Name: immunohistochemistry techniques to analyze cellular proliferation and neurogenesis in rats using the thymidine analog brdu
Uploaded: 2020-09-09T14:30:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemistry Techniques to Analyze Cellular Proliferation and Neurogenesis in Rats Using the Thymidine Analog BrdU at JoVE.com

Vi vil gerne takke Miguel Burgos og Gustavo Lago for at yde teknisk bistand. Vi vil også gerne takke Dr. Clorinda Arias, Dr. Karla Hernandez og Dr. Oscar Galicia for deres venlige støtte til at levere reagenser og materiale. Vi takker også División de Investigación y Posgrado fra Universidad Iberoamericana Ciudad de México for at yde finansiering til udførelsen af dette arbejde og for at dække videoproduktionsudgifter.

<ol>
	<li>Altman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+new+neurons+formed+in+the+brains+of+adult+mammals.">Are new neurons formed in the brains of adult mammals.</a> Science. 135 (3509), 1127-1128 (1962).</li><li>Altman, J., Das, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoradiographic+and+histological+evidence+of+postnatal+hippocampal+neurogenesis+in+rats.">Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats.</a> The Journal of Comparative Neurology. 124 (3), 319-335 (1965).</li><li>Miller, M. W., Nowakowski, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bromodeoxyuridine-immunohistochemistry+to+examine+the+proliferation,+migration+and+time+of+origin+of+cells+in+the+central+nervous+system.">Use of bromodeoxyuridine-immunohistochemistry to examine the proliferation, migration and time of origin of cells in the central nervous system.</a> Brain Research. 457 (1), 44-52 (1988).</li><li>Eriksson, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+adult+human+hippocampus.">Neurogenesis in the adult human hippocampus.</a> Nature Medicine. 4 (11), 1313-1317 (1998).</li><li>Filippov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpopulation+of+nestin-expressing+progenitor+cells+in+the+adult+murine+hippocampus+shows+electrophysiological+and+morphological+characteristics+of+astrocytes.">Subpopulation of nestin-expressing progenitor cells in the adult murine hippocampus shows electrophysiological and morphological characteristics of astrocytes.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 23 (3), 373-382 (2003).</li><li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus.">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends in Neurosciences. 27 (8), 447-452 (2004).</li><li>Matia&#353;ov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+determination+of+5-bromo-2'-deoxyuridine+pharmacokinetics+in+blood+serum+after+intraperitoneal+administration+to+rats+and+mice.">Flow cytometric determination of 5-bromo-2'-deoxyuridine pharmacokinetics in blood serum after intraperitoneal administration to rats and mice.</a> Histochemistry and Cell Biology. 142 (6), 703-712 (2014).</li><li>Von Bohlen Und Halbach, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistological+markers+for+proliferative+events,+gliogenesis,+and+neurogenesis+within+the+adult+hippocampus.">Immunohistological markers for proliferative events, gliogenesis, and neurogenesis within the adult hippocampus.</a> Cell and Tissue Research. 345 (1), 1-19 (2011).</li><li>Sage, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DeconvolutionLab2:+An+open-source+software+for+deconvolution+microscopy.">DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy.</a> Methods. 115, 28-41 (2017).</li><li>Manz, W., Arp, G., Schumann-Kindel, G., Szewzyk, U., Reitner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widefield+deconvolution+epifluorescence+microscopy+combined+with+fluorescence+in+situ+hybridization+reveals+the+spatial+arrangement+of+bacteria+in+sponge+tissue.">Widefield deconvolution epifluorescence microscopy combined with fluorescence in situ hybridization reveals the spatial arrangement of bacteria in sponge tissue.</a> Journal of Microbiological Methods. 40 (2), 125-134 (2000).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Abr&#224;moff, M. D., Magalh&#227;es, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+with+imageJ.">Image processing with imageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 36-41 (2004).</li><li>. 2D and 3D Fluorescence Deconvolution Manual Available from: <a target="_blank" href="https://pages.stolaf.edu/wp-content/uploads/sites/803/2016/12/Giannini_Giannini_Deconvolution_Manual_20161215.p">https://pages.stolaf.edu/wp-content/uploads/sites/803/2016/12/Giannini_Giannini_Deconvolution_Manual_20161215.p</a> (2016)</li><li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrdU+immunohistochemistry+for+studying+adult+neurogenesis:+Paradigms,+pitfalls,+limitations,+and+validation.">BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation.</a> Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).</li><li>Revilla, V., Jones, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryostat+sectioning+of+brains.">Cryostat sectioning of brains.</a> International Review of Neurobiology. 47, 61-70 (2002).</li><li>Amaral, D. G., Scharfman, H. E., Lavenex, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dentate+gyrus:+fundamental+neuroanatomical+organization+(dentate+gyrus+for+dummies).">The dentate gyrus: fundamental neuroanatomical organization (dentate gyrus for dummies).</a> Progress in brain research. 163, 3-22 (2007).</li><li>Eadie, B. D., Redila, V. A., Christie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voluntary+exercise+alters+the+cytoarchitecture+of+the+adult+dentate+gyrus+by+increasing+cellular+proliferation,+dendritic+complexity,+and+spine+density.">Voluntary exercise alters the cytoarchitecture of the adult dentate gyrus by increasing cellular proliferation, dendritic complexity, and spine density.</a> Journal of Comparative Neurology. 486 (1), 39-47 (2005).</li><li>Leal-Galicia, P., Romo-Parra, H., Rodr&#237;guez-Serrano, L. M., Buenrostro-J&#225;uregui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+adult+hippocampal+neurogenesis+exerted+by+sexual,+cognitive+and+physical+activity:+An+update.">Regulation of adult hippocampal neurogenesis exerted by sexual, cognitive and physical activity: An update.</a> Journal of Chemical Neuroanatomy. 101, 101667 (2019).</li><li>Gould, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+widespread+is+adult+neurogenesis+in+mammals.">How widespread is adult neurogenesis in mammals.