Name: immunohistochemistry techniques to analyze cellular proliferation and neurogenesis in rats using the thymidine analog brdu
Uploaded: 2020-09-09T14:30:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemistry Techniques to Analyze Cellular Proliferation and Neurogenesis in Rats Using the Thymidine Analog BrdU at JoVE.com

ونود أن نشكر السيد ميغيل بورغوس وغوستافو لاغو على تقديم المساعدة التقنية. كما نود أن نشكر الدكتورة كلوريندا أرياس والدكتورة كارلا هيرنانديز والدكتور أوسكار غاليسيا على دعمهم الكريم في توفير الكواشف والمواد. ونشكر أيضا شعبة التحقيق والثروة السمكية التابعة للجامعة الأيبيرية الأمريكية في المكسيك على توفير التمويل لأداء هذا العمل ولتغطية نفقات إنتاج الفيديو.

<ol>
	<li>Altman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+new+neurons+formed+in+the+brains+of+adult+mammals.">Are new neurons formed in the brains of adult mammals.</a> Science. 135 (3509), 1127-1128 (1962).</li><li>Altman, J., Das, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoradiographic+and+histological+evidence+of+postnatal+hippocampal+neurogenesis+in+rats.">Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats.</a> The Journal of Comparative Neurology. 124 (3), 319-335 (1965).</li><li>Miller, M. W., Nowakowski, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bromodeoxyuridine-immunohistochemistry+to+examine+the+proliferation,+migration+and+time+of+origin+of+cells+in+the+central+nervous+system.">Use of bromodeoxyuridine-immunohistochemistry to examine the proliferation, migration and time of origin of cells in the central nervous system.</a> Brain Research. 457 (1), 44-52 (1988).</li><li>Eriksson, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+adult+human+hippocampus.">Neurogenesis in the adult human hippocampus.</a> Nature Medicine. 4 (11), 1313-1317 (1998).</li><li>Filippov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpopulation+of+nestin-expressing+progenitor+cells+in+the+adult+murine+hippocampus+shows+electrophysiological+and+morphological+characteristics+of+astrocytes.">Subpopulation of nestin-expressing progenitor cells in the adult murine hippocampus shows electrophysiological and morphological characteristics of astrocytes.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 23 (3), 373-382 (2003).</li><li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus.">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends in Neurosciences. 27 (8), 447-452 (2004).</li><li>Matia&#353;ov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+determination+of+5-bromo-2'-deoxyuridine+pharmacokinetics+in+blood+serum+after+intraperitoneal+administration+to+rats+and+mice.">Flow cytometric determination of 5-bromo-2'-deoxyuridine pharmacokinetics in blood serum after intraperitoneal administration to rats and mice.</a> Histochemistry and Cell Biology. 142 (6), 703-712 (2014).</li><li>Von Bohlen Und Halbach, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistological+markers+for+proliferative+events,+gliogenesis,+and+neurogenesis+within+the+adult+hippocampus.">Immunohistological markers for proliferative events, gliogenesis, and neurogenesis within the adult hippocampus.</a> Cell and Tissue Research. 345 (1), 1-19 (2011).</li><li>Sage, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DeconvolutionLab2:+An+open-source+software+for+deconvolution+microscopy.">DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy.</a> Methods. 115, 28-41 (2017).</li><li>Manz, W., Arp, G., Schumann-Kindel, G., Szewzyk, U., Reitner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widefield+deconvolution+epifluorescence+microscopy+combined+with+fluorescence+in+situ+hybridization+reveals+the+spatial+arrangement+of+bacteria+in+sponge+tissue.">Widefield deconvolution epifluorescence microscopy combined with fluorescence in situ hybridization reveals the spatial arrangement of bacteria in sponge tissue.</a> Journal of Microbiological Methods. 40 (2), 125-134 (2000).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Abr&#224;moff, M. D., Magalh&#227;es, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+with+imageJ.">Image processing with imageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 36-41 (2004).</li><li>. 2D and 3D Fluorescence Deconvolution Manual Available from: <a target="_blank" href="https://pages.stolaf.edu/wp-content/uploads/sites/803/2016/12/Giannini_Giannini_Deconvolution_Manual_20161215.p">https://pages.stolaf.edu/wp-content/uploads/sites/803/2016/12/Giannini_Giannini_Deconvolution_Manual_20161215.p</a> (2016)</li><li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrdU+immunohistochemistry+for+studying+adult+neurogenesis:+Paradigms,+pitfalls,+limitations,+and+validation.">BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation.</a> Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).</li><li>Revilla, V., Jones, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryostat+sectioning+of+brains.">Cryostat sectioning of brains.</a> International Review of Neurobiology. 47, 61-70 (2002).</li><li>Amaral, D. G., Scharfman, H. E., Lavenex, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dentate+gyrus:+fundamental+neuroanatomical+organization+(dentate+gyrus+for+dummies).">The dentate gyrus: fundamental neuroanatomical organization (dentate gyrus for dummies).</a> Progress in brain research. 163, 3-22 (2007).</li><li>Eadie, B. D., Redila, V. A., Christie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voluntary+exercise+alters+the+cytoarchitecture+of+the+adult+dentate+gyrus+by+increasing+cellular+proliferation,+dendritic+complexity,+and+spine+density.">Voluntary exercise alters the cytoarchitecture of the adult dentate gyrus by increasing cellular proliferation, dendritic complexity, and spine density.</a> Journal of Comparative Neurology. 486 (1), 39-47 (2005).</li><li>Leal-Galicia, P., Romo-Parra, H., Rodr&#237;guez-Serrano, L. M., Buenrostro-J&#225;uregui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+adult+hippocampal+neurogenesis+exerted+by+sexual,+cognitive+and+physical+activity:+An+update.">Regulation of adult hippocampal neurogenesis exerted by sexual, cognitive and physical activity: An update.</a> Journal of Chemical Neuroanatomy. 101, 101667 (2019).</li><li>Gould, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+widespread+is+adult+neurogenesis+in+mammals.">How widespread is adult neurogenesis in mammals.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 481-488 (2007).</li><li>Ngwenya, L. B., Peters, A., Rosene, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+and+electron+microscopic+immunohistochemical+detection+of+bromodeoxyuridine-labeled+cells+in+the+brain:+Different+fixation+and+processing+protocols.">Light and electron microscopic immunohistochemical detection of bromodeoxyuridine-labeled cells in the brain: Different fixation and processing protocols.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (7), 821-832 (2005).</li><li>Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+and+multiple+labeling+with+antibodies+from+the+same+host+species+to+study+adult+hippocampal+neurogenesis.">Immunohistochemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52551 (2015).</li><li>Tuttle, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+detection+of+two+thymidine+analogues+(CldU+and+IdU)+in+primary+tissue.">Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (46), e2166 (2010).</li><li>Tischler, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple+immunohistochemical+staining+for+bromodeoxyuridine+and+catecholamine+biosynthetic+enzymes+using+microwave+antigen+retrieval.">Triple immunohistochemical staining for bromodeoxyuridine and catecholamine biosynthetic enzymes using microwave antigen retrieval.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 1-4 (1995).</li><li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+studying+adult+neurogenesis:+Insights+and+recent+developments.">Protocols for studying adult neurogenesis: Insights and recent developments.</a> Regenerative Medicine. 2 (1), 51-62 (2007).</li><li>Leuner, B., Glasper, E. R., Gould, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymidine+analog+methods+for+studies+of+adult+neurogenesis+are+not+equally+sensitive.">Thymidine analog methods for studies of adult neurogenesis are not equally sensitive.</a> Biosystems. 517 (2), 123-133 (2010).</li><li>Magavi, S. S., MacKlis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+newborn+cells+by+BrdU+labeling+and+immunocytochemistry+in+vivo.">Identification of newborn cells by BrdU labeling and immunocytochemistry in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 438, 335-343 (2008).</li><li>Kempermann, G., Gast, D., Kronenberg, G., Yamaguchi, M., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+determination+and+long-term+persistence+of+adult-generated+new+neurons+in+the+hippocampus+of+mice.">Early determination and long-term persistence of adult-generated new neurons in the hippocampus of mice.</a> Development. , 391-399 (2003).</li><li>Ramos-Vara, J. A., Beissenherz, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+immunohistochemical+methods+using+two+different+antigen+retrieval+methods+on+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues:+Experience+with+63+markers.">Optimization of immunohistochemical methods using two different antigen retrieval methods on formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: Experience with 63 markers.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 12 (4), 307-311 (2000).</li><li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+methods+of+immunohistochemistry.">Principles and methods of immunohistochemistry.</a> Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).</li><li>Wojtowicz, J. M., Kee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrdU+assay+for+neurogenesis+in+rodents.">BrdU assay for neurogenesis in rodents.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).</li></ol>

