Name: oxygen-induced retinopathy model for ischemic retinal diseases in rodents
Uploaded: 2020-09-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents at JoVE.com

Agradecemos a Marianne Karlsberg, Anne Mari Haapaniemi, Päivi Partanen e Anne Kankkunen pelo excelente apoio técnico. Este trabalho foi financiado pela Academia da Finlândia, Päivikki e Fundação Sakari Sohlberg, Fundação Tampere Tuberculosis, Fundação Médica Finlandesa, Fundação de Pesquisa do Distrito Hospitalar de Pirkanmaa e o Tampere University Hospital Research Fund.

O protocolo aqui descrito foi aprovado pelo Comitê Nacional de Ética Animal da Finlândia (número de protocolo ESAVI/9520/2020 e ESAVI/6421/04.10.07/2017).
1. Indução experimental de animais e modelo OIR do rato
NOTA: Use animais com acasalamento de tempo, por exemplo, camundongos C57BL/6J comumente usados, para fazer filhotes nascerem no mesmo dia. Utilize barragens de fomento, por exemplo, 129 cepas (129S1/SvImJ ou 129S3/SvIM) para amamentar os filhotes durante...

A gravidade do fenótipo da doença depende tanto da cepa quanto mesmo do fornecedor nos modelos OIR de camundongos e ratos23. Isso sugere que há uma ampla variabilidade genotipa no desenvolvimento da patologia. Em geral, roedores pigmentados desenvolvem fenótipo mais severo do que os albinos. Por exemplo, a vasculatura de retina do albino BALB/c revasculariza-se rapidamente após a hiperoxia e não desenvolve NV em todos os24. Da mesma forma, em ratos, ratos da Noruega M...

