Name: immunohistochemistry techniques to analyze cellular proliferation and neurogenesis in rats using the thymidine analog brdu
Uploaded: 2020-09-09T14:30:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemistry Techniques to Analyze Cellular Proliferation and Neurogenesis in Rats Using the Thymidine Analog BrdU at JoVE.com

We willen de heer Miguel Burgos en Gustavo Lago bedanken voor het verlenen van technische assistentie. We willen ook Dr. Clorinda Arias, Dr. Karla Hernandez en Dr. Oscar Galicia bedanken voor hun vriendelijke steun bij het leveren van reagentia en materiaal. We bedanken ook División de Investigación y Posgrado van de Universidad Iberoamericana Ciudad de México voor het verstrekken van financiering voor de uitvoering van dit werk en voor het dekken van videoproductiekosten.

<ol>
	<li>Altman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+new+neurons+formed+in+the+brains+of+adult+mammals.">Are new neurons formed in the brains of adult mammals.</a> Science. 135 (3509), 1127-1128 (1962).</li><li>Altman, J., Das, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoradiographic+and+histological+evidence+of+postnatal+hippocampal+neurogenesis+in+rats.">Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats.</a> The Journal of Comparative Neurology. 124 (3), 319-335 (1965).</li><li>Miller, M. W., Nowakowski, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bromodeoxyuridine-immunohistochemistry+to+examine+the+proliferation,+migration+and+time+of+origin+of+cells+in+the+central+nervous+system.">Use of bromodeoxyuridine-immunohistochemistry to examine the proliferation, migration and time of origin of cells in the central nervous system.</a> Brain Research. 457 (1), 44-52 (1988).</li><li>Eriksson, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+adult+human+hippocampus.">Neurogenesis in the adult human hippocampus.</a> Nature Medicine. 4 (11), 1313-1317 (1998).</li><li>Filippov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpopulation+of+nestin-expressing+progenitor+cells+in+the+adult+murine+hippocampus+shows+electrophysiological+and+morphological+characteristics+of+astrocytes.">Subpopulation of nestin-expressing progenitor cells in the adult murine hippocampus shows electrophysiological and morphological characteristics of astrocytes.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 23 (3), 373-382 (2003).</li><li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus.">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends in Neurosciences. 27 (8), 447-452 (2004).</li><li>Matia&#353;ov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+determination+of+5-bromo-2'-deoxyuridine+pharmacokinetics+in+blood+serum+after+intraperitoneal+administration+to+rats+and+mice.">Flow cytometric determination of 5-bromo-2'-deoxyuridine pharmacokinetics in blood serum after intraperitoneal administration to rats and mice.</a> Histochemistry and Cell Biology. 142 (6), 703-712 (2014).</li><li>Von Bohlen Und Halbach, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistological+markers+for+proliferative+events,+gliogenesis,+and+neurogenesis+within+the+adult+hippocampus.">Immunohistological markers for proliferative events, gliogenesis, and neurogenesis within the adult hippocampus.</a> Cell and Tissue Research. 345 (1), 1-19 (2011).</li><li>Sage, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DeconvolutionLab2:+An+open-source+software+for+deconvolution+microscopy.">DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy.</a> Methods. 115, 28-41 (2017).</li><li>Manz, W., Arp, G., Schumann-Kindel, G., Szewzyk, U., Reitner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widefield+deconvolution+epifluorescence+microscopy+combined+with+fluorescence+in+situ+hybridization+reveals+the+spatial+arrangement+of+bacteria+in+sponge+tissue.">Widefield deconvolution epifluorescence microscopy combined with fluorescence in situ hybridization reveals the spatial arrangement of bacteria in sponge tissue.</a> Journal of Microbiological Methods. 40 (2), 125-134 (2000).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Abr&#224;moff, M. D., Magalh&#227;es, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+with+imageJ.">Image processing with imageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 36-41 (2004).</li><li>. 2D and 3D Fluorescence Deconvolution Manual Available from: <a target="_blank" href="https://pages.stolaf.edu/wp-content/uploads/sites/803/2016/12/Giannini_Giannini_Deconvolution_Manual_20161215.p">https://pages.stolaf.edu/wp-content/uploads/sites/803/2016/12/Giannini_Giannini_Deconvolution_Manual_20161215.p</a> (2016)</li><li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrdU+immunohistochemistry+for+studying+adult+neurogenesis:+Paradigms,+pitfalls,+limitations,+and+validation.">BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation.</a> Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).