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

تكوين الخلايا العصبية للبالغين هو عملية تحدث بشكل متكرر في منافذ خلايا السلائف العصبية البالغة التي لديها القدرة على توليد خلايا عصبية جديدة طوال حياتها. يستخدم وضع العلامات على برومودوكيوريدين (BrdU) على نطاق واسع في علم المناعة لتوصيف عدد الخلايا المولدة حديثا في دماغ البالغين. سيتم دمج BrdU بشكل أساسي في خلايا مناطق الدماغ المنفصلة (المناطق العصبية). تقع هذه الخلايا في المنطقة تحت البطينية (SVZ) ، التلفيف المسنن للحصين - بين الخلايا الحبيبية والخلايا الحبيبية المعروفة باسم المنطقة شبه الحبيبية (SGZ) 1،2،18. علاوة على ذلك ، هناك مناطق دماغية مختلفة تتميز بقدرة تكاثرية أقل في مرحلة البلوغ ، بما في ذلك منطقة ما تحت المهاد ، والمخطط ، والقشرة المخية الحديثة ، واللوزة19. كما ذكرنا من قبل ، فإن تلطيخ BrdU هو الطريقة الشائعة الاستخدام لأبحاث تكوين الخلايا العصبية للبالغين للكشف عن تكاثر الخلايا. ومع ذلك ، فإن استخدام BrdU كعلامة له قيود ومطبات. الأول هو أن BrdU هي علامة دورة الخلية. لذلك ، يجب إجراء تلطيخ مزدوج أو ثلاثي لتحديد مصير الخلية وتضمين علامات الخلية للكشف عن مرحلة النمو المحددة للخلايا الموسومة. مصدر قلق آخر حول BrdU هو أنه محلول سام ومطفرة يعدل استقرار الحمض النووي قد يغير الوظيفة الخلوية ودورات الخلية. وينبغي إيلاء الاعتبار للمعلومات السابقة عند اتخاذ قرار باتباع بروتوكول الإعطاء وجرعات الإعطاء (50-600 مغ/كغ). ميزة أخرى حاسمة هي أن BrdU هو علامة تخليق الحمض النووي ، وليس علامة تكاثر الخلايا14. لذلك ، من المهم التمييز بين تكاثر الخلايا والأحداث الأخرى مثل إصلاح الحمض النووي ، وإعادة دخول دورة الخلية المجهضة ، وتكرار الجينات. يجب على الباحثين اتباع الضوابط المناسبة لضمان الاستخدام المناسب ل BrdU. للحصول على مناقشة أكثر تفصيلا حول هذه المشاكل والقيود ، نوصي بمراجعة عمل توبين14. يمكن أن تكون عملية توحيد بروتوكول الكيمياء الهيستولوجية المناعية بطيئة وصعبة. في هذا العمل ، قدمنا جميع الخطوات العامة لإدارة بروتوكول IHC ناجح. ومع ذلك ، نوصي بأن تقوم كل مجموعة بحثية باختبار وتقييم الأنسجة والأجسام المضادة والظروف مسبقا. يجب إجراء الاختبارات والتقييمات مع ثلاثة مستويات مختلفة على الأقل من الحضانة وخطوات الغسيل ونقاط القوة لكل جسم مضاد وأنسجة تم اختبارها. نوصي أيضا بأن يقوم الباحثون بمراجعة البروتوكولات الإضافية ليتمكنوا من اختيار أفضل ما يلبي الاحتياجات والمتطلبات المحددة20،21،22،23،24،25.
كما ذكرنا سابقا ، يتضمن الإجراء العديد من الخطوات والاعتبارات المنهجية التي يشيع استخدامها وذكرها في المقالات العلمية ، والتي سيتم مناقشتها لاحقا. نوصي الباحثين باختيار الأجسام المضادة بعناية وبشكل صحيح من حيث التقنية والميزانية والمعدات والإعداد والهدف البحثي الرئيسي. يجب اختبار الأجسام المضادة بنفس نوع الأنسجة التي سيتم اختبارها لاحقا في التجربة. نوصي أيضا باستخدام جسم مضاد تم اختباره لنفس الغرض (IHC) (أي ليس فقط في تقنيات قياس اللطخة الغربية أو التدفق الخلوي) لاختبار توافقه مع تقنية التثبيت. يمكن استخدام طرق مختلفة لإدارة تلطيخ BrdU مثل الحقن داخل الصفاق ، أو التسريب داخل الصفاق ، أو الابتلاع عن طريق الفم ، أو التسريب داخل البطيني (للحصول على وصف أكثر تفصيلا لكل تقنية ، انظر المرجع26). إذا تم اختيار الحقن داخل الصفاق ، تأكد من إعطاء BrdU في التجويف البريتوني مع تجنب منطقة الأمعاء. نظرا لأن الأمعاء تحتوي على العديد من الخلايا المكررة التي يمكن أن تستنفد BrdU قبل أن تصل إلى الدماغ مما سيؤثر على عدد الخلايا الموصوفة. من الأهمية بمكان الحصول على أقسام رقيقة لأنها تسمح باختراق أفضل للحلول. تم قطع شرائح إكليلية بسمك 40 ميكرومتر بشكل ذيلي وتم نقلها إلى صفيحة زراعة خلية مكونة من 24 بئرا ، باتباع الإجراء المجسم الذي اقترحه Kempermann et al.27. يمكن إجراء الكيمياء الهيستولوجية المناعية باستخدام أنسجة مثبتة على شرائح أو كأقسام عائمة حرة. نظرا لأن BrdU يقع في عمق نوى الخلايا ، فإنه يسمح باختراق الحلول في الأقسام العائمة الحرة مما يوفر نتائج أفضل ووصولا أفضل إلى منطقة الاهتمام. من المهم فتح روابط الحمض النووي (تمسخ الحمض النووي) للسماح بوصول الأجسام المضادة الأولية المضادة ل BrdU. في هذا العمل ، قمنا بتنفيذ هذه الإجراءات المحددة باستخدام حضانة HCI. من ناحية أخرى ، سمحت عملية حظر الحلقات غير المحددة بتحديد أكثر دقة لإشارة الخلية.
تسمح نفاذية الغشاء الجيدة للأجسام المضادة باختراق منطقة الاهتمام بشكل صحيح. تؤدي إضافة جهاز اختراق مثل Triton X-100 إلى حلول PBS ++ و PBS + إلى تحسين نفاذية الغشاء. يمكن استخدام كل من كواشف PBS و Tris-buffered Saline (TBS) في هذا البروتوكول. من حيث الميزانية ، يمكن أن تكون TBS أرخص نسبيا من PBS. ومع ذلك ، يمكن أن يتداخل برنامج تلفزيوني مع الأجسام المضادة المضادة للفوسفات ويمنع الأجسام المضادة القلوية المترافقة بالفوسفاتيز ، لذا تجنب استخدام PBS إذا تم تعديل الهدف بعد الترجمة عن طريق الفسفرة (أي الفسفرة). استخدمنا PBS لهذا العمل ، واكتشفنا أن خطوات غسل الأنسجة أعطت إشارة أكثر تحديدا. نوصي الباحثين أيضا بإجراء ثلاث دورات غسيل على الأقل باستخدام TBS o PBS. يجب أن تكون الحلول طازجة. استرجاع المستضد (AR) هو طريقة تهدف إلى تقليل فقدان المستضدات الناجم عن التثبيت الذي يعدل بنية المستضدات الثلاثية والرباعية. هذا التخفيض يجعل المستضدات غير قابلة للكشف بواسطة الأجسام المضادة28,29. حاول استرجاع الحاتم الناجم عن الحرارة (HIER) المستخدم في هذا البروتوكول عكس التفاعلات الكيميائية بين الفورمالديهايد والبروتينات عن طريق درجة حرارة عالية أو تحلل قلوي قوي (مع محاليل عازلة أخرى مثل EDTA pH 8.5 أو Tris pH 9.5). من الضروري اختبار الأجسام المضادة الجديدة ببروتوكولات AR مختلفة لمقارنة النتائج واختيار الأفضل للبروتوكول. قد تكون هذه الخطوة الأخيرة اختيارية في بروتوكول عادي. ومع ذلك ، قمنا بمعالجة الأنسجة ببروتوكول استرجاع المستضد لتقديم نتائج أفضل لهذا البروتوكول.