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 481-488 (2007).</li><li>Ngwenya, L. B., Peters, A., Rosene, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+and+electron+microscopic+immunohistochemical+detection+of+bromodeoxyuridine-labeled+cells+in+the+brain:+Different+fixation+and+processing+protocols.">Light and electron microscopic immunohistochemical detection of bromodeoxyuridine-labeled cells in the brain: Different fixation and processing protocols.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (7), 821-832 (2005).</li><li>Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+and+multiple+labeling+with+antibodies+from+the+same+host+species+to+study+adult+hippocampal+neurogenesis.">Immunohistochemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52551 (2015).</li><li>Tuttle, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+detection+of+two+thymidine+analogues+(CldU+and+IdU)+in+primary+tissue.">Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (46), e2166 (2010).</li><li>Tischler, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple+immunohistochemical+staining+for+bromodeoxyuridine+and+catecholamine+biosynthetic+enzymes+using+microwave+antigen+retrieval.">Triple immunohistochemical staining for bromodeoxyuridine and catecholamine biosynthetic enzymes using microwave antigen retrieval.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 1-4 (1995).</li><li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+studying+adult+neurogenesis:+Insights+and+recent+developments.">Protocols for studying adult neurogenesis: Insights and recent developments.</a> Regenerative Medicine. 2 (1), 51-62 (2007).</li><li>Leuner, B., Glasper, E. R., Gould, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymidine+analog+methods+for+studies+of+adult+neurogenesis+are+not+equally+sensitive.">Thymidine analog methods for studies of adult neurogenesis are not equally sensitive.</a> Biosystems. 517 (2), 123-133 (2010).</li><li>Magavi, S. S., MacKlis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+newborn+cells+by+BrdU+labeling+and+immunocytochemistry+in+vivo.">Identification of newborn cells by BrdU labeling and immunocytochemistry in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 438, 335-343 (2008).</li><li>Kempermann, G., Gast, D., Kronenberg, G., Yamaguchi, M., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+determination+and+long-term+persistence+of+adult-generated+new+neurons+in+the+hippocampus+of+mice.">Early determination and long-term persistence of adult-generated new neurons in the hippocampus of mice.</a> Development. , 391-399 (2003).</li><li>Ramos-Vara, J. A., Beissenherz, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+immunohistochemical+methods+using+two+different+antigen+retrieval+methods+on+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues:+Experience+with+63+markers.">Optimization of immunohistochemical methods using two different antigen retrieval methods on formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: Experience with 63 markers.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 12 (4), 307-311 (2000).</li><li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+methods+of+immunohistochemistry.">Principles and methods of immunohistochemistry.</a> Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).</li><li>Wojtowicz, J. M., Kee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrdU+assay+for+neurogenesis+in+rodents.">BrdU assay for neurogenesis in rodents.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Voksen neurogenese er en proces, der forekommer hyppigst i nicher af voksne neurale forløberceller, der har potentiale til at generere nye neuroner gennem hele deres levetid. Bromodeoxyuridin (BrdU) mærkning er meget udbredt i immunologi til at karakterisere antallet af nygenererede celler i en voksen hjerne. BrdU vil hovedsageligt blive inkorporeret i celler i diskrete hjerneområder (neurogene zoner). Disse celler er placeret i den subventrikulære zone (SVZ), dentate gyrus i hippocampus - mellem hilus og granulære celler kendt som sub-granulær zone (SGZ) 1,2,18. Desuden er der forskellige hjerneområder præget af en lavere proliferativ kapacitet i voksenalderen, herunder hypothalamus, striatum, neocortex og amygdala19. Som tidligere nævnt er BrdU-farvning den almindeligt anvendte metode til forskning i neurogenese hos voksne til at detektere celleproliferation. Brugen af BrdU som markør har dog begrænsninger og faldgruber. Den første er, at BrdU er en cellecyklusmarkør. Derfor skal dobbelt eller tredobbelt farvning udføres for at identificere celleskæbnen og inkludere cellemarkører for at detektere det specifikke udviklingsstadium af de celler, der er mærket. En yderligere bekymring om BrdU er, at det er en giftig og mutagen opløsning, der ændrer DNA-stabilitet, kan ændre cellulær funktion og cellecyklusser. Der bør tages hensyn til de tidligere oplysninger, når det besluttes at følge en administrationsprotokol og administrationsdoser (50-600 mg/kg). Et andet afgørende træk er, at BrdU er en DNA-syntesemarkør, ikke en celleproliferationsmarkør14. Derfor er det relevant at skelne celleproliferation fra andre begivenheder såsom en DNA-reparation, abortiv cellecyklus genindtræden og genduplikering. Forskerne skal følge passende kontroller for at sikre korrekt anvendelse af BrdU. For en mere detaljeret diskussion om disse problemer og begrænsninger anbefaler vi at gennemgå Taupins arbejde14. Standardiseringsprocessen for en immunhistokemisk protokol kan være langsom og udfordrende. I dette arbejde har vi præsenteret alle de generelle trin til at styre en vellykket IHC-protokol. Vi anbefaler dog, at hver forskningsgruppe tester og evaluerer væv, antistoffer og tilstande på forhånd. Test og evalueringer skal udføres med mindst tre forskellige niveauer af inkubationer, vasketrin og styrker for hvert antistof og væv, der testes. Vi anbefaler også, at forskere gennemgår yderligere protokoller for at kunne vælge den bedste, der opfylder specifikke behov og krav 20,21,22,23,24,25.