</li><li>Revilla, V., Jones, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryostat+sectioning+of+brains.">Cryostat sectioning of brains.</a> International Review of Neurobiology. 47, 61-70 (2002).</li><li>Amaral, D. G., Scharfman, H. E., Lavenex, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dentate+gyrus:+fundamental+neuroanatomical+organization+(dentate+gyrus+for+dummies).">The dentate gyrus: fundamental neuroanatomical organization (dentate gyrus for dummies).</a> Progress in brain research. 163, 3-22 (2007).</li><li>Eadie, B. D., Redila, V. A., Christie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voluntary+exercise+alters+the+cytoarchitecture+of+the+adult+dentate+gyrus+by+increasing+cellular+proliferation,+dendritic+complexity,+and+spine+density.">Voluntary exercise alters the cytoarchitecture of the adult dentate gyrus by increasing cellular proliferation, dendritic complexity, and spine density.</a> Journal of Comparative Neurology. 486 (1), 39-47 (2005).</li><li>Leal-Galicia, P., Romo-Parra, H., Rodr&#237;guez-Serrano, L. M., Buenrostro-J&#225;uregui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+adult+hippocampal+neurogenesis+exerted+by+sexual,+cognitive+and+physical+activity:+An+update.">Regulation of adult hippocampal neurogenesis exerted by sexual, cognitive and physical activity: An update.</a> Journal of Chemical Neuroanatomy. 101, 101667 (2019).</li><li>Gould, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+widespread+is+adult+neurogenesis+in+mammals.">How widespread is adult neurogenesis in mammals.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 481-488 (2007).</li><li>Ngwenya, L. B., Peters, A., Rosene, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+and+electron+microscopic+immunohistochemical+detection+of+bromodeoxyuridine-labeled+cells+in+the+brain:+Different+fixation+and+processing+protocols.">Light and electron microscopic immunohistochemical detection of bromodeoxyuridine-labeled cells in the brain: Different fixation and processing protocols.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (7), 821-832 (2005).</li><li>Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+and+multiple+labeling+with+antibodies+from+the+same+host+species+to+study+adult+hippocampal+neurogenesis.">Immunohistochemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52551 (2015).</li><li>Tuttle, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+detection+of+two+thymidine+analogues+(CldU+and+IdU)+in+primary+tissue.">Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (46), e2166 (2010).</li><li>Tischler, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple+immunohistochemical+staining+for+bromodeoxyuridine+and+catecholamine+biosynthetic+enzymes+using+microwave+antigen+retrieval.">Triple immunohistochemical staining for bromodeoxyuridine and catecholamine biosynthetic enzymes using microwave antigen retrieval.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 1-4 (1995).</li><li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+studying+adult+neurogenesis:+Insights+and+recent+developments.">Protocols for studying adult neurogenesis: Insights and recent developments.</a> Regenerative Medicine. 2 (1), 51-62 (2007).</li><li>Leuner, B., Glasper, E. R., Gould, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymidine+analog+methods+for+studies+of+adult+neurogenesis+are+not+equally+sensitive.">Thymidine analog methods for studies of adult neurogenesis are not equally sensitive.</a> Biosystems. 517 (2), 123-133 (2010).</li><li>Magavi, S. S., MacKlis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+newborn+cells+by+BrdU+labeling+and+immunocytochemistry+in+vivo.">Identification of newborn cells by BrdU labeling and immunocytochemistry in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 438, 335-343 (2008).</li><li>Kempermann, G., Gast, D., Kronenberg, G., Yamaguchi, M., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+determination+and+long-term+persistence+of+adult-generated+new+neurons+in+the+hippocampus+of+mice.">Early determination and long-term persistence of adult-generated new neurons in the hippocampus of mice.</a> Development. , 391-399 (2003).</li><li>Ramos-Vara, J. A., Beissenherz, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+immunohistochemical+methods+using+two+different+antigen+retrieval+methods+on+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues:+Experience+with+63+markers.">Optimization of immunohistochemical methods using two different antigen retrieval methods on formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: Experience with 63 markers.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 12 (4), 307-311 (2000).</li><li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+methods+of+immunohistochemistry.">Principles and methods of immunohistochemistry.</a> Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).</li><li>Wojtowicz, J. M., Kee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrdU+assay+for+neurogenesis+in+rodents.">BrdU assay for neurogenesis in rodents.