Name: oxygen-induced retinopathy model for ischemic retinal diseases in rodents
Uploaded: 2020-09-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents at JoVE.com

Vi takker Marianne Karlsberg, Anne Mari Haapaniemi, Päivi Partanen og Anne Kankkunen for utmerket teknisk støtte. Dette arbeidet ble finansiert av Academy of Finland, Päivikki og Sakari Sohlberg Foundation, Tampere Tuberculosis Foundation, Finnish Medical Foundation, Pirkanmaa Hospital District Research Foundation og Tampere University Hospital Research Fund.

Protokollen som er beskrevet her er godkjent av Finlands nasjonale dyreetikkkomité (protokollnummer ESAVI/9520/2020 og ESAVI/6421/04.10.07/2017).
1. Eksperimentelle dyr og mus OIR modell induksjon
MERK: Bruk tidsmatte dyr, for eksempel vanlige C57BL/6J-mus, for å få unger født samme dag. Bruk fosterdammer, for eksempel 129 belastninger (129S1/SvImJ eller 129S3/SvIM) ammende dammer, for å pleie valpene under og etter induksjon av hyperoksi. Alternativt må du sør...

Alvorlighetsgraden av sykdom fenotype er avhengig av både belastningen og til og med leverandør i både mus og rotte OIR modeller23. Dette tyder på at det er en bred genotypisk variasjon i patologiutviklingen. Generelt utvikler pigmenterte gnagere mer alvorlig fenotype enn albinoene. For eksempel, retinal vaskulatur av albino BALB / c revaskulariserer raskt etter hyperoksi og utvikler ikke NV i det hele tatt24. På samme måte, hos rotter, viser pigmenterte Brown Norway ...