من الأهمية بمكان اختيار اللون المتباين النهائي الصحيح وتقنية التلوين المضاد مع مراعاة لون التلوين الأساسي والطريقة المستخدمة لجعل بنية غير ملطخة مرئية وتجنب إخفاء لون التلوين الأساسي من رد الفعل المناعي. بالنسبة للفحص المجهري الفلوري ، فإن DAPI (4 '، 6-diamidino-2-phenylindole) هو مضاد نووي وكروموسوم شائع جدا ينبعث منه مضان أزرق (الامتصاص: 360 نانومتر ، الانبعاث: 460 نانومتر) عند الارتباط بمناطق AT من الحمض النووي. يتوفر وسيط تركيب يحتوي على DAPI وهو سهل الاستخدام ؛ يوفر هذا احتفاظا ممتازا بالإشارة للحصول على الصور. بالنسبة لتفاعل البيروكسيد ، كان IHC متاحا في خيارات مختلفة مثل الكريسيل البنفسجي أو الهيماتوكسيلين أو الأحمر المحايد أو تلطيخ الميثيل الأخضر. بالنسبة لتقنيات التلوين المناعي المتعددة ، من الضروري اختيار جسم مضاد متوافق مع تقنية التثبيت المستخدمة لتجنب التفاعل المتبادل30. عندما يتم حل المشكلات والمضاعفات المتعلقة بالتلوين الفردي ، قم بإدارة تلطيخ لون آخر حسب الضرورة. من الأهمية بمكان التحكم في الارتباط غير المحدد بين الأجسام المضادة الثانوية. يمكن القيام بذلك عن طريق تشبع الأجسام المضادة الأولية قبل استخدام جسم مضاد ثانوي ينتج في نفس النوع المضيف من الأجسام المضادة الأولية. على سبيل المثال ، عند استخدام مضاد للفأر المنتج في الأرانب ومضاد للأرانب المنتج في الأجسام المضادة الثانوية للماعز ، يجب استخدام مضاد الأرنب المنتج في الجسم المضاد للماعز قبل مضاد الفأر المنتج في الجسم المضاد للأرانب. عندما تهيمن الطريقة المتسلسلة تماما ، يمكن بدء عملية التلوين المناعي المتزامنة. في هذه الطريقة ، من الضروري اختيار الأجسام المضادة الثانوية بشكل مناسب. من الناحية المثالية ، يجب أن تأتي كل هذه الأجسام المضادة من نفس الحيوان المضيف لتجنب التفاعل المتبادل. نوصي بإجراء تحكم إيجابي للتأكد من أن طريقة التلوين تعمل بدقة في أنسجة الحصين بعد الولادة (تكوين عصبي وفير في هذا العمر). إذا أظهرت أنسجة التحكم الإيجابية مشاكل في التلوين ، فقم بمراجعة الإجراء ومراجعته ، وقم بإجراء التصحيحات والتعديلات ، وكرر حتى يتم إنتاج تلطيخ جيد. بعد ذلك ، قم بتشغيل عنصر تحكم سلبي لاختبار أن الجسم المضاد يعمل بشكل صحيح عن طريق حذف أو استبدال جسم مضاد أولي معين بمصل طبيعي (نفس نوع الجسم المضاد الأساسي). كما هو مذكور في المقدمة ، يعد إزالة التفاف الصورة أداة قوية ويوفر بديلا عندما لا يتوفر مجهر متحد البؤر. يمكنه تطبيق فك التفاف الصورة على جميع الصور المكتسبة باستخدام المجال الساطع للضوء المرسل ، ومضان المجال الواسع ، والفحص المجهري الفلوري متحد البؤر. الغرض النهائي من فك التفاف الصورة هو إعادة بناء الإشارة الأصلية بأن نظام الاستحواذ يتدهور10.
باختصار ، فإن تحديد الخلايا المولدة حديثا التي تم تصورها بواسطة الكشف المناعي للثيميدين التناظري BrdU هو تقنية معقدة ولكنها قوية. هذا العمل هو محاولة لمساعدة العلماء ، لا سيما في مجال تكوين الخلايا العصبية الحصينية البالغة ، لتحديد الخلايا الجديدة بشكل أكثر دقة. نأمل أن يكون هذا الجهد مفيدا للمجتمع العلمي ويجعل من السهل ضبط دراسة تكاثر الخلايا بواسطة تقنية الكيمياء المناعية.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENT PREPARATION AND SETUP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donor Horse Serum</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>S0900</td>
			<td>Blocking and incubation solutions in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde reagent grade, crystalline (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>toxic, flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746436-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, monobasic</td>
			<td>J.T Bker</td>
			<td>3246-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sacarose</td>
			<td>J.T Baker</td>
			<td>4072-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Meyer</td>
			<td>2365-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td>Corrisive, to calibrate pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phophate Dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9763-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-x 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THYMIDINE ANALOGUE BRDU ADMINISTRATION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Bromo-2&#8242;-deoxyuridine, BrdU</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9285</td>
