Name: oxygen-induced retinopathy model for ischemic retinal diseases in rodents
Uploaded: 2020-09-16T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents at JoVE.com

Vi tackar Marianne Karlsberg, Anne Mari Haapaniemi, Päivi Partanen och Anne Kankkunen för utmärkt teknisk support. Detta arbete finansierades av Finlands Akademi, Päivikki och Sakari Sohlbergs stiftelse, Tammerfors tuberkulosstiftelse, Finlands medicinska stiftelse, Pirkanmaa sjukhusdistriktets forskningsstiftelse och Tammerfors universitetssjukhusforskningsfond.

Det protokoll som beskrivs här har godkänts av Finlands nationella djuretiska kommitté (protokollnummer ESAVI/9520/2020 och ESAVI/6421/04.10.07/2017).
1. Experimentella djur och mus OIR modell induktion
OBS: Använd tidsparade djur, t.ex. vanliga C57BL/6J-möss, för att få valpar födda samma dag. Använd fosterdammar, t.ex. 129 stam (129S1/SvImJ eller 129S3/SvIM) lakterande dammar, för att amma valparna under och efter induktion av hyperoxi. Alternativt, se til...

Svårighetsgraden av sjukdomen fenotyp är beroende av både stammen och även leverantören i både mus och råtta OIR modeller23. Detta tyder på att det finns en bred genotypisk variabilitet i patologi utveckling. I allmänhet utvecklar pigmenterade gnagare allvarligare fenotyp än albino. Till exempel revascularizes retinal Vasculature av albino BALB/c revascularizes snabbt efter hyperoxia och utvecklar inte NV alls24. På samma sätt, hos råttor, visar pigmenterade Br...

