero di protocollo ESAVI/9520/2020 ed ESAVI/6421/04.10.07/2017).
1. Induzione di animali sperimentali e modello OIR di topo
NOTA: Utilizzare animali accoppiati nel tempo, ad esempio topi C57BL/6J comunemente usati, per far nascere i cuccioli lo stesso giorno. Utilizzare dighe che favoriscono, ad esempio 129 dighe in allattamento (129S1/SvImJ o 129S3/SvIM), per all...

La gravità del fenotipo della malattia dipende sia dal ceppo che dal fornitore sia nei modelli OIR del topo che del ratto23. Ciò suggerisce che c'è un'ampia variabilità genotipico nello sviluppo della patologia. In generale, i roditori pigmentati sviluppano fenotipo più grave di quelli albini. Ad esempio, la vascolarizzazione retinica dell'albino BALB/c si rivascolarizza rapidamente dopo l'iperossia e non sviluppa affatto NV24. Allo stesso modo, nei ratti, i ratti cast...

Sono necessari modelli sperimentali affidabili e riproducibili per studiare la patologia alla base delle malattie oculari angiogeniche e per sviluppare nuove terapie a queste malattie devastanti. L'angiogenesi patologica è il segno distintivo per la degenerazione maculare legata all'età umida (AMD) e per molte malattie retiniche ischemiche tra cui retinopatia della prematurità (ROP), retinopatia diabetica proliferativa (PDR) e occlusione della vena retinica (RVO)1,2,3,4. Le retine umane e roditori seguono un modello di sviluppo simile, poiché sia la retina umana che quella dei roditori sono tra gli ultimi tessuti vascolarizzati. Prima che la vascolarizzazione retinica si sia completamente sviluppata, la retina riceve il suo apporto nutritivo dalla vascu caratteristica ialoide, che, a sua volta, regredisce quando la vascolarizzazione retinica inizia asvilupparsi 1,2. Nell'uomo, lo sviluppo vascolare retinale è completato prima della nascita, mentre nei roditori la crescita della vascolarizzazione retinica avviene dopo la nascita. Poiché lo sviluppo vascolare retinale avviene postnatale nei roditori, fornisce un sistema modello ideale per studiare l'angiogenesi2,3. I roditori appena nati hanno una retina avascolare che si sviluppa gradualmente fino a quando lo sviluppo completo della retina vascolare si ottiene entro la fine della terza settimana postnatale4. I vasi sanguigni in crescita del topo neonatale sono di plastica e subiscono regressione durante lo stimolo dell'iperossia5.
Il ROP è la principale causa di cecità infantile nei paesi occidentali, in quanto colpisce quasi il 70% dei neonati prematuri con peso alla nascita inferiore a 1.250 g6,7. La ROP si verifica nei neonati prematuri che nascono prima che i vasi retinali completino la loro crescita normale. La ROP progredisce in due fasi: nella Fase I, la nascita pretermine ritarda la crescita vascolare retinica dove dopo nella fase II, la vascolarizzazione incompiuta della retina in via di sviluppo provoca ipossia, che induce l'espressione di fattori di crescita angiogenici che stimolano la crescita nuova e anomala dei vasisanguigni 8. Il modello OIR è stato un modello ampiamente utilizzato per studiare la fisiopatologia del ROP e di altre retinopatie ischemiche, nonché per testare nuovi candidatiai farmaci 2,3,9. È ampiamente considerato come un modello riproducibile per effettuare studi proof-of-concept per potenziali farmaci antiangiogenetici per malattie oculari e non oculari. I due modelli di roditori, vale a dire l'OIR del topo e del ratto, differiscono nel loro modello di induzione e fenotipo della malattia. Il modello di ratto imita il fenotipo ROP in modo più accurato, ma il modello del mouse fornisce un modello più robusto, veloce e riproducibile per la neovascolarizzazione retinica (NV). Nel modello di topo, NV si sviluppa nella retina centrale. Questa lettura patologica è importante negli studi di efficacia farmacologica per molte retinopatie ischemiche, come PDR, RV e AMD essudativa, nonché per malattie angiogeniche non oculari come il cancro. Inoltre, la disponibilità di topi geneticamente manipolati (transgenici e knockout) rende il modello OIR del topo un'opzione più popolare. Tuttavia, né il modello OIR del topo né quello del ratto creano fibrosi retinica, tipica delle malattie umane.
L'intesa che alti livelli di ossigeno contribuiscono allo sviluppo del ROP negli anni '5010,11 ha portato allo sviluppo di modelli animali. I primi studi sull'effetto dell'ossigeno sulla vascuola retinica sono stati effettuati nel 195012,13,14 e fino agli anni '90 ci sono stati molti perfezionamenti al modello OIR. La ricerca di Smith et al. Un'ampia adozione del metodo per quantificare la vaso-obliterazione e la NV patologica daparte di Connor et al. In questo modello, i topi vengono posti al 75% di ossigeno (O2)per 5 giorni a P7, seguiti da 5 giorni in condizioni normossiche. L'iperossia da P7 a P12 fa regredire la vascolarizzazione retinica nella retina centrale. Al ritorno in condizioni normossiche, la retina avascolare diventa ipossica (Figura 1A). A causa degli stimoli ipossici della retina centrale avascolare, alcuni dei vasi sanguigni retinali germogliano verso il vitreo, formando NV preretinale, chiamati ciuffi preretinali2,3. Questi ciuffi sono immaturi e iperpermeabili. La quantità di NV raggiunge i picchi a P17, dopo di che regredisce. La retina è completamente rivascolarizzata e NV è completamente regredito da P23 - P25 (Figura 2A)2,3.
Il modello OIR del ratto (che utilizza livelli variabili di O2)è stato descritto per la prima volta negli anni '90 dimostrando che vari livelli di O2 all'80% e al 40% causano NV più pronunciato rispetto a meno dell'80% O2 esposizionecostante 17. Più tardi si scoprì che il modello di ipossia intermittente, dove O2 è pedalato dall'iperossia (50%) all'ipossia (10-12 %), causa ancora più NV rispetto all'80/40% O2 modello18. Nel modello 50/10%, i cuccioli di ratto sono esposti al 50% per 24 ore, seguiti da 24 ore nel 10% O2. Questi cicli continuano fino a P14, quando i cuccioli di ratto vengono restituiti a condizioni normossiche (Figura 1B). Come nei pazienti con ROP umano, nel modello del ratto le aree avascolari si sviluppano verso la periferia della retina a causa del plesso vascolare reticolare immaturo (Figura 3).
In entrambi i modelli, i parametri principali che vengono solitamente quantificati sono le dimensioni di AVA e NV. Questi parametri vengono in genere analizzati da supporti piatti retinali in cui le cellule endotelialisono etichettate come 4,16. In precedenza la quantità di NV preretinale era valutata dalle sezioni trasversali retiniche contando i vasi sanguigni o i nuclei cellulari vascolari che si estendevano fino a vitrei al di sopra della membrana limitante interna. La principale limitazione di questo approccio è che non è possibile quantificare gli APA.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>33 gauge, Small Hub RN Needle</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>7803-05, 10mm, 25&#176;, PS4</td>