			<td>toxic (mutagenic, teratogenic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23&#8211;27G hypodermic needle</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution</td>
			<td>PiSA</td>
			<td>30130032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 1 mL</td>
			<td>NIPRO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TISSUE PREPARATION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-ml polypropylene conical tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-ml polypropylene conical tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guillotine</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome Cryostat</td>
			<td>MICROM</td>
			<td>HM525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netwell 15 mm polyester mesh membrane inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3477</td>
			<td>pre-loaded in 12-well culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netwell plastic 12-well carrier kit</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3520</td>
			<td>for 15 mm polyester mesh membrane inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netwell plastic 6-well carrier kit</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>7553-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>IKA</td>
			<td>ROKCER 3D Digital</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMMUNOSTAINING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td>1%, Light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit (with Nickel), 3,3&#8217;-diaminobenzidine</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>carcinogenic, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydochloric Acid</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>9535-05</td>
			<td>Corrosive, to calibrate pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide, 50%</td>
			<td>Meyer</td>
			<td>5375-1L</td>
			<td>Toxic, oxidative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASTAIN&#174; Elite&#174; ABC Kit Peroxidase (HRP)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td>enzymatic, avidin/biotin based amplification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HPA056030</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-BrdU antibody produced in Mouse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2531</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-065-151</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, HRP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>G-21040</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG (whole molecule), TRITC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5393</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed, FITC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F-2765</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Cy3</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SA-1300</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAGING AND ANALYSIS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell Computer Company</td>
			<td>T8P8T-7G8MR-4YPQV-96C2F-7THHB</td>
			<td>For controlling and monitoring protocols&#8217; processes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD-camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UC50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSens Standard software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>cellSens Standard Edition</td>
			<td>Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-pressure 130 W mercury arc lamp</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-HGLGPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low autofluorescence immersion oil</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MOIL-30 Type F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover-glasses (VWR, cat no 48404 454; 24&#160; 60 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (VWR, cat no 48323-185; 76&#160; 26 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-FBW filter cube</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-FBW</td>
			<td>excitation 460 - 495 nm, dichroic mirror 505 nm, suppression 510 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-FGW filter cube</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-FGW</td>
			<td>excitation 530 - 550 nm, dichroic mirror 570 nm, suppression 575 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-FUW filter cube</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-FUW</td>
			<td>excitation 340 - 490 nm, dichroic mirror 410 nm, suppression 420 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemistry techniques to analyze cellular proliferation and neurogenesis in rats using the thymidine analog brdu