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Volwassen neurogenese is een proces dat het vaakst voorkomt in niches van volwassen neurale voorlopercellen die het potentieel hebben om nieuwe neuronen te genereren gedurende hun hele levensduur. Bromodeoxyuridine (BrdU) labeling wordt veel gebruikt in de immunologie om het aantal nieuw gegenereerde cellen in een volwassen brein te karakteriseren. BrdU zal voornamelijk worden opgenomen in cellen van discrete hersengebieden (neurogene zones). Deze cellen bevinden zich in de subventrikelzone (SVZ), de gyrus dentate van de hippocampus - tussen de hilus en granulaire cellen die bekend staan als subgranulaire zone (SGZ)1,2,18. Bovendien zijn er verschillende hersengebieden die worden gekenmerkt door een lagere proliferatieve capaciteit op volwassen leeftijd, waaronder de hypothalamus, striatum, neocortex en amygdala19. Zoals eerder vermeld, is BrdU-kleuring de veelgebruikte methode voor onderzoek naar neurogenese bij volwassenen om celproliferatie te detecteren. Het gebruik van BrdU als marker heeft echter beperkingen en valkuilen. De eerste is dat BrdU een celcyclusmarker is. Daarom moet dubbele of drievoudige kleuring worden uitgevoerd om het lot van de cel te identificeren en celmarkers bevatten om het specifieke ontwikkelingsstadium van de gelabelde cellen te detecteren. Nog een zorg over BrdU is dat het een toxische en mutagene oplossing is die de DNA-stabiliteit wijzigt en de cellulaire functie en celcycli kan veranderen. Rekening moet worden gehouden met de eerdere informatie bij het besluit om een toedieningsprotocol en toedieningsdoses (50 \u2012600 mg / kg) te volgen. Een ander cruciaal kenmerk is dat BrdU een DNA-synthesemarker is, geen celproliferatiemarker14. Daarom is het relevant om celproliferatie te onderscheiden van andere gebeurtenissen zoals een DNA-reparatie, abortieve celcyclusherinvoering en genduplicatie. Onderzoekers moeten passende controles volgen om het juiste gebruik van BrdU te garanderen. Voor een meer gedetailleerde discussie over deze problemen en beperkingen, raden we aan het werk van Taupinte bekijken 14. Het standaardisatieproces van een immunohistochemisch protocol kan traag en uitdagend zijn. In dit werk hebben we alle algemene stappen gepresenteerd om een succesvol IHC-protocol te beheren. We raden echter aan dat elke onderzoeksgroep weefsel, antilichamen en aandoeningen van tevoren test en evalueert. Tests en evaluaties moeten worden uitgevoerd met ten minste drie verschillende niveaus van incubaties, wasstappen en sterktes voor elk getest antilichaam en weefsel. We raden onderzoekers ook aan om aanvullende protocollen te bekijken om de beste te kunnen kiezen die voldoet aan specifieke behoeften en vereisten 20,21,22,23,24,25.
Zoals eerder vermeld, omvat de procedure verschillende stappen en methodologische overwegingen die vaak worden gebruikt en genoemd in wetenschappelijke artikelen, die later zullen worden besproken. We raden onderzoekers aan om de antilichamen zorgvuldig en correct te kiezen in termen van techniek, budget, apparatuur, opstelling en hoofddoel van het onderzoek. Antilichamen moeten worden getest met hetzelfde type weefsel dat later in het experiment zal worden getest. We raden ook het gebruik aan van een antilichaam dat voor hetzelfde doel (IHC) is getest (d.w.z. niet alleen in western blot- of flowcytometrietechnieken) om de compatibiliteit met de fixatietechniek te testen. Verschillende routes kunnen worden gebruikt om de BrdU-kleuring toe te dienen, zoals intraperitoneale injectie, intraperitoneale infusie, orale inname of intraventriculaire infusie (voor een meer gedetailleerde beschrijving van elke techniek, zie referentie26). Als de intraperitoneale injectie is geselecteerd, zorg er dan voor dat BrdU wordt toegediend in de peritoneale holte en vermijd het darmgebied. Omdat de darm verschillende cellen in duplicatie heeft die de BrdU kunnen uitputten voordat deze in de hersenen komt, wat het aantal gelabelde cellen zal beïnvloeden. Het is cruciaal om dunne secties te verkrijgen, omdat ze een betere penetratie van oplossingen mogelijk maken. Coronale plakjes van 40 μm dik werden rostro-caudally gesneden en werden overgebracht naar een 24-well celkweekplaat, volgens de stereologische procedure voorgesteld door Kempermann et al.27. De immunohistochemie kan worden uitgevoerd met weefsel gemonteerd op dia's of als vrij zwevende secties. Omdat BrdU zich diep in celkernen bevindt, maakt het de penetratie van oplossingen in vrij zwevende secties mogelijk, wat betere resultaten en betere toegang tot het interessegebied oplevert. Het is belangrijk om DNA-bindingen (DNA-denaturatie) te openen om de primaire anti-BrdU-antilichaamtoegang mogelijk te maken. In dit werk hebben we deze specifieke procedures uitgevoerd met behulp van HCI-incubatie. Aan de andere kant maakte het proces van het blokkeren van niet-specifieke epitopen een nauwkeurigere identificatie van het celsignaal mogelijk.