Tillförlitliga och reproducerbara experimentella modeller behövs för att studera patologin bakom angiogena ögonsjukdomar och för att utveckla nya terapier till dessa förödande sjukdomar. Patologisk angiogenes är kännetecknet för våt åldersrelaterad makuladegeneration (AMD) och för många skandinaviska näthinnesjukdomar bland dem retinopati av prematuritet (ROP), proliferativ diabetiker retinopati (PDR) och näthinnevenocklusion (RVO)1,2,3,4. Mänskliga och gnagare retinas följer ett liknande utvecklingsmönster, eftersom både mänskliga och gnagare näthinnan är bland de sista vävnaderna som är vascularized. Innan näthinnan vaskulaturen har utvecklats helt, får näthinnan sin näringstillförsel från hyaloid vaskulatur, som i sin tur går tillbaka när näthinnans vaskulatur börjar utvecklas1,2. Hos människa slutförs retinal vaskulär utveckling före födseln, medan tillväxten av retinal vaskulatur hos gnagare sker efter födseln. Eftersom retinal vaskulär utveckling sker postnatally hos gnagare, ger det ett idealiskt modellsystem för att studera angiogenesen2,3. Nyfödda gnagare har en avascular näthinnan som utvecklas gradvis tills fullständig vaskulär näthinnan utveckling uppnås i slutet av tredje postnatala vecka4. De växande blodkärlen hos neonatalmus är plast, och de genomgår regression under hyperoxiastimulans5.
ROP är den främsta orsaken till barndomsblindhet i västländer, eftersom det påverkar nästan 70% av de för tidigt födda med födelsevikt under 1 250 g6,7. ROP förekommer hos för tidigt födda spädbarn som föds innan näthinnekärlen slutför sin normala tillväxt. ROP fortskrider i två faser: i fas I, prematur födsel fördröjer retinal Vaskulär tillväxt där efter i fas II, oavslutad Vascularization av den utvecklande näthinnan orsakar hypoxi, vilket inducerar uttryck av angiogenic tillväxtfaktorer som stimulerar nya och onormala blodkärl tillväxt8. OIR-modellen har varit en allmänt använd modell för att studera patofysiologin hos ROP och andra skandinaviska retinopatier samt för att testa nya läkemedelskandidater2,3,9. Det anses allmänt vara en reproducerbar modell för att utföra proof-of-concept studier för potentiella antiangiogenic läkemedel för okulär samt icke-okulär sjukdomar. De två gnagarmodellerna, dvs. mus och råtta OIR skiljer sig åt i sin modell induktion och sjukdom fenotyp. Råttmodellen efterliknar ROP fenotyp mer exakt, men musmodellen ger en mer robust, snabb och reproducerbar modell för retinal neovascularization (NV). I musmodellen utvecklas NV till den centrala näthinnan. Denna patologiska avläsning är viktig i farmakologiska effektstudier för många skandinaviska retinopatier, såsom PDR, RV och exudativ AMD samt för icke-okulära, angiogena sjukdomar som cancer. Dessutom gör tillgången på genetiskt manipulerade (transgena och knockout) möss musens OIR-modell till ett mer populärt alternativ. Men varken mus eller råtta OIR modell skapar näthinnefibros, vilket är typiskt vid mänskliga sjukdomar.
Förståelsen att höga syrenivåer bidrar till utvecklingen av ROP på 1950-talet10,11 ledde till utvecklingen av djurmodeller. De första studierna om syrets effekt på retinalvaskulatur gjordes 195012,13,14 och fram till 1990-talet fanns det många förbättringar av OIR-modellen. Forskningen av Smith et al. 1994 satte en standard för den nuvarande mus OIR-modellen som skiljer hyaloidopati från retinopati15. En bred användning av metoden för att kvantifiera vaso-utplåning och patologisk NV av Connor et al. (2009) ökade ytterligare dess popularitet16. I denna modell placeras möss på 75% syre (O2) i 5 dagar vid P7, följt av 5 dagar i normoxiska förhållanden. Hyperoxia från P7 till P12 orsakar retinal vaskulatur att regress i centrala näthinnan. Vid återgång till normoxiska tillstånd blir avaskulär näthinna hypoxisk (figur 1A). På grund av de hypoxiska stimuli i den avaskulära centrala näthinnan spirar några av näthinnans blodkärl mot glaskroppen och bildar preretinal NV, kallad preretinal tufts2,3. Dessa tufts är omogna och hyperpermeable. Mängden NV-toppar vid P17, varefter den återinträdes. Näthinnan är helt revascularized och NV är helt regressed av P23 - P25 (Figur 2A)2,3.
Råtta OIR-modellen (med varierande nivåer av O2) beskrevs först på 1990-talet som visar att varierande O2-nivåer vid 80% och 40% orsakar mer uttalad NV än under 80% O2 konstant exponering17. Senare upptäcktes att den intermittenta hypoximodellen, där O2 cyklas från hyperoxi (50%) hypoxi (10-12 %), orsakar ännu mer NV än 80/40% O2 modell18. I 50/10% -modellen utsätts råttvalpar för 50% i 24 timmar, följt av 24 timmar i 10% O2. Dessa cykler fortsätter fram till P14, då råttvalparna återgår till normoxiska förhållanden (figur 1B). Liksom hos humana ROP- patienter utvecklas de avaskulära områdena i råttmodellen till näthinnans periferi på grund av omogna näthinnan Vaskulär plexus (figur 3).
I båda modellerna är de viktigaste parametrarna som vanligtvis kvantifieras storleken på AVA och NV. Dessa parametrar analyseras vanligtvis från näthinneplatta fästen där endotelcellerna ärmärkta 4,16. Tidigare utvärderades mängden preretinal NV från retinal tvärsnitt genom att räkna blodkärl eller vaskulär cellkärnor som sträcker sig till glaskropp ovanför det inre begränsande membranet. Den största begränsningen av detta tillvägagångssätt är att det inte är möjligt att kvantifiera avgränsarna.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>33 gauge, Small Hub RN Needle</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>7803-05, 10mm, 25&#176;, PS4</td>
			<td>For intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td>Adobe Inc.</td>
			<td></td>
			<td>For image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air pump air100</td>
			<td>Eheim GmbH &#38; Co. KG.</td>
			<td>143207</td>
			<td>For inhalation anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaesthesia unit 410 AP</td>
			<td>Univentor Ltd.</td>
			<td>2360309</td>
			<td>For inhalation anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AnalaR NORMAPUR Soda lime</td>
			<td>VWR International Ltd</td>
			<td>22666.362</td>
			<td>For CO2 control during model induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Attane Vet 1000 mg/g</td>