Som tidligere nævnt involverer proceduren flere trin og metodiske overvejelser, der almindeligvis anvendes og nævnes i videnskabelige artikler, som senere vil blive diskuteret. Vi anbefaler, at forskerne vælger antistofferne omhyggeligt og korrekt med hensyn til teknik, budget, udstyr, opsætning og hovedforskningsmål. Antistoffer skal testes med samme type væv, som senere testes i forsøget. Vi anbefaler også brugen af et antistof, der blev testet til samme formål (IHC) (dvs. ikke kun i western blot eller flowcytometriteknikker) for at teste dets kompatibilitet med fikseringsteknikken. Forskellige veje kan anvendes til administration af BrdU-farvningen, såsom intraperitoneal injektion, intraperitoneal infusion, oral indtagelse eller intraventrikulær infusion (for en mere detaljeret beskrivelse af hver teknik, se reference26). Hvis den intraperitoneale injektion vælges, skal du sørge for, at BrdU administreres i bughulen og undgå tarmområdet. Da tarmen har flere celler i duplikering, der kan udtømme BrdU, før den kommer til hjernen, hvilket vil påvirke antallet af mærkede celler. Det er afgørende at få tynde sektioner, da de tillader en bedre penetration af løsninger. Koronale skiver på 40 μm tykke blev skåret rostro-kausalt og blev overført til en 24-brønds cellekulturplade efter den stereologiske procedure foreslået af Kempermann et al.27. Immunhistokemien kan udføres med væv monteret på dias eller som fritflydende sektioner. Da BrdU er placeret dybt i cellekerner, tillader det indtrængning af løsninger i fritflydende sektioner, hvilket giver bedre resultater og bedre adgang til interesseområdet. Det er vigtigt at åbne DNA-bindinger (DNA-denaturering) for at give adgang til det primære anti-BrdU-antistof. I dette arbejde udførte vi disse specifikke procedurer med brug af HCI-inkubation. På den anden side tillod processen med at blokere uspecifikke epitoper en mere præcis identifikation af cellesignal.
Den gode membranpermeabilisering gør det muligt for antistofferne at trænge korrekt ind i interesseområdet. Tilføjelse af en permeabilizer som Triton X-100 til PBS ++ og PBS + opløsninger forbedrer membranpermeabilisering. Både PBS og Tris-bufret saltvand (TBS) reagenser kan anvendes i denne protokol. Med hensyn til budget kunne TBS være relativitet billigere end PBS. PBS kan imidlertid interferere med antiphosphatantistoffer og hæmme alkaliske fosfatasekonjugerede antistoffer, så undgå brug af PBS, hvis målet er posttranslationelt modificeret ved phosphorylering (dvs. phosphoryleret). Vi brugte PBS til dette arbejde, og vi fandt ud af, at vævsvasketrin gav et mere specifikt signal. Vi anbefaler også forskere at udføre mindst tre vaskecyklusser ved hjælp af enten TBS o PBS. Opløsningerne skal være frisklavede. Antigenudtagning (AR) er en metode, der har til formål at reducere tabet af antigenicitet forårsaget af fikseringen, som ændrer strukturen af tertiære og kvaternære antigener. Denne reduktion gør antigener uopdagelige af antistoffer28,29. Den varmeinducerede epitophentning (HIER), der anvendes i denne protokol, forsøgte at vende de kemiske reaktioner mellem formaldehyd og proteiner ved høj temperatur eller stærk alkalisk hydrolyse (med andre bufferopløsninger som EDTA pH 8,5 eller Tris pH 9,5). Det er vigtigt at teste nye antistoffer med forskellige AR-protokoller for at sammenligne resultater og vælge den bedste til protokollen. Dette sidste trin kan være valgfrit i en almindelig protokol; Vi behandlede dog væv med en antigenhentningsprotokol for at give bedre resultater for denne protokol.
Det er afgørende at vælge den korrekte endelige kontrastfarve og modfarvningsteknikken under hensyntagen til den primære farvningsfarve og metode, der bruges til at gøre en ikke-farvningsstruktur synlig og undgå at maskere den primære farvningsfarve fra immunreaktionen. Til fluorescensmikroskopi er DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindol) en meget populær nuklear og kromosom-modplet, der udsender blå fluorescens (absorption: 360 nm, emission: 460 nm) ved binding til AT-regioner af DNA. DAPI-holdigt monteringsmedium er tilgængeligt og er let at bruge; Dette giver fremragende signalbevarelse til billedoptagelse. Til peroxidreaktionen var IHC tilgængelig i forskellige muligheder, såsom cresylviolet, hæmatoxylin, neutral rød eller methylgrøn farvning. For flere immunfarvningsteknikker er det afgørende at vælge et kompatibelt antistof med fikseringsteknikken, der bruges til at undgå krydsreaktivitet30. Når problemer og komplikationer med enkeltfarvning er løst, skal du administrere en anden farvefarvning efter behov. Det er afgørende at kontrollere den ikke-specifikke binding mellem de sekundære antistoffer. Dette kan gøres ved at mætte de primære antistoffer, før der anvendes et sekundært antistof produceret i samme værtsart af de primære antistoffer. For eksempel, når der anvendes anti-mus produceret i kanin og anti-kanin produceret i geder sekundære antistoffer, skal anti-kaninen produceret i gedeantistof anvendes før anti-mus produceret i kaninantistof. Når den sekventielle metode domineres fuldstændigt, kan den samtidige immunfarvningsproces initieres. I denne metode er det vigtigt at vælge sekundære antistoffer korrekt. Ideelt set skal alle disse antistoffer komme fra det samme værtsdyr for at undgå krydsreaktivitet. Vi anbefaler at køre en positiv kontrol for at bekræfte, at farvningsmetoden fungerer nøjagtigt i postnatal hippocampusvæv (rigelig neurogenese omkring denne alder). Hvis det positive kontrolvæv viser farvningsproblemer, skal du gennemgå og gennemgå proceduren, foretage korrektioner og justeringer og gentage, indtil der produceres en god farvning. Kør derefter en negativ kontrol for at teste, at antistoffet virker korrekt ved at udelade eller erstatte et bestemt primært antistof med normalt serum (samme art som det primære antistof). Som nævnt i indledningen er billeddekonvolution et kraftfuldt værktøj og giver et alternativ, når et konfokalmikroskop ikke er tilgængeligt. Det kan anvende billeddekonvolutionen på alle billeder, der er opnået ved hjælp af transmitteret lysfelt, vidvinkelfluorescens og konfokal fluorescensmikroskopi. Det ultimative formål med billeddekonvolution er at rekonstruere det oprindelige signal om, at erhvervelsessystemet forringes10.
Sammenfattende er identifikationen af de nyligt genererede celler visualiseret ved immunodetektion af thymidinanalog BrdU en kompliceret, men kraftfuld teknik. Dette arbejde er et forsøg på at hjælpe forskere, især inden for voksen hippocampal neurogenese, til at kvantificere nye celler mere præcist. Vi håber, at denne indsats har været nyttig for det videnskabelige samfund og gør det lettere at finjustere undersøgelsen af celleproliferation ved hjælp af immunhistokemiteknikken.