De goede membraanpermeabilisatie zorgt ervoor dat de antilichamen goed door het interessegebied kunnen dringen. Het toevoegen van een permeabilizer zoals Triton X-100 aan PBS++ en PBS+ oplossingen verbetert de membraanpermeabilisatie. Zowel PBS- als Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) reagentia kunnen in dit protocol worden gebruikt. Qua budget zou de TBS relativiteit goedkoper kunnen zijn dan de PBS. PBS kan echter interfereren met antifosfaatantistoffen en alkalische fosfatase-geconjugeerde antilichamen remmen, dus vermijd het gebruik van PBS als het doelwit posttranslationeel wordt gewijzigd door fosforylering (d.w.z. gefosforyleerd). We gebruikten de PBS voor dit werk en we kwamen erachter dat weefselwasstappen een specifieker signaal gaven. We raden onderzoekers ook aan om ten minste drie wascycli uit te voeren met behulp van TBS of PBS. De oplossingen moeten vers worden bereid. Antigeen retrieval (AR) is een methode die bedoeld is om het verlies van antigeniciteit te verminderen dat wordt veroorzaakt door de fixatie die de structuur van de tertiaire en quaternaire antigenen wijzigt. Deze reductie maakt antigenen niet detecteerbaar door antilichamen28,29. De warmte-geïnduceerde epitoop retrieval (HIER) die in dit protocol wordt gebruikt, probeerde de chemische reacties tussen formaldehyde en eiwitten om te keren door hoge temperatuur of sterke alkalische hydrolyse (met andere bufferoplossingen als EDTA pH 8,5 of Tris pH 9,5). Het is essentieel om nieuwe antilichamen met verschillende AR-protocollen te testen om de resultaten te vergelijken en de beste voor het protocol te kiezen. Deze laatste stap kan optioneel zijn in een regulier protocol; we hebben echter weefsels behandeld met een antigeen ophaalprotocol om betere resultaten voor dit protocol te bieden.