أحد أهم الأشياء في مجال تكوين الخلايا العصبية الحصينية للبالغين (AHN) هو تحديد الخلايا المولدة حديثا. الكشف المناعي لنظائر الثيميدين (مثل 5-Bromo-2'-deoxyuridine (BrdU)) هو تقنية قياسية تستخدم لتصور هذه الخلايا المولدة حديثا. لذلك ، عادة ما يتم حقن BrdU في الحيوانات الصغيرة داخل الصفاق ، لذلك يتم دمج نظير الثيميدين في الخلايا المنقسمة أثناء تخليق الحمض النووي. يتم الكشف عن طريق التحليل المناعي الكيميائي لشرائح الدماغ. يمكن لكل مجموعة بحثية تستخدم هذه التقنية أن تقدر أنها تتطلب اهتماما خاصا بالتفاصيل الدقيقة لتحقيق بقعة ناجحة. على سبيل المثال ، خطوة مهمة هي تمسخ الحمض النووي باستخدام حمض الهيدروكلوريك ، مما يسمح له بالوصول إلى نواة الخلية لتلطيخها. ومع ذلك ، فإن التقارير العلمية الحالية تصف عددا قليلا جدا من هذه الخطوات بالتفصيل. لذلك ، فإن توحيد التقنية يمثل تحديا للمختبرات الجديدة حيث قد يستغرق الأمر عدة أشهر لتحقيق نتائج إيجابية وناجحة. الغرض من هذا العمل هو وصف وتوضيح الخطوات للحصول على نتائج إيجابية وناجحة لتقنية التلوين المناعي بالتفصيل عند العمل مع الثيميدين التناظري BrdU. يتضمن البروتوكول إعداد الكاشف وإعداده ، وإدارة نظير الثيميدين في القوارض ، والتروية عبر القلب ، وإعداد الأنسجة ، والتفاعل الكيميائي المناعي للبيروكسيديز ، واستخدام مجمع أفيدين بيوتين ، والتألق المناعي ، والتلطيخ المضاد ، والتصوير المجهري ، وتحليل الخلايا.