Ideen om, at nye neuroner genereres i den voksne menneskelige hjerne gennem hele levetiden, har fascineret det videnskabelige samfund i årtier. Den viden, at hjernen genererer nye neuroner gennem hele sin levetid, blev opnået gennem påvisning af celler under division 1,2. Påvisning af nygenererede neuroner i den voksne hjerne blev først identificeret ved intrakranielt injektion af tritieret thymidin (thymidin-H3) hos rotter og detektering af celler i cellecyklussen ved autoradiogrammer 1,2. Celledeling af glia og tilstedeværelsen af neuroblaster blev rapporteret, hvilket var de første lovende data om postnatal neurogenese1. Ikke desto mindre indebar brugen og påvisningen af thymidin-H3 brugen af radioaktivitet, hvilket kan være skadeligt for de mennesker, der styrer det. Den første indsats, der undersøgte egnetheden af BrdU-immunhistokemi i undersøgelsen af spredning, migration og oprindelse af celler i nervesystemet, optrådte i 1988 af Miller og Nowakowski3. I 1998 viste et papir udgivet af Eriksson og kolleger, at nye neuroner blev visualiseret postmortem i den menneskelige voksne hjerne hos patienter injiceret med 5-brom-2′-deoxyuridin (BrdU)4. Disse patienter fik BrdU-injektionen (250 mg intravenøst) for at mærke væksten af tumorer4. Denne teknik blev vedtaget i dyremodeller. Indførelsen af disse metoder markerede en milepæl for feltet, da dette tillod detektion af nygenererede celler uden brug af radioaktive forbindelser. Denne procedure blev guldstandarden til måling af celleproliferation i voksne hjernenicher for at fremme yderligere forskning på området.
Begrænsningen af thymidinanalogteknikken er, at den ikke tillader bestemmelse af cellulær identitet for de nygenererede celler. Imidlertid giver immunohistokemi os mulighed for at udføre dobbelt- eller tredobbelt mærkningsteknik for den samme celle, som validerer de nygenererede cellers cellulære skæbne og endda deres modningsstadier, hvilket fører til yderligere udvikling af feltet. Denne metode blev karakteriseret til at differentiere nygenererede celler til glia, udifferentierede neuroner eller en fuldt moden granulær celle og endda for at bestemme, om de deltager aktivt i kredsløbet. Et andet gennembrud på området var brugen af transgene modeller til at identificere udifferentierede celler under nestins domæne. De transgene nestin-GFP-mus udtrykker et forbedret grønt fluorescerende protein (GFP), som er under kontrol af nestinpromotoren. Nestin er et mellemliggende filament kendetegnet ved stamceller5. Nestin-GFP transgene mus tillod at etablere tidlige udviklingstrin involveret i neurogenese6. En væsentlig begrænsning er dog at kunne opretholde en nestin-GFP transgen musekoloni under særlige forhold i et laboratorium, der bliver omkostningseffektivt for nogle videnskabelige grupper, især dem fra udviklingslande.
De ovennævnte teknikker har fordele og ulemper. Imidlertid repræsenterer identifikation af prolifererende celler ved immunhistokemi (IHC) og muligheden for at udføre dobbelt- eller tredobbelt mærkningsteknik ved immunofluorescens for at identificere cellemodningsstadium eller celleskæbne den mest gennemførlige måde at måle voksen neurogenese på, indtil videre. Identifikationsprocessen ved hjælp af immunhistokemi består af mærkning af proteiner, proteindomæne eller nukleotider med et specifikt antistof, der tillader deres genkendelse kendt som primært antistof. Sidstnævnte genkendes af det sekundære antistof, som er markeret med et kromogen (fx peberrodsperoxidase) eller en fluorochrom (fx FITC) kombineret med det sekundære antistof. Mikroskoper kan detektere både kromogener og fluorkromer signaler. Ved hjælp af IHC er det muligt at identificere membranproteiner, cytoskeletproteiner eller nukleare komponenter såsom BrdU. På den anden side kan BrdU findes i den cellulære kerne, da den inkorporeres i DNA'et under S-fasen ved konkurrence. Derfor er et afgørende skridt DNA-denaturering med HCI, som åbner DNA-bindinger for at give BrdU-antistoffet adgang til BrdU i DNA'et. Det er vigtigt at vide, at BrdU er til stede i en mættet koncentration hos mus og rotteserum i henholdsvis 15 og 60 minutter efter intraperitoneal administration og derefter falder hurtigt til uopdagelige niveauer ved henholdsvis 60 og 120 minutter7.
Her beskriver vi fire forskellige, men nært beslægtede IHC-teknikker: kromogen indirekte detektion ved hjælp af peberrodsperoxidase (HRP) reaktion med DAB (3,3'-diaminobenzidin) sans signalamplifikation (trin 4.1), avidin-biotinkompleks (ABC) amplifikation (trin 4.1), indirekte immunofluorescensdetektion uden signalforstærkning (trin 4.4) og mærket streptavidin-biotin (LSAB) amplifikation (trin 4.3). Hver metode har fordele og ulemper og kan være nyttig til specifikke vævsbehov (se tabel 1). Vi besluttede at følge indirekte ICH-metoder på grund af deres overkommelige pris og enkelhed til at foretage ændringer fra kromogene til fluorescerende detektionsmetoder, når vi bruger ukonjugerede primære antistoffer. HRP-tilgangen er en almindeligt anvendt IHC-metode på grund af dens overkommelige pris, høje stabilitet, høje omsætningshastighed og substraters fulde tilgængelighed. Ikke desto mindre anbefaler vi at bruge en positiv kontrol til at bekræfte, at farvningsmetoden fungerer nøjagtigt, og brugen af negativ kontrol til at teste antistoffunktionen effektivt. Flere immunfarvninger eller multiplex IHC-metoder (se trin 6) er potente værktøjer til at erhverve store mængder data fra vævssektionen i et enkelt eksperiment. Denne teknik er særlig vigtig, når tilgængeligheden af prøver er begrænset. En anden fordel er muligheden for samtidig at identificere specifikke proteiner, der co-udtrykkes i det samme cellulære rum, samtidig med at vævsintegriteten bevares. Multiplex gør det muligt at plette forskellige markører udtrykt under specifikke proliferative stadier (f.eks. nestin, GFAP, DCX, Ki-67), hvilket gør det muligt for os at nå en mere detaljeret sprednings- og differentieringsforskning8. Det er afgørende at vælge antistoffer, der er kompatible med den fikseringsteknik, der bruges til at undgå krydsreaktivitet. Vi anbefaler at teste hvert nyt antistof (inklusive BrdU) individuelt for at justere og forfine metoden. Indfør derefter den dobbelte sekventielle farvning, og start til sidst den samtidige immunfarvningsproces, når den sekventielle metode domineres fuldstændigt. Det er afgørende at vælge passende sekundære antistoffer til denne metode.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Metode</td>
			<td>Specifik metode</td>
			<td>Fordele</td>
			<td>Ulemper</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Indirekte detektionsmetode</td>
			<td>Peroxidasereaktion med DAB</td>
			<td>1. Højere følsomhed end metoden med direkte detektion og indirekte fluorescens. 2. Højere modstandsdygtighed over for fotoblegning end fluorkromer. 3. Lavere omkostninger end fluorescensdetektionsmetode</td>
			<td>1. Vanskeligt for Multiplexing med færre farvefarvestoffer. 2. Kompliceret for Co-udtrykte mål i samme cellulære rum. 3. Reduceret dynamisk område for samtidige knappe og høje rigelige mål på det samme væv.</td>
		</tr><tr><td>Fluorescens</td>
			<td>1. Bedst og nemmest til Multiplexing med flere farvefarvestoffer. 2. Bedst til Co-udtrykte mål i det samme cellulære rum. 3. Bedre dynamisk område for samtidige knappe og høje rigelige mål på det samme væv. 4. Ingen yderligere trin.</td>
			<td>1. Lavere følsomhed end den indirekte peroxidasereaktion med DAB-metoden. 2. Svag modstand mod fotoblegning over tid. 3. Dyrere.</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Signalforstærkningsmetode</td>
			<td>Avidin-Biotin-kompleks (ABC)</td>
			<td>1. Højere følsomhed end den direkte og indirekte detektionsmetode. 2. Reducer baggrunden</td>
			<td>1. Yderligere trin. 2. Dyrere end ikke forstærkning.</td>
		</tr><tr><td>Mærket streptavidin-biotin (LSAB)</td>
			<td>1. Højere følsomhed end den direkte og indirekte detektionsmetode. 2. Mere omfattende vævspenetration end ABC-metoden. 3. Reducer baggrunden</td>
			<td>1. Yderligere trin. 2. Dyrere end ABC-metoden.</td>
		</tr><tr><td>Ikke yderligere forstærkningsmetode</td>
			<td>1. Lavere omkostninger. 2. Ingen yderligere trin. 3. Ideel til høje rigelige mål.</td>
			<td>1. Lavere følsomhed: problematisk uden rigelige mål.</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Fordele/ulemper ved IHC-teknikker. Denne tabel viser fordele/ulemper ved indirekte detektionsmetoder: peroxidasereaktion med (3,3'-diaminobenzidin) DAB og fluorescens; og signalforstærkningsmetoder: avidin-biotinkompleks (ABC), mærket streptavidin-biotin (LSAB) og ikke yderligere amplifikationsmetode.