Pålitelige og reproduserbare eksperimentelle modeller er nødvendig for å studere patologien bak angiogene øyesykdommer og for å utvikle nye terapeutiske midler til disse ødeleggende sykdommene. Patologisk angiogenese er kjennetegnet for våt aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) og for mange iskemiske retinale sykdommer blant dem retinopati av prematuritet (ROP), proliferativ diabetisk retinopati (PDR) og retinal vene okklusjon (RVO)1,2,3,4. Menneskelige og gnager retinas følger et lignende utviklingsmønster, da både menneskelig og gnager retina er blant de siste vevene som er vaskularisert. Før retinal vaskulaturen er fullstendig utviklet, mottar netthinnen sin næringstilførsel fra hyaloid vaskulatur, som igjen går tilbake når retinal vaskulatur begynner å utvikleseg 1,2. Hos mennesker er retinal vaskulær utvikling fullført før fødselen, mens hos gnagere oppstår veksten av retinal vaskulatur etter fødselen. Siden retinal vaskulær utvikling oppstår postnatalt hos gnagere, gir det et ideelt modellsystem for å studere angiogenese2,3. De nyfødte gnagere har en avascular retina som utvikler seg gradvis til fullstendig vaskulær retina utvikling oppnås ved slutten av tredje postnatal uke4. De voksende blodårene av neonatal mus er plast, og de gjennomgår regresjon under hyperoksistimulans5.
ROP er den ledende årsaken til barndommen blindhet i vestlige land, da det påvirker nesten 70% av de premature spedbarn med fødselsvekt under 1250 g6,7. ROP forekommer hos premature spedbarn som er født før retinal fartøy fullfører sin normale vekst. ROP utvikler seg i to faser: i fase I forsinker tidlig fødsel retinal vaskulær vekst der etter i fase II forårsaker den uferdige vaskulariseringen av den utviklende netthinnen hypoksi, noe som induserer uttrykket av angiogene vekstfaktorer som stimulerer ny og unormal blodkarvekst8. OIR-modellen har vært en mye brukt modell for å studere patofysiologien til ROP og andre iskemiske retinopatier, samt å teste nye narkotikakandidater2,3,9. Det er allment ansett som en reproduserbar modell for å utføre proof-of-concept studier for potensielle antiangiogene legemidler for okulære så vel som ikke-okulære sykdommer. De to gnagermodellene, det vil vil at mus og rotte OIR varierer i deres modellinduksjon og sykdomphenotype. Rottemodellen etterligner ROP fenotype mer nøyaktig, men musemodellen gir en mer robust, rask og reproduserbar modell for retinal neovaskularisering (NV). I musemodellen utvikler NV seg til den sentrale netthinnen. Denne patologiske lesing er viktig i farmakologiske effektstudier for mange iskemiske retinopatier, som PDR, RV og eksudativ AMD, samt for ikke-okulære, angiogene sykdommer som kreft. Videre gjør tilgjengeligheten av genetisk manipulerte (transgene og knockout) mus musen OIR-modellen til et mer populært alternativ. Imidlertid skaper verken mus eller rotte OIR-modell retinal fibrose, som er typisk for menneskelige sykdommer.
Forståelsen av at høye oksygennivåer bidrar til utviklingen av ROP i 195010,11 førte til utvikling av dyremodeller. De første studiene om effekten av oksygen på retinal vaskulatur ble gjort i 195012,13,14 og frem til 1990-tallet var det mange forbedringer til OIR-modellen. Forskningen av Smith et al. i 1994 satt en standard for den nåværende musen OIR modell som skiller hyaloidopati fra retinopati15. En bred innføring av metoden for å kvantifisere vaso-utslettelse og patologisk NV av Connor et al. (2009) ytterligere økt sin popularitet16. I denne modellen plasseres mus ved 75 % oksygen (O2) i 5 dager ved P7, etterfulgt av 5 dager under normoksiske forhold. Hyperoksi fra P7 til P12 forårsaker retinal vaskulatur til regress i sentral netthinnen. Ved retur til normoksiske forhold blir avascular retina hypoksisk (figur 1A). På grunn av hypoksiske stimuli av den avascular sentrale netthinnen, spirer noen av retinale blodkar mot glasslegemet, danner preretinal NV, kalt preretinal tufts2,3. Disse tuftene er umodne og hyperpermeable. Mengden NV topper på P17, hvor etter som den går tilbake. Netthinnen er helt revaskularisert og NV er fullstendig regressed av P23 - P25 (Figur 2A)2,3.
Rotteoir-modellen (ved bruk av varierende nivåer av O2) ble først beskrevet på 1990-tallet som viser at varierende O2-nivåer ved 80 % og 40 % forårsaker mer uttalt NV enn under 80 % O2 konstant eksponering17. Senere ble det oppdaget at den intermitterende hypoksimodellen, hvor O2 sykles fra hyperoksi (50 %) hypoksi (10-12 %), forårsaker enda mer NV enn 80/40% O2 modell18. I 50/10% modellen blir rottevalper utsatt for 50% i 24 timer, etterfulgt av 24 timer i 10% O2. Disse syklusene fortsetter til P14, når rottevalpene returneres til normoksiske tilstander (figur 1B). Som hos humane ROP-pasienter utvikler de avascular områdene i rottemodellen seg til periferien av netthinnen på grunn av umoden retinal vaskulær plexus (figur 3).
I begge modellene er de viktigste parametrene som vanligvis kvantifiseres, størrelsen på AVA og NV. Disse parametrene analyseres vanligvis fra retinal flate mounts hvor endotelcellene er merket4,16. Tidligere ble mengden preretinal NV evaluert fra retinale tverrsnitt ved å telle blodkar eller vaskulære cellekjerner som strekker seg til glasslegemer over den indre begrensende membranen. Den store begrensningen av denne tilnærmingen er at det ikke er mulig å kvantifisere AVAs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>33 gauge, Small Hub RN Needle</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>7803-05, 10mm, 25&#176;, PS4</td>
			<td>For intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe Inc.</td>
			<td></td>
			<td>For image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air pump air100</td>
			<td>Eheim GmbH &#38; Co. KG.</td>
			<td>143207</td>
			<td>For inhalation anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaesthesia unit 410 AP</td>
			<td>Univentor Ltd.</td>
			<td>2360309</td>