			<td>VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY</td>
			<td>vnr 17 05 79</td>
			<td>For inhalation anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For preparation of flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon dioxide gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For sacrifice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celeris D430 ERG system</td>
			<td>Diagnosys LLC</td>
			<td>121</td>
			<td>For in vivo ERG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes</td>
			<td>Greiner Bio-One International GmbH</td>
			<td>664 160</td>
			<td>For preparation of flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cepetor Vet 1 mg/mL</td>
			<td>VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY</td>
			<td>vnr 08 78 96</td>
			<td>For anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15165452</td>
			<td>For preparation of flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O2 Controlled InVivo Cabinet, Aninal Filtrarion System and Dehumidifier</td>
			<td>Coy Laboratory Products</td>
			<td></td>
			<td>Closed system for disease model induction, optional for semi-closed system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E702 O2 sensor</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>E207, 1801901</td>
			<td>For oxygen level measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Envisu R2200 Spectral Domain Optical Coherence Tomograph (SD-OCT)</td>
			<td>Bioptigen, Inc.</td>
			<td>BPN000668</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eye spears</td>
			<td>Beaver-Visitec International, Inc.</td>
			<td>0008685</td>
			<td>For intravitreal injection and in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flexilux 600LL Cold light source</td>
			<td>Mikron</td>
			<td>11140</td>
			<td>For intravitreal injection or tissue collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein sodium salt</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>F6377-100G</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gas Exhaust unit (+Double 3-way valve, mouse and rat face masks, UNOsorb filter)</td>
			<td>UNO Roestvaststaal BV</td>
			<td>GEX 17015249</td>
			<td>For inhalation anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass syringe, Model 65 RN</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>7633-01</td>
			<td>For intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRA2 Retina angiograph (FA)</td>
			<td>Heidelberg Engineering GmbH</td>
			<td>Spec-KT-05488</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolectin GS-IB4, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>I21411</td>
			<td>For labeling retinal vasculature on flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ketaminol Vet 50 mg/mL</td>
			<td>Intervet International B.V.</td>
			<td>vnr 51 14 85</td>
			<td>For anaesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medicinal Oxygen gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For disease model induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice C57BL/6JRj</td>
			<td>Janvier Labs</td>
			<td></td>
			<td>Also other strains possible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>J1800AMNZ</td>
			<td>For preparation of flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minims Povidone Iodine 5% (unit)</td>
			<td>Bausch &#38; Lomb U.K Limited</td>
			<td>vnr 24 11 304</td>
			<td>For intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitrogen gas</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For disease model induction (rat)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oftan Chlora 10 mg/g</td>
			<td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td>
			<td>vnr 55 01 11</td>
			<td>For intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oftan Metaoksedrin 100 mg/ml</td>
			<td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td>
			<td>vnr 55 03 43</td>
			<td>For in vivo ERG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oftan Obucain 4 mg/ml</td>
			<td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td>
			<td>vnr 55 03 50</td>
			<td>For intravitreal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oftan Tropicamid 5 mg/ml</td>
			<td>Santen Pharmaceutical Co., Ltd.</td>
			<td>vnr 04 12 36</td>
			<td>For in vivo imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProOx Model 110 O2 controller and animal chamber</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>803</td>
			<td>For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProOx Model P360 O2 controller and animal chamber</td>
			<td>BioSphenix, Ltd.</td>
			<td>538</td>
			<td>For disease model induction, semi-closed system, optional for closed system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rats CD(SD)</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td></td>
			<td>Also other strains possible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Revertor 5 mg/mL</td>
			<td>VET MEDIC ANIMAL HEALTH OY</td>
			<td>vnr 13 04 97</td>
			<td>For anaesthesia reversal</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For humidity control during model induction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Systane Ultra 10ml</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>Tamro 2050250</td>
			<td>For hydration of the eye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Systane Ultra unit 0.7ml</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>Tamro 2064871</td>
			<td>For hydration of the eye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipette</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>1343-9108</td>
			<td>For preparation of flat mounts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VENTI-Line VL 180 PRIME Drying oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VL180S 170301</td>
			<td>For drying silica gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VisiScope SZT350 Stereomicroscope</td>
			<td>VWR</td>
			<td>481067</td>
			<td>For intravitreal injection or tissue collection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oxygen-induced retinopathy model for ischemic retinal diseases in rodents