Et billede i høj opløsning er grundlæggende for at udføre korrekt analyse og præsentere resultaterne. Der er to tilgange til at forbedre opløsningen: 1) brug af et bedre mikroskopdesign (f.eks. Konfokal, multifoton) eller 2) numerisk invertering af sløringsprocessen for at forbedre billeder ved hjælp af dekonvolution9. Desværre er konfokalmikroskopi ikke overkommelig på grund af de høje omkostninger ved udstyr og dets service10. Et vidvinkelepifluorescensmikroskop og den efterfølgende dekonvolution af z-stack-billederne giver et passende, billigt alternativ til konfokalmikroskopi 8,9. Som nævnt ovenfor er dekonvolutionsmålet at gendanne det originale signal, der blev nedbrudt af erhvervelsessystemet9, ved at reducere sløring, uklar tåge og forvrængning vist på billedet opnået ved hjælp af et epifluorescens eller konfokalmikroskop ved hjælp af matematiske fjernelsesalgoritmer10. Det erhvervede slørede billede kan matematisk modelleres som et resultat af at vikle de observerede objekter med en 3D-punktspredningsfunktion (PSF). PSF er et teoretisk diffraktionsmønster af de lyspunkter, der udsendes af vævsprøven og opsamles af mikroskopet. PSF-fil oprettes med de specifikke betingelser for hvert billede, såsom kameraets CCD-celleafstand, brydningsindeks for det anvendte medie, objektivobjektivets numeriske blænde, fluoroforens emissionsbølgelængde, billedstørrelser, antal billeder i z-stack-behandlingsmetoden og mellemrummet mellem dem (se teknisk specifikation i tabel 2). Med andre ord opsummerer PSF-filen virkningerne af billeddannelsesopsætningen på mikroskopobservationerne9. Vi bruger dog diffraktions PSF 3D Plugin (https://imagej.net/Diffraction_PSF_3D) til at oprette vores egen specifikke PSF-fil til hvert z-stack-billede. Z-stack-billeder er en række digitaliserede optiske sektioner fra definerede dybder (z-akse) på samme XY-placering som diaset. En computer kompilerer de oplysninger, der opnås fra fokusplanet, ved at omfordele signaler, der stammer fra objekter placeret i andre brændplaner. For at oprette z-stack-billeder er det nødvendigt at tage billeder fra forskellige fokuserede lag af diasene (f.eks. ti forskellige billeder af det samme XY-område hver 1 μm dybde). Derefter bruger vi mikroskopisoftware leveret af producenten eller Fiji til at oprette et z-stack eller 3D-billede. Resultatet bliver en enkelt stakbilledfil (f.eks. ti billeder med forskellige fokus). Der er flere kundespecifikke værktøjer og softwareløsninger, såsom open source-software til dekonvolutionsmikroskopi. Vi viser outputtene fra dekonvolutionsprocessen ved hjælp af DeconvolutionLab29, som er et Fiji11-plugin (distribution af ImageJ12). Dekonvolution vil bidrage til at forbedre opløsningen af endelige mikrografier (se figur 1B, C ). For yderligere information og instruktion anbefaler vi kraftigt at læse reference13.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig01.jpg"> Figur 1: Repræsentativt billede af 3D-dekonvolution for flere farvekanaler. (A) GD med lav forstørrelse. (B) De originale z-stack-billeder for hver kanal og det flettede billede. (C) 3D-deconvoluted z-stack-billeder for hver kanal og det flettede billede. Denne hjerne var fra rotten, der var en del af fysisk aktivitetsgruppe. Mærket streptavidin-biotin (LSAB) amplifikationsmetode blev anvendt. Det viste Cy3 streptavidin konjugeret antistof til angivelse af BrdU (rød), DAPI som modfarvning (blå) og glial fibrillær sur protein (GFAP) som en astroglial markør (grøn). ML = molekylært lag; GCL = granulært cellelag; SGZ = subgranulær zone. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Formålet med dette arbejde er at give en detaljeret beskrivelse af trinene til at opnå positive og vellykkede resultater med immunfarvning og at liste almindeligt anvendte trin i BrdU-baserede studier uden brug af et konfokalmikroskop. BrdU-farvning er en teknik, der kræver flere trin, der skal følges nøje for at opnå en vellykket plet. Standardisering af disse farvningsteknikker tager typisk måneder og er tids- og ressourcekrævende. Vi forventede, at denne artikel kunne give oplysninger til de grupper, der starter inden for dette område, ved at reducere tid og fejl.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENT PREPARATION AND SETUP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donor Horse Serum</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>S0900</td>
			<td>Blocking and incubation solutions in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde reagent grade, crystalline (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>toxic, flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746436-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, monobasic</td>
			<td>J.T Bker</td>
			<td>3246-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sacarose</td>
			<td>J.T Baker</td>
			<td>4072-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Meyer</td>
			<td>2365-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td>Corrisive, to calibrate pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phophate Dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9763-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-x 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THYMIDINE ANALOGUE BRDU ADMINISTRATION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Bromo-2&#8242;-deoxyuridine, BrdU</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9285</td>
			<td>toxic (mutagenic, teratogenic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23&#8211;27G hypodermic needle</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution</td>
			<td>PiSA</td>
			<td>30130032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 1 mL</td>
			<td>NIPRO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TISSUE PREPARATION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-ml polypropylene conical tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-ml polypropylene conical tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guillotine</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome Cryostat</td>
			<td>MICROM</td>
			<td>HM525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netwell 15 mm polyester mesh membrane inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3477</td>
			<td>pre-loaded in 12-well culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netwell plastic 12-well carrier kit</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3520</td>
			<td>for 15 mm polyester mesh membrane inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netwell plastic 6-well carrier kit</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>7553-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>IKA</td>
			<td>ROKCER 3D Digital</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMMUNOSTAINING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td>1%, Light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit (with Nickel), 3,3&#8217;-diaminobenzidine</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>carcinogenic, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydochloric Acid</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>9535-05</td>
			<td>Corrosive, to calibrate pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide, 50%</td>
			<td>Meyer</td>
			<td>5375-1L</td>
			<td>Toxic, oxidative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASTAIN&#174; Elite&#174; ABC Kit Peroxidase (HRP)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td>enzymatic, avidin/biotin based amplification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HPA056030</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-BrdU antibody produced in Mouse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2531</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-065-151</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, HRP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>G-21040</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG (whole molecule), TRITC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5393</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed, FITC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F-2765</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Cy3</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SA-1300</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAGING AND ANALYSIS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell Computer Company</td>
			<td>T8P8T-7G8MR-4YPQV-96C2F-7THHB</td>
			<td>For controlling and monitoring protocols&#8217; processes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD-camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UC50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSens Standard software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>cellSens Standard Edition</td>
			<td>Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-pressure 130 W mercury arc lamp</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-HGLGPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low autofluorescence immersion oil</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MOIL-30 Type F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover-glasses (VWR, cat no 48404 454; 24&#160; 60 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (VWR, cat no 48323-185; 76&#160; 26 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-FBW filter cube</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-FBW</td>
			<td>excitation 460 - 495 nm, dichroic mirror 505 nm, suppression 510 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-FGW filter cube</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-FGW</td>
			<td>excitation 530 - 550 nm, dichroic mirror 570 nm, suppression 575 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-FUW filter cube</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-FUW</td>
			<td>excitation 340 - 490 nm, dichroic mirror 410 nm, suppression 420 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemistry techniques to analyze cellular proliferation and neurogenesis in rats using the thymidine analog brdu