Het is cruciaal om de juiste uiteindelijke contrasterende kleur en de counterstain-techniek te selecteren met inachtneming van de primaire kleuringskleur en methode die wordt gebruikt om een niet-vlekkende structuur zichtbaar te maken en te voorkomen dat de primaire kleur van de immuunreactie wordt gemaskeerd. Voor de fluorescentiemicroscopie is de DAPI (4', 6-diamidino-2-fenylalandool) een zeer populaire nucleaire en chromosoomtellerstain die blauwe fluorescentie (absorptie: 360 nm, emissie: 460 nm) uitzendt bij binding aan AT-gebieden van DNA. DAPI-bevattend montagemedium is beschikbaar en is gemakkelijk te gebruiken; dit biedt uitstekende signaalretentie voor beeldacquisitie. Voor de peroxidereactie was IHC verkrijgbaar in verschillende opties, zoals cresylviolet, hematoxyline, neutrale rode of methylgroene kleuring. Voor meerdere immunostainingtechnieken is het cruciaal om een compatibel antilichaam te kiezen met de fixatietechniek die wordt gebruikt om kruisreactiviteit te voorkomen30. Wanneer problemen en complicaties met een enkele kleuring zijn opgelost, dient u een andere kleurkleuring toe als dit nodig wordt geacht. Het is cruciaal om de niet-specifieke binding tussen de secundaire antilichamen te controleren. Dit kan worden gedaan door de primaire antilichamen te verzadigen voordat een secundair antilichaam wordt gebruikt dat wordt geproduceerd in dezelfde gastheersoort van de primaire antilichamen. Bijvoorbeeld, bij het gebruik van anti-muis geproduceerd in konijn en anti-konijn geproduceerd in geiten secundaire antilichamen, moet het anti-konijn geproduceerd in geitenantilichaam worden gebruikt voordat de anti-muis geproduceerd in konijn antilichaam. Wanneer de sequentiële methode volledig wordt gedomineerd, kan het gelijktijdige immunostainingproces worden gestart. Bij deze methode is het essentieel om secundaire antilichamen op de juiste manier te kiezen. Idealiter moeten al die antilichamen afkomstig zijn van hetzelfde gastheerdier om kruisreactiviteit te voorkomen. We raden aan om een positieve controle uit te voeren om te bevestigen dat de kleuringsmethode nauwkeurig werkt in postnatale hippocampusweefsel (overvloedige neurogenese rond deze leeftijd). Als het positieve controleweefsel kleuringsproblemen vertoont, bekijk en doorloop de procedure, breng correcties en aanpassingen aan en herhaal totdat een goede kleuring wordt geproduceerd. Voer vervolgens een negatieve controle uit om te testen of het antilichaam correct werkt door een bepaald primair antilichaam weg te laten of te vervangen door normaal serum (dezelfde soort als het primaire antilichaam). Zoals vermeld in de inleiding, is beelddeconvolutie een krachtig hulpmiddel en biedt het een alternatief wanneer een confocale microscoop niet beschikbaar is. Het kan de beelddeconvolutie toepassen op alle beelden die zijn verkregen met behulp van doorgelaten licht helder veld, breedveldfluorescentie en confocale fluorescentiemicroscopie. Het uiteindelijke doel van beelddeconvolutie is om het oorspronkelijke signaal te reconstrueren dat het acquisitiesysteem verslechtert10.
Samenvattend is de identificatie van de nieuw gegenereerde cellen gevisualiseerd door de immunodetectie van thymidine-analoog BrdU een gecompliceerde maar krachtige techniek. Dit werk is een poging om wetenschappers te helpen, met name op het gebied van volwassen hippocampale neurogenese, om nieuwe cellen nauwkeuriger te kwantificeren. We hopen dat deze inspanning nuttig is geweest voor de wetenschappelijke gemeenschap en het gemakkelijker maakt om de studie van celproliferatie te verfijnen met behulp van de immunohistochemische techniek.

Het idee dat nieuwe neuronen gedurende de hele levensduur in het volwassen menselijke brein worden gegenereerd, fascineert de wetenschappelijke gemeenschap al tientallen jaren. De kennis dat de hersenen gedurende hun hele levensduur nieuwe neuronen genereren, werd verkregen door de detectie van cellen onder deling 1,2. Detectie van nieuw gegenereerde neuronen in de volwassen hersenen werd voor het eerst geïdentificeerd door het intracranieel injecteren van tritiated thymidine (thymidine-H3) bij ratten en het detecteren van cellen in de celcyclus door autoradiogrammen 1,2. Celdeling van glia en de aanwezigheid van neuroblasten werd gemeld, wat de eerste veelbelovende gegevens waren over de postnatale neurogenese1. Niettemin impliceerde het gebruik en de detectie van thymidine-H3 het gebruik van radioactiviteit, wat schadelijk kan zijn voor de mensen die het beheren. De eerste poging om de geschiktheid van BrdU-immunohistochemie te onderzoeken in de studie van proliferatie, migratie en oorsprong van cellen in het zenuwstelsel verscheen in 1988 door Miller en Nowakowski3. In 1998 toonde een paper gepubliceerd door Eriksson en collega's aan dat nieuwe neuronen postmortaal werden gevisualiseerd in het menselijke volwassen brein van patiënten geïnjecteerd met 5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU)4. Deze patiënten kregen de BrdU-injectie (250 mg intraveneus) om de groei van tumoren te labelen4. Deze techniek werd overgenomen in diermodellen. De introductie van deze methoden markeerde een mijlpaal voor het veld, omdat dit de detectie van nieuw gegenereerde cellen mogelijk maakte zonder het gebruik van radioactieve verbindingen. Deze procedure werd de gouden standaard om celproliferatie in volwassen hersenniches te meten om verder onderzoek in het veld te bevorderen.