			<td>For intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe Inc.</td>
			<td></td>
			<td>For image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air pump air100</td>
			<td>Eheim GmbH &#38; Co. KG.</td>
			<td>143207</td>
			<td>For inhalation anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaesthesia unit 410 AP</td>
			<td>Univentor Ltd.</td>
			<td>2360309</td>
			<td>For inhalation anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnalaR NORMAPUR Soda lime</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>22666.362</td>
			<td>For CO2 control during model induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attane Vet 1000 mg/g</td>
			<td>VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY</td>
			<td>vnr 17 05 79</td>
			<td>For inhalation anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For preparation of flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celeris D430 ERG system</td>
			<td>Diagnosys LLC</td>
			<td>121</td>
			<td>For in vivo ERG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes</td>
			<td>Greiner Bio-One International GmbH</td>
			<td>664 160</td>
			<td>For preparation of flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cepetor Vet 1 mg/mL</td>
			<td>VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY</td>
			<td>vnr 08 78 96</td>
			<td>For anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15165452</td>
			<td>For preparation of flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 Controlled InVivo Cabinet, Aninal Filtrarion System and Dehumidifier</td>
			<td>Coy Laboratory Products</td>
			<td></td>
			<td>Closed system for disease model induction, optional for semi-closed system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E702 O2 sensor</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>E207, 1801901</td>
			<td>For oxygen level measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envisu R2200 Spectral Domain Optical Coherence Tomograph (SD-OCT)</td>
			<td>Bioptigen, Inc.</td>
			<td>BPN000668</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye spears</td>
			<td>Beaver-Visitec International, Inc.</td>
			<td>0008685</td>
			<td>For intravitreal injection and in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexilux 600LL Cold light source</td>
			<td>Mikron</td>
			<td>11140</td>
			<td>For intravitreal injection or tissue collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein sodium salt</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>F6377-100G</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Exhaust unit (+Double 3-way valve, mouse and rat face masks, UNOsorb filter)</td>
			<td>UNO Roestvaststaal BV</td>
			<td>GEX 17015249</td>
			<td>For inhalation anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe, Model 65 RN</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>7633-01</td>
			<td>For intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRA2 Retina angiograph (FA)</td>
			<td>Heidelberg Engineering GmbH</td>
			<td>Spec-KT-05488</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>I21411</td>
			<td>For labeling retinal vasculature on flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketaminol Vet 50 mg/mL</td>
			<td>Intervet International B.V.</td>
			<td>vnr 51 14 85</td>
			<td>For anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medicinal Oxygen gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For disease model induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice C57BL/6JRj</td>
			<td>Janvier Labs</td>
			<td></td>
			<td>Also other strains possible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td>For preparation of flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minims Povidone Iodine 5% (unit)</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb U.K Limited</td>
			<td>vnr 24 11 304</td>
			<td>For intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For disease model induction (rat)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oftan Chlora 10 mg/g</td>
			<td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td>
			<td>vnr 55 01 11</td>
			<td>For intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml</td>
			<td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td>
			<td>vnr 55 03 43</td>
			<td>For in vivo ERG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oftan Obucain 4 mg/ml</td>
			<td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td>
			<td>vnr 55 03 50</td>
			<td>For intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oftan Tropicamid 5 mg/ml</td>
			<td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td>
			<td>vnr 04 12 36</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProOx Model 110 O2 controller and animal chamber</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>803</td>
			<td>For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProOx Model P360 O2 controller and animal chamber</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>538</td>
			<td>For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rats CD(SD)</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td>Also other strains possible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Revertor 5 mg/mL</td>
			<td>VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY</td>
			<td>vnr 13 04 97</td>
			<td>For anaesthesia reversal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For humidity control during model induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Systane Ultra 10ml</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>Tamro 2050250</td>
			<td>For hydration of the eye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Systane Ultra unit 0.7ml</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>Tamro 2064871</td>
			<td>For hydration of the eye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1343-9108</td>
			<td>For preparation of flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VENTI-Line VL 180 PRIME Drying oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VL180S 170301</td>
			<td>For drying silica gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiScope SZT350 Stereomicroscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td>481067</td>
			<td>For intravitreal injection or tissue collection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oxygen-induced retinopathy model for ischemic retinal diseases in rodents