En af de vigtigste ting inden for voksen hippocampus neurogenese (AHN) er identifikationen af de nyligt genererede celler. Immunodetektion af thymidinanaloger (såsom 5-brom-2'-deoxyuridin (BrdU)) er en standardteknik, der anvendes til visualisering af disse nygenererede celler. Derfor injiceres BrdU normalt i små dyr intraperitonealt, så thymidinanalogen bliver inkorporeret i delende celler under DNA-syntese. Detektion udføres ved immunohistokemisk analyse af hjerneskiver. Hver forskergruppe, der har brugt denne teknik, kan forstå, at det kræver særlig opmærksomhed på små detaljer for at opnå en vellykket plet. For eksempel er et vigtigt skridt DNA-denaturering med HCI, som gør det muligt at nå cellekernen for at plette den. De eksisterende videnskabelige rapporter beskriver imidlertid meget få af sådanne trin i detaljer. Derfor er standardisering af teknikken udfordrende for nye laboratorier, da det kan tage flere måneder at give positive og vellykkede resultater. Formålet med dette arbejde er at beskrive og uddybe trinene for at opnå positive og vellykkede resultater af immunfarvningsteknikken i detaljer, når man arbejder med thymidinanalogen BrdU. Protokollen inkluderer reagensforberedelse og opsætning, administration af thymidinanalog i en gnaver, transkardieperfusion, vævspræparation, peroxidase immunohistokemisk reaktion, anvendelse af avidin-biotinkompleks, immunofluorescens, modfarvning, mikroskopibilleddannelse og celleanalyse.