En av de vanliga modellerna för skandinaviska retinopatier är den syreinducerade retinopatimodellen (OIR). Här beskriver vi detaljerade protokoll för OIR-modellens induktion och dess avläsningar hos både möss och råttor. Retinal neovascularization induceras i OIR genom att utsätta gnagare valpar antingen för hyperoxia (möss) eller alternerande nivåer av hyperoxia och hypoxi (råttor). De primära avläsningarna av dessa modeller är storleken på neovaskulära (NV) och avascular (AVA) områden i näthinnan. Denna prekliniska in vivo-modell kan användas för att utvärdera effekten av potentiella antiangiogena läkemedel eller för att ta itu med specifika geners roll i näthinnans angiogenes med hjälp av genetiskt manipulerade djur. Modellen har en viss stam- och leverantörsspecifik variation i OIR-induktionen som bör beaktas vid utformningen av experimenten.

Huvudresultatet av modellen är vaskulär fenotyp: storleken på AVAs och mängden NV. I musens OIR-modell sker vaso-utplåning i den centrala näthinnan (figur 2A), medan den i råttmodellen utvecklas i periferin,dvs. Detta beror på att den ytliga vaskulär plexusen redan har utvecklats när möss utsätts för hyperoxi, medan näthinnan i råttmodellen är avaskulär vid tidpunkten för OIR-induktion (P0). Preretinal neovaskularisering...

Watch this Scientific Journal Video about Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents at JoVE.com

Oxygen-Induced Retinopathy Model for Ischemic Retinal Diseases in Rodents

Syreinducerad retinopati (OIR) kan användas för att modellera skandinaviska näthinnesjukdomar såsom retinopati av prematuritet och proliferativ diabetes retinopati och att fungera som en modell för proof-of-concept studier vid utvärdering av antiangiogenic läkemedel för neovaskulära sjukdomar. OIR inducerar robust och reproducerbar neovaskularisering i näthinnan som kan kvantifieras.

Syreinducerad retinopatimodell för ischemiska näthinnesjukdomar hos gnagare

One of the commonly used models for ischemic retinopathies is the oxygen-induced retinopathy (OIR) model. Here we describe detailed protocols for the OIR ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Gene Transfer for Ischemic Heart Failure in a Preclinical Model

Genöverföring för ischemisk hjärtsvikt I en preklinisk modell

Various emerging technologies are being developed for patients with heart failure. Well-established preclinical evaluations are necessary to determine ...

A Simplified Technique for Producing an Ischemic Wound Model

En förenklad teknik för framställning av en ischemisk sårmodell

One major obstacle in current diabetic wound research is a lack of an ischemic wound model that can be safely used in diabetic animals. Drugs that work ...

High Content Screening in Neurodegenerative Diseases

Hög halt Screening vid neurodegenerativa sjukdomar

The functional annotation of genomes, construction of molecular networks and novel drug target identification, are important challenges that need to be ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Näthinneavlossning modell i gnagare genom subretinal Injektion av natriumhyaluronat

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Remote Limb Ischemic Preconditioning:  A Neuroprotective Technique in Rodents

Fjärr Limb Ischemisk Förkonditionering: neuroprotektiv Teknik Gnagare

Sublethal ischemia protects tissues against subsequent, more severe ischemia through the upregulation of endogenous mechanisms in the affected tissue. ...

Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension

Utföra subretinal injektioner i Gnagare att leverera pigmentepitelet celler i suspension

The conversion of light into electrical impulses occurs in the outer retina and is accomplished largely by rod and cone photoreceptors and retinal pigment ...

Quantitative Fundus Autofluorescence for the Evaluation of Retinal Diseases

Kvantitativ Fundus autofluorescens för utvärdering av retinala sjukdomar

The retinal pigment epithelium (RPE) is juxtaposed to the overlying sensory retina, and supports the function of the visual system. Among the tasks ...

An Acute Retinal Model for Evaluating Blood Retinal Barrier Breach and Potential Drugs for Treatment

En akut retinal modell för utvärdering Blood Retinal Barrier överträdelse och potentiella läkemedel för behandling

A low-cost, easy-to-use and powerful model system is established to evaluate potential treatments that could ameliorate blood retinal barrier breach. An ...

An Ex Vivo Tissue Culture Model for Fibrovascular Complications in Proliferative Diabetic Retinopathy

Ett Ex Vivo vävnadsodling modell för fibrovaskulär komplikationer i proliferativ diabetesretinopati

Diabetic retinopathy (DR) is the most common microvascular complication of diabetes and one of the leading causes of blindness in working-age adults. No ...

A Murine Model of Ischemic Retinal Injury Induced by Transient Bilateral Common Carotid Artery Occlusion

En murin modell av skandinaviska retinal skada framkallas av transient bilaterala gemensamma halsartären ocklusion

Diverse vascular diseases such as diabetic retinopathy, occlusion of retinal veins or arteries and ocular ischemic syndrome can lead to retinal ischemia. ...