Modelos experimentais confiáveis e reprodutíveis são necessários para estudar a patologia por trás de doenças oculares angiogênicas e desenvolver novas terapêuticas para essas doenças devastadoras. A angiogênese patológica é a marca registrada para a degeneração macular relacionada à idade úmida (DM) e para muitas doenças isquêmicas da retina entre elas a retinopatia da prematuridade (ROP), a retinopatia diabética proliferativa (PDR) e a oclusão da veia retinária (RVO)1,2,3,4. As retinas humanas e roedores seguem um padrão de desenvolvimento semelhante, já que tanto a retina humana quanto a roedora estão entre os últimos tecidos vascularizados. Antes que a vasculatura da retina se desenvolva completamente, a retina recebe seu suprimento de nutrientes a partir da vasculatura hialoide, que, por sua vez, regrede quando a vasculatura da retina começa a se desenvolver1,2. No desenvolvimento vascular humano, a retina é concluída antes do nascimento, enquanto nos roedores o crescimento da vasculatura da retina ocorre após o nascimento. Uma vez que o desenvolvimento vascular da retina ocorre postnatalmente em roedores, fornece um sistema modelo ideal para estudar a angiogênese2,3. Os roedores recém-nascidos têm uma retina avascular que se desenvolve gradualmente até que o desenvolvimento completo da retina vascular seja alcançado até o final da terceira semana pós-natal4. Os vasos sanguíneos em crescimento do camundongo neonatal são plásticos, e sofrem regressão durante o estímulo da hiperoxia5.
O ROP é a principal causa de cegueira infantil nos países ocidentais, pois afeta quase 70% dos bebês prematuros com peso ao nascer abaixo de 1.250 g6,7. O ROP ocorre em bebês prematuros que nascem antes que os vasos da retina completem seu crescimento normal. O ROP progride em duas fases: na Fase I, o nascimento prematuro atrasa o crescimento vascular da retina onde, após a fase II, a vascularização inacabada da retina em desenvolvimento causa hipóxia, o que induz a expressão de fatores de crescimento angiogênico que estimulam o crescimento de novos e anormais vasos sanguíneos8. O modelo OIR tem sido um modelo amplamente utilizado para estudar a fisiopatologia do ROP e outras retinopatias isquêmicas, bem como para testar novos candidatos a drogas2,3,9. É amplamente considerado como um modelo reprodutível para a realização de estudos de prova de conceito para potenciais drogas antiangiogênicas para doenças oculares e não oculares. Os dois modelos de roedores, ou seja, o OIR de rato e rato diferem em seu modelo de indução e fenótipo da doença. O modelo de rato imita o fenótipo ROP com mais precisão, mas o modelo do mouse fornece um modelo mais robusto, rápido e reprodutível para neovascularização da retina (NV). No modelo do mouse, a NV se desenvolve para a retina central. Essa leitura patológica é importante em estudos de eficácia farmacológica para muitas retinopatias isquêmicas, como PDR, RV e DM exudativa, bem como para doenças angiogênicas não oculares, como o câncer. Além disso, a disponibilidade de camundongos geneticamente manipulados (transgênicos e nocautes) torna o modelo OIR do mouse uma opção mais popular. No entanto, nem o modelo de OIR de rato nem rato cria fibrose retinenta, que é típica em doenças humanas.
O entendimento de que altos níveis de oxigênio contribuem para o desenvolvimento da ROP na década de 195010,11 levou ao desenvolvimento de modelos animais. Os primeiros estudos sobre o efeito do oxigênio na vasculatura da retina foram feitos em 195012,13,14 e até a década de 1990 houve muitos refinamentos para o modelo OIR. A pesquisa de Smith et al. em 1994 estabeleceu um padrão para o modelo OIR do rato atual que separa a hialoidopatia da retinopatia15. Uma ampla adoção do método para quantificar a vaso-obliteração e o NV patológico por Connor et al. (2009) aumentou ainda mais sua popularidade16. Neste modelo, os camundongos são colocados a 75% de oxigênio (O2) por 5 dias em P7, seguidos por 5 dias em condições normóxidas. A hiperoxia de P7 a P12 faz com que a vasculatura da retina regreda na retina central. Ao retornar às condições normóxicas, a retina avascular torna-se hipóxica (Figura 1A). Devido aos estímulos hipóxicos da retina central avascular, alguns dos vasos sanguíneos da retina brotam em direção ao vítreo, formando nv pré-retinal, chamado tufos pré-semanais2,3. Estes tufos são imaturos e hiperpermeáveis. A quantidade de NV atinge picos em P17, após o qual ele regrede. A retina é totalmente revascularizada e a NV é totalmente regredida por P23 - P25 (Figura 2A)2,3.
O modelo OIR de rato (utilizando níveis variados de O2) foi descrito pela primeira vez na década de 1990 mostrando que níveis variados de O2 a 80% e 40% causam mais NV pronunciado do que abaixo de 80% O2 exposição constante17. Mais tarde, descobriu-se que o modelo de hipóxia intermitente, onde O2 é ciclou da hiperoxia (50%) à hipóxia (10-12%), causa ainda mais NV do que o modelo 80/40% O2 18. No modelo 50/10%, os filhotes de rato são expostos a 50% durante 24 horas, seguidos por 24 horas em 10% O2. Esses ciclos são continuados até P14, quando os filhotes de rato são devolvidos às condições normóxicas(Figura 1B). Assim como em pacientes humanos de ROP, no modelo de ratos as áreas avasculares desenvolvem-se para a periferia da retina por causa do plexo vascular imaturo da retina(Figura 3).
Em ambos os modelos, os principais parâmetros que geralmente são quantificados são o tamanho de AVA e NV. Esses parâmetros são tipicamente analisados a partir de montagens planas de retina onde as células endoteliais são rotuladas4,16. Anteriormente, a quantidade de NV pré-retinal foi avaliada a partir de seções transversais da retina, contando vasos sanguíneos ou núcleos de células vasculares que se estendem até vítreos acima da membrana limitante interna. A maior limitação dessa abordagem é que não é possível quantificar os AVAs.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>33 gauge, Small Hub RN Needle</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>7803-05, 10mm, 25&#176;, PS4</td>
			<td>For intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe Inc.</td>
			<td></td>
			<td>For image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air pump air100</td>
			<td>Eheim GmbH &#38; Co. KG.</td>
			<td>143207</td>
			<td>For inhalation anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaesthesia unit 410 AP</td>
			<td>Univentor Ltd.</td>
			<td>2360309</td>
			<td>For inhalation anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnalaR NORMAPUR Soda lime</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>22666.362</td>
			<td>For CO2 control during model induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attane Vet 1000 mg/g</td>
			<td>VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY</td>
			<td>vnr 17 05 79</td>
			<td>For inhalation anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For preparation of flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celeris D430 ERG system</td>
			<td>Diagnosys LLC</td>
			<td>121</td>
			<td>For in vivo ERG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes</td>
			<td>Greiner Bio-One International GmbH</td>
			<td>664 160</td>
			<td>For preparation of flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cepetor Vet 1 mg/mL</td>
			<td>VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY</td>
			<td>vnr 08 78 96</td>
			<td>For anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15165452</td>
			<td>For preparation of flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 Controlled InVivo Cabinet, Aninal Filtrarion System and Dehumidifier</td>
			<td>Coy Laboratory Products</td>
			<td></td>
			<td>Closed system for disease model induction, optional for semi-closed system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E702 O2 sensor</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>E207, 1801901</td>
			<td>For oxygen level measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envisu R2200 Spectral Domain Optical Coherence Tomograph (SD-OCT)</td>
			<td>Bioptigen, Inc.</td>
			<td>BPN000668</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye spears</td>
			<td>Beaver-Visitec International, Inc.</td>
			<td>0008685</td>
			<td>For intravitreal injection and in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexilux 600LL Cold light source</td>
			<td>Mikron</td>
			<td>11140</td>
			<td>For intravitreal injection or tissue collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein sodium salt</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>F6377-100G</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Exhaust unit (+Double 3-way valve, mouse and rat face masks, UNOsorb filter)</td>
			<td>UNO Roestvaststaal BV</td>
			<td>GEX 17015249</td>
			<td>For inhalation anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe, Model 65 RN</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>7633-01</td>
			<td>For intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRA2 Retina angiograph (FA)</td>
			<td>Heidelberg Engineering GmbH</td>
			<td>Spec-KT-05488</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>I21411</td>
			<td>For labeling retinal vasculature on flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketaminol Vet 50 mg/mL</td>
			<td>Intervet International B.V.</td>
			<td>vnr 51 14 85</td>
			<td>For anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medicinal Oxygen gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For disease model induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice C57BL/6JRj</td>
			<td>Janvier Labs</td>
			<td></td>
			<td>Also other strains possible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td>For preparation of flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minims Povidone Iodine 5% (unit)</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb U.K Limited</td>
			<td>vnr 24 11 304</td>
			<td>For intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For disease model induction (rat)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oftan Chlora 10 mg/g</td>
			<td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td>
			<td>vnr 55 01 11</td>
			<td>For intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml</td>
			<td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td>
			<td>vnr 55 03 43</td>
			<td>For in vivo ERG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oftan Obucain 4 mg/ml</td>
			<td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td>
			<td>vnr 55 03 50</td>
			<td>For intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oftan Tropicamid 5 mg/ml</td>
			<td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td>
			<td>vnr 04 12 36</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProOx Model 110 O2 controller and animal chamber</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>803</td>
			<td>For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProOx Model P360 O2 controller and animal chamber</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>538</td>
			<td>For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rats CD(SD)</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td>Also other strains possible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Revertor 5 mg/mL</td>
			<td>VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY</td>
			<td>vnr 13 04 97</td>
			<td>For anaesthesia reversal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For humidity control during model induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Systane Ultra 10ml</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>Tamro 2050250</td>
			<td>For hydration of the eye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Systane Ultra unit 0.7ml</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>Tamro 2064871</td>
			<td>For hydration of the eye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1343-9108</td>
			<td>For preparation of flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VENTI-Line VL 180 PRIME Drying oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VL180S 170301</td>
			<td>For drying silica gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiScope SZT350 Stereomicroscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td>481067</td>
			<td>For intravitreal injection or tissue collection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oxygen-induced retinopathy model for ischemic retinal diseases in rodents