De beperking van de thymidine-analoge techniek is dat het niet mogelijk is om de cellulaire identiteit voor de nieuw gegenereerde cellen te bepalen. Immunohistochemie stelt ons echter in staat om een dubbele of drievoudige etiketteringstechniek van dezelfde cel uit te voeren, die het cellulaire lot van de nieuw gegenereerde cellen en zelfs hun stadia van rijping valideert, wat leidt tot verdere evolutie van het veld. Deze methode werd gekarakteriseerd om nieuw gegenereerde cellen te differentiëren in glia, ongedifferentieerde neuronen of een volledig volwassen korrelige cel, en zelfs om te bepalen of ze actief deelnemen aan het circuit. Een andere doorbraak in het veld was het gebruik van transgene modellen om ongedifferentieerde cellen onder het domein van nestine te identificeren. De nestin-GFP transgene muizen drukken een versterkt groen fluorescerend eiwit (GFP) uit, dat onder controle staat van de nestin-promotor. Nestin is een intermediair filament dat wordt gekenmerkt door voorlopercellen5. De nestin-GFP transgene muizen maakten het mogelijk om vroege ontwikkelingsstappen vast te stellen die betrokken zijn bij neurogenese6. Een belangrijke beperking is echter om een nestin-GFP transgene muizenkolonie onder speciale omstandigheden in een laboratoriumfaciliteit te kunnen onderhouden die kosteneffectief wordt voor sommige wetenschappelijke groepen, vooral die uit ontwikkelingslanden.
De hierboven genoemde technieken hebben voor- en nadelen. Identificatie van prolifererende cellen door immunohistochemie (IHC) en de mogelijkheid om dubbele of drievoudige etiketteringstechniek uit te voeren door immunofluorescentie om het celrijpingsstadium of het lot van cellen te identificeren, is tot nu toe echter de meest haalbare manier om volwassen neurogenese te meten. Het identificatieproces met behulp van immunohistochemie bestaat uit het labelen van eiwitten, eiwitdomein of nucleotiden met een specifiek antilichaam dat hun herkenning mogelijk maakt, bekend als primair antilichaam. Dit laatste wordt herkend door het secundaire antilichaam, dat is gemarkeerd met een chromogeen (bijv. Mierikswortelperoxidase) of een fluorochroom (bijv. FITC) in combinatie met het secundaire antilichaam. Microscopen kunnen zowel chromogenen als fluorchromensignalen detecteren. Met behulp van IHC is het mogelijk om membraaneiwitten, cytoskeleteiwitten of nucleaire componenten zoals BrdU te identificeren. Aan de andere kant kan BrdU worden gevonden in de cellulaire kern, omdat het tijdens de S-fase door competitie in het DNA wordt opgenomen. Daarom is een cruciale stap de DNA-denaturatie met HCl, die DNA-bindingen opent om het BrdU-antilichaam toegang te geven tot BrdU in het DNA. Het is essentieel om te weten dat BrdU aanwezig is in een verzadigde concentratie in muizen en rattenserum gedurende respectievelijk 15 en 60 minuten, na intraperitoneale toediening, en vervolgens snel daalt tot niet-detecteerbare niveaus na respectievelijk 60 en 120 minuten7.