			<td>For inhalation anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnalaR NORMAPUR Soda lime</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>22666.362</td>
			<td>For CO2 control during model induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attane Vet 1000 mg/g</td>
			<td>VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY</td>
			<td>vnr 17 05 79</td>
			<td>For inhalation anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For preparation of flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celeris D430 ERG system</td>
			<td>Diagnosys LLC</td>
			<td>121</td>
			<td>For in vivo ERG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes</td>
			<td>Greiner Bio-One International GmbH</td>
			<td>664 160</td>
			<td>For preparation of flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cepetor Vet 1 mg/mL</td>
			<td>VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY</td>
			<td>vnr 08 78 96</td>
			<td>For anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15165452</td>
			<td>For preparation of flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 Controlled InVivo Cabinet, Aninal Filtrarion System and Dehumidifier</td>
			<td>Coy Laboratory Products</td>
			<td></td>
			<td>Closed system for disease model induction, optional for semi-closed system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E702 O2 sensor</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>E207, 1801901</td>
			<td>For oxygen level measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envisu R2200 Spectral Domain Optical Coherence Tomograph (SD-OCT)</td>
			<td>Bioptigen, Inc.</td>
			<td>BPN000668</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye spears</td>
			<td>Beaver-Visitec International, Inc.</td>
			<td>0008685</td>
			<td>For intravitreal injection and in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexilux 600LL Cold light source</td>
			<td>Mikron</td>
			<td>11140</td>
			<td>For intravitreal injection or tissue collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein sodium salt</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>F6377-100G</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Exhaust unit (+Double 3-way valve, mouse and rat face masks, UNOsorb filter)</td>
			<td>UNO Roestvaststaal BV</td>
			<td>GEX 17015249</td>
			<td>For inhalation anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe, Model 65 RN</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>7633-01</td>
			<td>For intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRA2 Retina angiograph (FA)</td>
			<td>Heidelberg Engineering GmbH</td>
			<td>Spec-KT-05488</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>I21411</td>
			<td>For labeling retinal vasculature on flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketaminol Vet 50 mg/mL</td>
			<td>Intervet International B.V.</td>
			<td>vnr 51 14 85</td>
			<td>For anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medicinal Oxygen gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For disease model induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice C57BL/6JRj</td>
			<td>Janvier Labs</td>
			<td></td>
			<td>Also other strains possible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td>For preparation of flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minims Povidone Iodine 5% (unit)</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb U.K Limited</td>
			<td>vnr 24 11 304</td>
			<td>For intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For disease model induction (rat)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oftan Chlora 10 mg/g</td>
			<td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td>
			<td>vnr 55 01 11</td>
			<td>For intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml</td>
			<td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td>
			<td>vnr 55 03 43</td>
			<td>For in vivo ERG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oftan Obucain 4 mg/ml</td>
			<td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td>
			<td>vnr 55 03 50</td>
			<td>For intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oftan Tropicamid 5 mg/ml</td>
			<td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td>
			<td>vnr 04 12 36</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProOx Model 110 O2 controller and animal chamber</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>803</td>
			<td>For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProOx Model P360 O2 controller and animal chamber</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>538</td>
			<td>For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rats CD(SD)</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td>Also other strains possible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Revertor 5 mg/mL</td>
			<td>VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY</td>
			<td>vnr 13 04 97</td>
			<td>For anaesthesia reversal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For humidity control during model induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Systane Ultra 10ml</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>Tamro 2050250</td>
			<td>For hydration of the eye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Systane Ultra unit 0.7ml</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>Tamro 2064871</td>
			<td>For hydration of the eye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1343-9108</td>
			<td>For preparation of flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VENTI-Line VL 180 PRIME Drying oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VL180S 170301</td>
			<td>For drying silica gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiScope SZT350 Stereomicroscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td>481067</td>
			<td>For intravitreal injection or tissue collection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oxygen-induced retinopathy model for ischemic retinal diseases in rodents