تم تطبيق الطرق الموضحة أعلاه لتحديد خلايا حديثي الولادة في قرن آمون الفئران البالغة بعد النشاط البدني الطوعي ، على عكس المجموعة الضابطة دون أي نشاط بدني إضافي. استخدمنا الحصين الفئران بعد الولادة كعنصر تحكم إيجابي. كانت الفئران الذكور التي تبلغ من العمر 3 أشهر تحت بروتوكول النشاط البدني الطوعي (عجلة لا نهاية لها) لمدة سبعة أيام. في اليوم 6 ، تم حقن الفئران ب BrdU (القسم 2) ، وكل 12 ساعة بعد ثلاث حقن كاملة. لإكمال ثلاثة أقسام دورة الخلية ، تم تخلل الحيوانات عبر القلب (القسم 3) 8 ساعات بعد آخر حقن BrdU. تم استخدام نفس الإجراء على الفئران البالغة من العمر ثلاثة أشهر والتي لم تخضع لنشاط بدني لاستخدامها كعنصر تحكم مقارن. كعنصر تحكم إيجابي ، تم حقن جراء الفئران البالغة من العمر يوما واحدا (يوم ما بعد الولادة 1) ب BrdU مرة واحدة ، كما هو موضح في القسم 2 أعلاه. بعد يوم واحد من الحقن (يوم ما بعد الولادة 2) ، تم القتل الرحيم للجراء ، وتم غمر رؤوسهم في محلول PFA ، كما هو موضح في الخطوة 3.4. تم تخدير الفئران البالغة بعمق (الخطوة 3.1) ، وتخدير عبر القلب ، كما هو موضح في الخطوة 3.2. تم تشريح الأدمغة وتثبيتها بعد ذلك (الخطوة 3.4). تم تقطيع الأدمغة إلى أقسام إكليلية 40 ميكرومتر (الخطوة 3.5). تمت معالجة الأقسام للكيمياء الهيستولوجية المناعية BrdU ، كما هو موضح في الخطوة 4.
استخدمنا تفاعل بيروكسيديز الفجل مع DAB IHC للتلطيخ (الخطوة 4.1) وعد الخلايا الإيجابية BrdU في DG. يوضح الشكل 5 مقطع DG به خلايا تحمل علامة BrdU. يوضح الشكل 5C ، D جزءا تمثيليا من قسم DG بتكبير أعلى. أظهرت الخلايا المصنفة تلطيخا داكنا شديدا ، تم تمييزه بالسهام. يظهر الجزء الداخلي متوسط عدد الخلايا المصنفة في المجموعتين التجريبية والضابطة (الخلايا الموجبة المحسوبة مضروبة في ستة كما هو موضح في الخطوة 8.1). كشف اختبار t للطالب عن اختلافات في الدلالة بين أعداد الخلايا الإيجابية BrdU (t (10) = 2.704 ، p = 0.0222). أظهرت المجموعة الضابطة التي لم تخضع للنشاط البدني 2040 ± 314 خلية (ن = 6 فئران). وبالمقارنة ، أظهرت مجموعة النشاط البدني ، في المتوسط ، 3,606 ± 486 (ن = 6 فئران) خلايا إيجابية BrdU. كما لوحظ ، يزيد التعرض للنشاط البدني من الخلايا الإيجابية ل BrdU. لذلك ، تتوافق هذه النتائج مع النتائج الأخرى المبلغ عنها والتي تظهر أن النشاط البدني زاد من الانتشار الخلوي في التلفيف المسننالبالغ 17.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig03.jpg"> الشكل 3: أمثلة على الأشكال المختلفة لنواة الخلية الموسومة ب BrdU. BrdU هي علامة تخليق الحمض النووي التي تسمي النواة. في منطقة الحصين ، كان للنوى الإيجابية BrdU شكل شبه بيضاوي يقع في المنطقة الحبيبية الفرعية للتلفيف المسنن. نظرا لأن BrdU يتم دمجه من خلال المنافسة ، فإن الكمية المدمجة لكل خلية سيكون لها اختلاف سينعكس لاحقا في كيفية تصور النواة. أ: صورة التألق المناعي. (ب) صورة تستخدم تفاعل البيروكسيديز بدون طريقة تضخيم إضافية. تظهر الأسهم الصفراء القطع الأثرية والإشارات غير المحددة. تظهر الأسهم السوداء أو البيضاء خلايا BrdU +. 1- نواة ملفوفة بالكامل، شبه بيضاوية نوى ملونة للغاية. 2 – النوى ذات النقاط ، يتم تمييز حدود النوى ولها عدة نقاط بداخلها. 3 - النوى ذات النقاط القليلة ، يتم تمييز حدود النوى ولها عدد قليل من النقاط بداخلها. 4 - النواة الصغيرة هي خلايا محتملة في مرحلة تمايز مختلفة ولكنها لا تزال جزءا من مكانتها. 5 - المجموعات هي خلايا سلائف تحت الانقسام ، لذلك يمكن ملاحظة عدة خلايا معا في مجموعات مكثفة. ضمن هذه المجموعات ، يجب إجراء العد بعناية خاصة لتجنب تسمية الخلايا الإيجابية بشكل خاطئ. تظهر الأسهم الحمراء النواة تحت الانقسام التي يمكن الخلط بينها لتكون خلية واحدة. يتم وضع كل خلية في صندوق ويمكن تمييزها في مستوى المحور Z في الوقت الفعلي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig03large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig04.jpg"> الشكل 4: صورة RGB تمثيلية للقنوات الفردية والمدمجة. تعرض الصورة العلوية صورة z-stack الأصلية ، وتظهر الصورة السفلية صورة z-stack غير الملتوية 3D. (أ) تكبير منخفض للمدير العام. (B) صورة RGB لكل قناة، و (C) صورة RGB مدمجة. كان هذا دماغا من المجموعة الضابطة. تم استخدام التألق المناعي بدون طريقة تضخيم إضافية. BrdU (أحمر) ، DAPI كمضاد (أزرق) ، و GFAP (بروتين حمضي ليفي دبقي) كعلامة نجمية (أخضر). ML = الطبقة الجزيئية ؛ GCL = طبقة الخلية الحبيبية ؛ SGZ = المنطقة تحت الحبيبية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig04large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig05.jpg"> الشكل 5: قسم DG التمثيلي مع خلايا تحمل علامة BrdU (مظلمة شديدة) لكل مجموعة تجريبية. تم استخدام تفاعل البيروكسيديز مع طريقة تضخيم مركب avidin-biotin-peroxidase. (أ، ب) إظهار تكبير منخفض ل DG ، و (C ، D) إظهار منطقة المربع بتكبير أعلى. اللوحتان A و C هما أنسجة من مجموعة النشاط البدني ، واللوحات B و D من المجموعة الضابطة. يوضح الجزء الداخلي متوسط عدد الخلايا المصنفة في مجموعات النشاط البدني والمجموعة الضابطة (الخلايا الموجبة المحسوبة مضروبة في ستة كما هو موضح في الخطوة 8.1). ML = الطبقة الجزيئية ؛ GCL = طبقة الخلية الحبيبية ؛ SGZ = المنطقة تحت الحبيبية ؛ تشير الأسهم إلى خلايا BrdU +. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig05large.jpg" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.</a>