Hier beschrijven we vier verschillende maar nauw verwante IHC-technieken: chromogene indirecte detectie met behulp van mierikswortelperoxidase (HRP) reactie met DAB (3,3'-diaminobenzidine) sans signaalversterking (stap 4.1), avidine-biotine complex (ABC) amplificatie (stap 4.1), indirecte immunofluorescentiedetectie zonder signaalversterking (stap 4.4) en gelabelde streptavidin-biotine (LSAB) amplificatie (stap 4.3). Elke methode heeft voor- en nadelen en kan nuttig zijn voor specifieke weefselvereisten (zie tabel 1). We hebben besloten om indirecte ICH-methoden te volgen vanwege hun betaalbaarheid en eenvoud om wijzigingen aan te brengen van chromogene naar fluorescerende detectiemethoden bij het gebruik van niet-geconjugeerde primaire antilichamen. De HRP-aanpak is een veelgebruikte IHC-methode vanwege de betaalbaarheid, hoge stabiliteit, hoge omloopsnelheid en volledige beschikbaarheid van substraten. Niettemin raden we aan een positieve controle te gebruiken om te bevestigen dat de kleuringsmethode nauwkeurig werkt en het gebruik van negatieve controle om de antilichaamfunctie effectief te testen. Meerdere immunostainings of multiplex IHC-methoden (zie stap 6) zijn krachtige hulpmiddelen om grote hoeveelheden gegevens uit de weefselsectie in één experiment te verkrijgen. Deze techniek is vooral belangrijk wanneer de beschikbaarheid van monsters beperkt is. Een ander voordeel is de mogelijkheid om tegelijkertijd specifieke eiwitten te identificeren die samen tot expressie komen in dezelfde cellulaire ruimte met behoud van de weefselintegriteit. Multiplex maakt het mogelijk om verschillende markers te kleuren die tot expressie komen tijdens specifieke proliferatieve stadia (bijv. Nestin, GFAP, DCX, Ki-67), waardoor we een meer gedetailleerd proliferatie- en differentiatieonderzoek kunnen bereiken8. Het is cruciaal om antilichamen te kiezen die compatibel zijn met de fixatietechniek die wordt gebruikt om kruisreactiviteit te voorkomen. We raden aan om elk nieuw antilichaam (inclusief BrdU) afzonderlijk te testen om de methode aan te passen en te verfijnen. Introduceer vervolgens de dubbele sequentiële kleuring en start ten slotte het gelijktijdige immunostainingproces wanneer de sequentiële methode volledig wordt gedomineerd. Het is cruciaal om geschikte secundaire antilichamen voor deze methode te kiezen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Methode</td>
			<td>Specifieke methode</td>
			<td>Voordelen</td>
			<td>Nadelen</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Indirecte detectiemethode</td>
			<td>Peroxidasereactie met DAB</td>
			<td>1. Hogere gevoeligheid dan de directe detectie- en indirecte fluorescentiemethode. 2. Hogere weerstand tegen photobleaching dan fluorochromen. 3. Lagere kosten dan fluorescentiedetectiemethode</td>
			<td>1. Moeilijk voor multiplexing met minder kleurkleurstoffen. 2. Ingewikkeld voor co-uitgedrukte doelen in dezelfde cellulaire ruimte. 3. Verminderd dynamisch bereik voor gelijktijdig schaarse en hoge overvloedige doelen op hetzelfde weefsel.</td>
		</tr><tr><td>Fluorescentie</td>
			<td>1. Beste en gemakkelijkste voor multiplexen met meer kleurkleurstoffen. 2. Het beste voor Co-uitgedrukte doelen in dezelfde cellulaire ruimte. 3. Beter dynamisch bereik voor gelijktijdig schaarse en hoge overvloedige doelen op hetzelfde weefsel. 4. Geen extra stappen.</td>
			<td>1. Lagere gevoeligheid dan de indirecte peroxidasereactie met DAB-methode. 2. Zwakke weerstand tegen Photobleaching in de loop van de tijd. 3. Duurder.</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Signaalversterkingsmethode</td>
			<td>Avidin-Biotine Complex (ABC)</td>
			<td>1. Hogere gevoeligheid dan de directe en indirecte detectiemethode. 2. Achtergrond verminderen</td>
			<td>1. Aanvullende stappen. 2. Duurder dan niet versterken.</td>
		</tr><tr><td>Gelabeld Streptavidin-Biotine (LSAB)</td>
			<td>1. Hogere gevoeligheid dan de directe en indirecte detectiemethode. 2. Meer substantiële weefselpenetratie dan de ABC-methode. 3. Achtergrond verminderen</td>
			<td>1. Aanvullende stappen. 2. Duurder dan de ABC-methode.</td>
		</tr><tr><td>Geen aanvullende versterkingsmethode</td>
			<td>1. Lagere kosten. 2. Geen extra stappen. 3. Ideaal voor hoge overvloedige doelen.</td>
			<td>1. Lagere gevoeligheid: problematisch zonder overvloedige doelen.</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 1: Voor-/nadelen van IHC-technieken. Deze tabel toont de voor-/nadelen voor indirecte detectiemethoden: Peroxidasereactie met (3,3'-diaminobenzidine) DAB en fluorescentie; en signaalversterkingsmethoden: avidine-biotinecomplex (ABC), gelabeld streptavidin-biotine (LSAB), en geen aanvullende amplificatiemethode.