Uno dei modelli comunemente usati per le retinopatie ischemiche è il modello di retinopatia indotta dall'ossigeno (OIR). Qui descriviamo protocolli dettagliati per l'induzione del modello OIR e le sue letture sia nei topi che nei ratti. La neovascolarizzazione retinica è indotta nell'OIR esponendo i cuccioli di roditori all'iperossia (topi) o alternando livelli di iperossia e ipossia (ratti). Le letture principali di questi modelli sono le dimensioni delle aree neovascolari (NV) e avascolari (AVA) nella retina. Questo modello preclinico in vivo può essere utilizzato per valutare l'efficacia di potenziali farmaci anti-angiogenici o per affrontare il ruolo di specifici geni nell'angiogenesi retinica utilizzando animali geneticamente manipolati. Il modello presenta alcune variazioni specifiche della deformazione e del venditore nell'induzione OIR che dovrebbero essere prese in considerazione durante la progettazione degli esperimenti.

Il risultato principale del modello è il fenotipo vascolare: la dimensione degli AVA e la quantità di NV. Nel modello OIR del topo, la vaso-obliterazione avviene nella retina centrale (Figura 2A), mentre nel modello di ratto si sviluppa in periferia, cioè simile al ROP22 umano ( Figura3A). Questo perché il plesso vascolare superficiale si è già sviluppato quando i topi sono esposti all'iperossia, mentre nel modello del ratto la reti...

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Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

La retinopatia indotta dall'ossigeno (OIR) può essere utilizzata per modellare malattie retiniche ischemiche come la retinopatia della prematurità e la retinopatia diabetica proliferativa e per servire da modello per studi proof-of-concept nella valutazione dei farmaci antiangiogenetici per le malattie neovascolari. OIR induce una neovascolarizzazione robusta e riproducibile nella retina quantificabile.

Modello di retinopatia indotta dall'ossigeno per le malattie retiniche ischemiche nei roditori

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