فيديو 1: فيديو يظهر تركيزا مختلفا للخلايا الموجبة على طول المحور z موزعة في طبقات مختلفة. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61483/VIDEO_1.avi" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.</a>
فيديو 2: فيديو يظهر تركيزا مختلفا لمجموعات الخلايا الموجبة على طول المحور z موزعة في طبقات مختلفة. تحرك ببطء فوق المحور z لتحديد جميع النوى العديدة التي تدمج العنقود. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61483/VIDEO_2.mp4" target="_blank">الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الفيديو.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>نوع المجهر:</td>
			<td colspan="5">مجهر التألق أوليمبوس BX53</td>
		</tr><tr><td>مصدر الضوء:</td>
			<td colspan="5">مصباح قوس زئبقي عالي الضغط بقوة 130 واط (U-HGLGPS)</td>
		</tr><tr><td>برامج الاستحواذ:</td>
			<td colspan="5">سيل سينس ستاندرد</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">مجموعات المرشحات:</td>
			<td colspan="2">رقم الكتالوج</td>
			<td>نطاق الإثارة</td>
			<td>مرآة ثنائية اللون</td>
			<td>نطاق قمع</td>
		</tr><tr><td colspan="2">يو فوو</td>
			<td>340 - 490 نيوتن متر</td>
			<td>410 نيوتن متر</td>
			<td>420 نيوتن متر</td>
		</tr><tr><td colspan="2">يو إف بي دبليو</td>
			<td>460 - 495 نيوتن متر</td>
			<td>505 نيوتن متر</td>
			<td>510 نيوتن متر</td>
		</tr><tr><td colspan="2">يو إف جي دبليو</td>
			<td>530 - 550 نيوتن متر</td>
			<td>570 نيوتن متر</td>
			<td>575 نيوتن متر</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">كاميرا:</td>
			<td colspan="2">نموذج:</td>
			<td colspan="3">CCD - كاميرا UC50</td>
		</tr><tr><td colspan="2">النطاق الطيفي:</td>
			<td colspan="3">290 – 1000 نيوتن متر</td>
		</tr><tr><td colspan="2">حجم رقاقة اتفاقية مكافحة التصحر:</td>
			<td colspan="3">2/3 بوصة ، 2588 (العرض * 7) × 1960 (الارتفاع * 8) بكسل</td>
		</tr><tr><td colspan="2">حجم بكسل:</td>
			<td colspan="3">3.4 × 3.4 ميكرومتر</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">الفلوروكروم:</td>
			<td colspan="2">اسم</td>
			<td>الطول الموجي للإثارة (نانومتر)</td>
			<td>الانبعاث * 3 الطول الموجي (نانومتر)</td>
			<td>لون الانبعاث</td>
		</tr><tr><td colspan="2">4 ، 6-دياميدينو -2-فينيل إندول HCI (DAPI)</td>
			<td>345</td>
			<td>455</td>
			<td>أزرق</td>
		</tr><tr><td colspan="2">رباعي ميثيل رودامين-إيزوثيوسيانات (TRITC)</td>
			<td>541</td>
			<td>572</td>
			<td>أحمر</td>
		</tr><tr><td colspan="2">فلوريسئين-أيزوثيوسيانات (FITC)</td>
			<td>494</td>
			<td>519</td>
			<td>أخضر</td>
		</tr><tr><td colspan="2">سي 3</td>
			<td>552</td>
			<td>565</td>
			<td>أحمر</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">تصاعد المتوسطة وزيت الغمر:</td>
			<td colspan="3">اسم</td>
			<td colspan="2">فهرس انكسار الوسائط *1</td>
		</tr><tr><td colspan="3">الهواء (لا شيء بين الشريحة والعدسة)</td>
			<td colspan="2">1.00029</td>
		</tr><tr><td colspan="3">وسيط تركيب مضاد للتلاشي مع DAPI</td>
			<td colspan="2">1.45</td>
		</tr><tr><td colspan="3">بيرماونت تصاعد المتوسطة</td>
			<td colspan="2">1.519</td>
		</tr><tr><td colspan="3">زيت غمر منخفض التألق الذاتي (MOIL-30 Type F)</td>
			<td colspan="2">1.518</td>
		</tr><tr><td rowspan="6">عدسة التكبير (خطة الفلوريت)</td>
			<td>التكبير</td>
			<td>الفتحة العددية (NA) *2</td>
			<td>القرار (ميكرومتر)</td>
			<td>تباعد بكسل الصورة (نانومتر) *5</td>
			<td>تباعد الشرائح المحور Z (نانومتر) *6</td>
		</tr><tr><td>4 أضعاف</td>
			<td>0.13</td>
			<td>2.12</td>
			<td>850</td>
			<td>3000</td>
		</tr><tr><td>10 أضعاف</td>
			<td>0.3</td>
			<td>0.92</td>
			<td>340</td>
			<td>3000</td>
		</tr><tr><td>20 ضعفا</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.55</td>
			<td>170</td>
			<td>2000</td>
		</tr><tr><td>40 ضعفا</td>
			<td>0.75</td>
			<td>0.37</td>
			<td>85</td>
			<td>1000</td>
		</tr><tr><td>100 مرة</td>
			<td>1.3</td>
			<td>0.21</td>
			<td>34</td>
			<td>1000</td>
		</tr></tbody></table>الجدول 2: مواصفات إعداد المجهر ومتطلبات إنشاء ملف وظيفة انتشار النقطة (PSF). هناك 11 فتحة في نافذة البرنامج المساعد PSF 3D الحيود لإنشاء ملف PSF. يتم وصف كل فتحة على النحو التالي: *1 - مؤشر انكسار الوسائط: مؤشر الانكسار للوسط بين الشريحة والعدسة (على سبيل المثال، الهواء = 1.00029). *2 - فتحة العدسة العددية: NA للعدسة المستخدمة (يجب تصحيحها عند استخدام وسائط غمر مختلفة وتعيين العدسة لها). *3 - الطول الموجي: أقصى طول موجي لانبعاث فلوروكروم (نانومتر). *4 - الانحراف الكروي الطولي: 0.00. *5 - تباعد بيكسل الصورة: حجم بيكسل CCD (نانومتر)/تكبير (على سبيل المثال، عدسة 3.4 ميكرومتر و100X، 3400/100 = 34 نانومتر). *6 - المسافة بين الصور على المحور Z. *7 - العرض: أدخل عرض الصورة المراد فك تلفها بالبكسل. *8 - الارتفاع: أدخل ارتفاع الصورة المراد فك تلفها بالبكسل. *9 - العمق، الشرائح: عدد الصور في z-stack. *10 - التطبيع: مجموع قيم البكسل = 1. *11 - العنوان: الاسم المطلوب لملف PSF. يجب أن يتطابق الملف مع صورة z-stack الفريدة المحددة.

Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemistry Techniques to Analyze Cellular Proliferation and Neurogenesis in Rats Using the Thymidine Analog BrdU at JoVE.com

Immunohistochemistry Techniques to Analyze Cellular Proliferation and Neurogenesis in Rats Using the Thymidine Analog BrdU

تقدم هذه الورقة أربعة من أكثر التقنيات شيوعا لتصور الخلايا الإيجابية BrdU لقياس تكوين الخلايا العصبية البالغة في الفئران. يتضمن هذا العمل تعليمات لإعداد الكاشف ، وإدارة الثيميدين التناظرية ، والتروية عبر القلب ، وإعداد الأنسجة ، والتفاعل الكيميائي المناعي للبيروكسيديز ، والتألق المناعي ، وتضخيم الإشارة ، والتلوين المضاد ، والتصوير المجهري ، وتحليل الخلايا.

تقنيات الكيمياء الهيستولوجية المناعية لتحليل الانتشار الخلوي وتكوين الخلايا العصبية في الفئران باستخدام Thymidine Analog BrdU

One of the most important things in the field of adult hippocampal neurogenesis (AHN) is the identification of the newly generated cells. The ...

Research

JoVE Journal

Biology

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

قشري الخلايا العصبية : الانتقال من التقدم في مختبر لخلية القاعدة العلاجات

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

المناعية : أقسام البارافين باستخدام ABC Vectastain مجموعة من مختبرات المتجهات

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

المناعية على أقسام البارافين للبشرة باستخدام الماوس أجسام نيون

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

ذبابة الفاكهة اليرقات NMJ المناعية

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

تقنيات Microinjection لدراسة الانقسام الميتوزي في ذبابة الفاكهة السوداء البطن الأجنة المخلوي

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

أعربت المشبك التصحيح وتقنيات الإرواء لدراسة في قنوات ايون القيطم البويضات

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

فحص البروتينات ملزمة لالوليدة DNA في خلايا الثدييات عن طريق BrdU رقاقة فتحة للغرب تقنية

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

استخدام أجهزة ميكروفلويديك لقياس عمر والخلوية الظواهر في خلايا الخميرة في مهدها واحدة

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

تقنيات للحث وتحديد الخلوي الشيخوخة

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

إدارة بسيطة وفعالة والتصور من المجهرية الدقيقة في الدورة الدموية للأسماك الصغيرة باستخدام الحقن الكلي

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...