De ovenfor beskrevne metoder blev anvendt til at kvantificere nyfødte celler i voksne rotter hippocampus efter frivillig fysisk aktivitet, i modsætning til en kontrolgruppe uden ekstra fysisk aktivitet. Vi brugte den postnatale rottehippocampus som en positiv kontrol. Hanrotter på 3 måneder var under en frivillig fysisk aktivitetsprotokol (endeløst hjul) i syv dage. På dag 6 blev rotter injiceret med BrdU (sektion 2) og hver 12. time derefter indtil tre komplette injektioner. For at fuldføre tre cellecyklusdelinger blev dyrene transkardialt perfunderet (afsnit 3) 8 timer efter den sidste BrdU-injektion. Den samme procedure blev anvendt på tre måneder gamle rotter, som ikke gennemgik fysisk aktivitet, for at blive brugt som en sammenlignende kontrol. Som en positiv kontrol blev en dag gamle rotteunger (postnatal dag 1) injiceret med BrdU én gang, som beskrevet i punkt 2 ovenfor. En dag efter injektionen (postnatal dag 2) blev hvalpe aflivet, og deres hoveder blev nedsænket i PFA-opløsning, som beskrevet i trin 3.4. Voksne rotter blev dybt bedøvet (trin 3.1), transkardielt perfuserede, som beskrevet i trin 3.2. Hjerner blev dissekeret og postfikseret (trin 3.4). Hjerner blev skåret i 40 μm koronale sektioner (trin 3.5). Afsnit blev behandlet for BrdU-immunhistokemi, som beskrevet i trin 4.
Vi brugte peberrodsperoxidasereaktion med DAB IHC til farvning (trin 4.1) og tælling af BrdU-positive celler i DG. Figur 5 viser et DG-afsnit med BrdU-mærkede celler. Figur 5C,D viser en repræsentativ del af GD-sektionen ved højere forstørrelse. Mærkede celler viste intens mørk farvning, som var markeret med pile. Indsatsen viser det gennemsnitlige antal mærkede celler i forsøgs- og kontrolgrupperne (tællede positive celler ganget med seks som beskrevet i trin 8.1). En studerendes t-test afslørede signifikansforskelle mellem antallet af BrdU-positive celler (t (10) = 2,704, p = 0,0222). Kontrolgruppen, der ikke gennemgik fysisk aktivitet, viste 2.040 ± 314 celler (n = 6 rotter). Til sammenligning viste den fysiske aktivitetsgruppe i gennemsnit 3.606 ± 486 (n = 6 rotter) BrdU-positive celler. Som observeret øger eksponering for fysisk aktivitet BrdU-positive celler. Derfor er disse resultater i overensstemmelse med andre rapporterede resultater, der viser, at fysisk aktivitet øgede cellulær proliferation i voksen dentate gyrus17.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig03.jpg"> Figur 3: Eksempler på forskellig morfologi af BrdU-mærket cellekerne. BrdU er en DNA-syntesemarkør, der mærker kernen. I hippocampus-regionen havde de BrdU-positive kerner en halvoval form placeret i dentate gyrus sub-granulære zone. Da BrdU er inkorporeret ved konkurrence, vil mængden inkorporeret for hver celle have en variation, der senere vil blive afspejlet i, hvordan kernen visualiseres. (A) Immunofluorescensbillede. (B) Et billede, der anvender peroxidasereaktion uden en yderligere forstærkningsmetode, præsenteres. Gule pile viser artefakter og ikke-specifikke signaler. Sorte eller hvide pile viser BrdU+ celler. 1 - Fuldt arkiveret kerne, halvovale kerner stærkt farvede. 2 - Kerner med prikker, kanten af kernerne er markeret og har inde i flere prikker. 3 - Kerner med få prikker, kanten af kernerne er markeret og har et lille antal prikker indeni. 4 - Lille kerne er mulige celler i et andet differentieringstrin, men stadig en del af nichen. 5 – Klynger er forløberceller under deling, derfor kan der observeres flere celler sammen i kondenserede grupper. Inden for disse grupper skal tællingen udføres særligt omhyggeligt for at undgå fejlmærkning af positive celler. Røde pile viser kernen under opdeling, der kan forveksles til at være en enkelt celle. Hver celle er indesluttet i en kasse og kan skelnes i et Z-akseplan i realtid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig04.jpg"> Figur 4: Repræsentativt RGB-billede for enkelte og flettede kanaler. Det øverste billede viser det originale z-stack-billede, og det nederste billede viser det 3D-deconvoluted z-stack-billede. (A) Lav forstørrelse af GD'et. (B) RGB-billede for hver kanal og (C) RGB-flettet billede. Dette var en hjerne fra kontrolgruppen. Immunofluorescens blev anvendt uden en yderligere amplifikationsmetode. BrdU (rød), DAPI som modfarvning (blå) og GFAP (gliafibrillært surt protein) som astroglial markør (grøn). ML = molekylært lag; GCL = granulært cellelag; SGZ = subgranulær zone. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig05.jpg"> Figur 5: Repræsentativt GD-afsnit med BrdU-mærkede celler (intens mørk) for hver forsøgsgruppe. Peroxidasereaktionen blev anvendt med avidin-biotin-peroxidasekompleksamplifikationsmetoden. (A, B) Vis en lav forstørrelse af DG, og (C, D) vis boksområdet ved højere forstørrelse. Panelerne A og C er væv fra den fysiske aktivitetsgruppe, panelerne B og D er fra kontrolgruppen. Indsatsen viser det gennemsnitlige antal mærkede celler i fysisk aktivitet og kontrolgrupperne (tællede positive celler ganget med seks som beskrevet i trin 8.1). ML = molekylært lag; GCL = granulært cellelag; SGZ = subgranulær zone; pile angiver BrdU+ celler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Video 1: Video, der viser et andet fokus af positive celler langs z-aksen fordelt i forskellige lag. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61483/VIDEO_1.avi" target="_blank">Klik her for at downloade denne video.</a>
Video 2: Video, der viser et andet fokus af positive celleklynger langs z-aksen fordelt i forskellige lag. Bevæg dig langsomt over z-aksen for at kvantificere alle flere kerner, der integrerer en klynge. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61483/VIDEO_2.mp4" target="_blank">Klik her for at downloade denne video.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Mikroskop Type:</td>
			<td colspan="5">Epifluorescens mikroskop Olympus BX53</td>
		</tr><tr><td>Lyskilde:</td>
			<td colspan="5">Højtrykslampe 130 W kviksølvbue (U-HGLGPS)</td>
		</tr><tr><td>Software til anskaffelse:</td>
			<td colspan="5">CellSens Standard</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Filtre sæt:</td>
			<td colspan="2">Katalognummer</td>
			<td>Excitation rækkevidde</td>
			<td>Dikromatisk spejl</td>
			<td>Undertrykkelsesområde</td>
		</tr><tr><td colspan="2">U-FUW</td>
			<td>340 - 490 nm</td>
			<td>410 nm</td>
			<td>420 nm</td>
		</tr><tr><td colspan="2">U-FBW</td>
			<td>460 - 495 nm</td>
			<td>505 nm</td>
			<td>510 nm</td>
		</tr><tr><td colspan="2">U-FGW</td>
			<td>530 - 550 nm</td>
			<td>570 nm</td>
			<td>575 nm</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Kamera:</td>
			<td colspan="2">Model:</td>
			<td colspan="3">CCD-kamera UC50</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Spektral rækkevidde:</td>
			<td colspan="3">290 – 1000 nm</td>
		</tr><tr><td colspan="2">CCD chip størrelse:</td>
			<td colspan="3">2/3 tommer, 2588 (bredde *7) x 1960 (højde *8) pixels</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Pixelstørrelse:</td>
			<td colspan="3">3,4 X 3,4 μm</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">Fluorochrom:</td>
			<td colspan="2">Navn</td>
			<td>Excitation bølgelængde (nm)</td>
			<td>Emission *3 bølgelængde (nm)</td>
			<td>Emission farve</td>
		</tr><tr><td colspan="2">4, 6-diamidino-2-phenyl-indol HCI (DAPI)</td>
			<td>345</td>
			<td>455</td>
			<td>Blå</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Tetramethylrhodamin-isothyocyanat (TRITC)</td>
			<td>541</td>
			<td>572</td>
			<td>Rød</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Fluorescein-isothiocyanat (FITC)</td>
			<td>494</td>
			<td>519</td>
			<td>Grøn</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Cy3</td>
			<td>552</td>
			<td>565</td>
			<td>Rød</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">Monteringsmedium og nedsænkningsolie:</td>
			<td colspan="3">Navn</td>
			<td colspan="2">Indeks for refraktion af medierne *1</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Luft (intet mellem diaset og linsen)</td>
			<td colspan="2">1.00029</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Antifade monteringsmedium med DAPI</td>
			<td colspan="2">1.45</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Permount monteringsmedium</td>
			<td colspan="2">1.519</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Lav autofluorescens nedsænkningsolie (MOIL-30 Type F)</td>
			<td colspan="2">1.518</td>
		</tr><tr><td rowspan="6">Forstørrelsesglas (Plan-fluorit)</td>
			<td>Forstørrelse</td>
			<td>Numerisk blænde (NA) *2</td>
			<td>Opløsning (μm)</td>
			<td>Billedpixelafstand (nm) *5</td>
			<td>Udsnitsafstand Z-aksen (nm) *6</td>
		</tr><tr><td>4X</td>
			<td>0.13</td>
			<td>2.12</td>
			<td>850</td>
			<td>3000</td>
		</tr><tr><td>10X</td>
			<td>0.3</td>
			<td>0.92</td>
			<td>340</td>
			<td>3000</td>
		</tr><tr><td>20X</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.55</td>
			<td>170</td>
			<td>2000</td>
		</tr><tr><td>40X</td>
			<td>0.75</td>
			<td>0.37</td>
			<td>85</td>
			<td>1000</td>
		</tr><tr><td>100X</td>
			<td>1.3</td>
			<td>0.21</td>
			<td>34</td>
			<td>1000</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 2: Specifikationer for mikroskopopsætning og krav til oprettelse af PSF-filer (Point Spread Function). Der er 11 slots i diffraktions-PSF 3D-pluginvinduet til oprettelse af PSF-filen. Hver plads beskrives som følger: *1 - Indeks for mediets brydning: brydningsindeks for mediet mellem diaset og objektivet (f.eks. luft = 1,00029). *2 - Numerisk blænde: NA for det anvendte objektiv (det skal rettes, når der bruges et andet nedsænkningsmedie, og objektivet blev tildelt). *3 - Bølgelængde: Fluorochrome maksimal emissionsbølgelængde (nm). *4 - Langsgående sfærisk aberration: 0,00. *5 - Billedpixelafstand: CCD-pixelstørrelse (nm)/forstørrelse (f.eks. 3,4 μm og 100X objektiv, 3400/100 = 34 nm). *6 - Afstand mellem billeder Z-akse. *7 - Bredde: Indtast bredden på det billede, der skal dekonvoleres i pixels. *8 - Højde: Indtast højden på det billede, der skal dekonvoleres i pixels. *9 - Dybde, udsnit: Antallet af billeder i z-stakken. *10 - Normalisering: Summen af pixelværdier = 1. *11 - Titel: Det ønskede navn til PSF-filen. Filen skal matche det unikke givne z-stack-billede.

Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemistry Techniques to Analyze Cellular Proliferation and Neurogenesis in Rats Using the Thymidine Analog BrdU at JoVE.com

Immunohistochemistry Techniques to Analyze Cellular Proliferation and Neurogenesis in Rats Using the Thymidine Analog BrdU

Dette papir præsenterer fire af de mest almindelige teknikker til visualisering af BrdU-positive celler til måling af voksen neurogenese hos rotter. Dette arbejde omfatter instruktioner til reagensforberedelse, thymidinanalog administration, transkardieperfusion, vævspræparation, peroxidase immunohistokemisk reaktion, immunofluorescens, signalforstærkning, modfarvning, mikroskopibilleddannelse og celleanalyse.

Immunohistokemiske teknikker til analyse af cellulær proliferation og neurogenese hos rotter ved hjælp af thymidinanalogen BrdU

One of the most important things in the field of adult hippocampal neurogenesis (AHN) is the identification of the newly generated cells. The ...

Research

JoVE Journal

Biology

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Undersøgelse af proteiner bundet til Nascent DNA i pattedyrceller Brug BrdU-chip-slot-vestlige Teknik

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Brug mikrofluidenheder til måling Levetid og cellefænotyper i Single Spirende gærceller

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

Teknikker til at fremkalde og kvantificere cellesenescens

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

Enkel og effektiv Administration og visualisering af mikropartikler i kredsløbet af små fisk ved hjælp af nyre injektion

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...