Um dos modelos comumente usados para retinopatias isquêmicas é o modelo de retinopatia induzida pelo oxigênio (OIR). Aqui descrevemos protocolos detalhados para a indução do modelo OIR e suas leituras em camundongos e ratos. A neovascularização da retina é induzida em OIR expondo filhotes de roedores à hiperoxia (camundongos) ou a níveis alternados de hiperoxia e hipóxia (ratos). As leituras primárias desses modelos são do tamanho das áreas neovasculares (NV) e avasculares (AVA) na retina. Este modelo in vivo pré-clínico pode ser usado para avaliar a eficácia de potenciais drogas anti-angiogênicas ou para abordar o papel de genes específicos na angiogênese da retina usando animais geneticamente manipulados. O modelo tem alguma variação específica de tensão e fornecedor na indução OIR que deve ser levada em consideração ao projetar os experimentos.

O principal desfecho do modelo é o fenótipo vascular: o tamanho das AVAs e a quantidade de NV. No modelo OIR do camundongo, a vaso-obliteração ocorre na retina central (Figura 2A), enquanto no modelo de rato ele se desenvolve na periferia, ou seja, semelhante ao ROP22 humano (Figura 3A). Isso porque o plexo vascular superficial já se desenvolveu quando os camundongos são expostos à hiperoxia, enquanto no modelo de rato a retina é ...

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Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

A retinopatia induzida pelo oxigênio (OIR) pode ser usada para modelar doenças isquêmicas da retina, como a retinopatia da prematuridade e a retinopatia diabética proliferativa e servir de modelo para estudos de prova de conceito na avaliação de drogas antiangiogênicas para doenças neovasculares. O OIR induz a neovascularização robusta e reprodutível na retina que pode ser quantificada.

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