En av de mest brukte modellene for iskemiske retinopatier er den oksygeninduserte retinopati (OIR)-modellen. Her beskriver vi detaljerte protokoller for OIR-modellen induksjon og dets avlesninger hos både mus og rotter. Retinal neovaskularisering induseres i OIR ved å utsette gnagervalper enten for hyperoksi (mus) eller vekslende nivåer av hyperoksi og hypoksi (rotter). De primære avlesningene av disse modellene er størrelsen på neovaskulære (NV) og avascular (AVA) områder i netthinnen. Denne prekliniske in vivo-modellen kan brukes til å evaluere effekten av potensielle anti-angiogene legemidler eller for å ta opp rollen som spesifikke gener i retinal angiogenese ved hjelp av genetisk manipulerte dyr. Modellen har en viss belastning og leverandørspesifikk variasjon i OIR-induksjonen som bør tas i betraktning ved utdesign av eksperimentene.

Hovedresultatet av modellen er vaskulær fenotype: størrelsen på AVAs og mengden NV. I musen OIR-modellen forekommer vaso-utslettelse i den sentrale netthinnen (figur 2A), mens den i rottemodellen utvikler seg i periferien, det vil si lik menneskelig ROP22 (figur 3A). Dette skyldes at den overfladiske vaskulære plexus allerede har utviklet seg når mus blir utsatt for hyperoksi, mens netthinnen i rottemodellen er avascular på tidspunk...

Watch this Scientific Journal Video about Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents at JoVE.com

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

Oksygenindusert retinopati (OIR) kan brukes til å modellere iskemiske retinale sykdommer som retinopati av prematuritet og proliferativ diabetisk retinopati og å tjene som modell for konseptbevisstudier i evaluering av antiangiogene legemidler for neovaskulære sykdommer. OIR induserer robust og reproduserbar neovaskularisering i netthinnen som kan kvantifiseres.

Oksygenindusert retinopati modell for iskemiske retinale sykdommer hos gnagere

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Gene Transfer for Ischemic Heart Failure in a Preclinical Model

Various emerging technologies are being developed for patients with heart failure. Well-established preclinical evaluations are necessary to determine ...

A Simplified Technique for Producing an Ischemic Wound Model

En Forenklet teknikk for produksjon av en iskemisk sår modell

One major obstacle in current diabetic wound research is a lack of an ischemic wound model that can be safely used in diabetic animals. Drugs that work ...

High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

Høyt innhold Screening i nevrodegenerative sykdommer

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Netthinneavløsning Model i Gnagere etter subretinal Injeksjon av Natriumhyaluronat

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Remote Limb Ischemic Preconditioning:  A Neuroprotective Technique in Rodents

Remote Limb iskemisk prekondisjonering: neuroprotective Technique i Gnagere

Sublethal ischemia protects tissues against subsequent, more severe ischemia through the upregulation of endogenous mechanisms in the affected tissue. ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

Utføre subretinal injeksjoner i Gnagere å levere retinal pigment epitelet Cells i Suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

Kvantitativ Fundus autofluorescence for Evaluering av retinal sykdommer

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

En akutt retinal modell for evaluering Blood Netthinne Barrier på brudd og mulige narkotika for behandling

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

En Ex Vivo vev kultur modell for Fibrovascular komplikasjoner i proliferativ diabetisk retinopati

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

A Murine Model of Ischemic Retinal Injury Induced by Transient Bilateral Common Carotid Artery Occlusion

En murin modell av iskemisk retinal skade indusert av forbigående bilaterale felles halspulsåren okklusjon

Diverse vascular diseases such as diabetic retinopathy, occlusion of retinal veins or arteries and ocular ischemic syndrome can lead to retinal ischemia. ...