Een afbeelding met een hoge resolutie is van fundamenteel belang om een goede analyse uit te voeren en de resultaten te presenteren. Er zijn twee benaderingen om de resolutie te verbeteren: 1) gebruik van een beter microscoopontwerp (bijv. Confocal, multifoton) of 2) numeriek omkeren van het vervagingsproces om beelden te verbeteren met behulp van deconvolutie9. Helaas is confocale microscopie niet betaalbaar vanwege de hoge kosten van apparatuur en het onderhoud ervan10. Een wide-field epifluorescentiemicroscoop en de daaropvolgende deconvolutie van de z-stack beelden bieden een geschikt, goedkoop alternatief voor confocale microscopie 8,9. Zoals hierboven vermeld, is het doel van deconvolutie om het oorspronkelijke signaal te herstellen dat werd aangetast door het acquisitiesysteem9, door onscherpte, onscherpe waas en vervorming te verminderen die worden weergegeven in het beeld dat is verkregen door een epifluorescentie- of confocale microscoop met behulp van wiskundige verwijderingsalgoritmen10. Het verkregen wazige beeld kan wiskundig worden gemodelleerd als het resultaat van het oplossen van de waargenomen objecten met een 3D-point-spread-functie (PSF). PSF is een theoretisch diffractiepatroon van de lichtpunten die door het weefselmonster worden uitgezonden en door de microscoop worden verzameld. PSF-bestand wordt gemaakt met de specifieke omstandigheden van elk beeld, zoals de CCD-celafstand van de camera, brekingsindex van de gebruikte media, het numerieke diafragma van de objectieflens, de emissiegolflengte van de fluorofoor, beeldformaten, aantal afbeeldingen in de z-stack-verwerkingsmethode en de ruimte ertussen (zie technische specificatie in tabel 2). Met andere woorden, het PSF-bestand vat de effecten van de beeldvormingsopstelling op de microscoopwaarnemingen samen9. We gebruiken echter de diffractie PSF 3D Plugin (https://imagej.net/Diffraction_PSF_3D) om ons eigen specifieke PSF-bestand te maken voor elke z-stack-afbeelding. Z-stack-afbeeldingen zijn een reeks gedigitaliseerde optische secties van gedefinieerde diepten (z-as) op dezelfde XY-locatie van de dia. Een computer verzamelt de informatie die uit het focusvlak wordt verkregen door signalen die afkomstig zijn van objecten in andere brandpuntsvlakken opnieuw toe te wijzen. Om z-stack-afbeeldingen te maken, is het noodzakelijk om afbeeldingen te maken van verschillende gefocuste lagen van de dia's (bijvoorbeeld tien verschillende afbeeldingen van hetzelfde XY-gebied om de 1 μm diepte). Vervolgens gebruiken we microscopiesoftware van de fabrikant of Fiji om een z-stack of 3D-afbeelding te maken. Het resultaat is een afbeeldingsbestand met één stapel (bijvoorbeeld tien afbeeldingen met verschillende focuspunten). Er zijn verschillende klantspecifieke tools en softwareoplossingen, zoals open-source software voor deconvolutiemicroscopie. We zullen de uitvoer van het deconvolutieproces tonen met behulp van DeconvolutionLab29, een Fiji11-plug-in (distributie van ImageJ12). Deconvolutie zal helpen de resolutie van de uiteindelijke microfoto's te verbeteren (zie figuur 1B,C ). Voor meer informatie en instructies raden we ten zeerste aan om referentie13 te lezen.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig01.jpg"> Figuur 1: Representatieve afbeelding van 3D-deconvolutie voor meerdere kleurkanalen. (A) DG bij lage vergroting. (B) De originele z-stack afbeeldingen voor elk kanaal en de samengevoegde afbeelding. (C) 3D-gedeconvolueerde z-stack-afbeeldingen voor elk kanaal en de samengevoegde afbeelding. Dit brein was van de rat die deel uitmaakte van de fysieke activiteitsgroep. Er werd gebruik gemaakt van de gelabelde streptavidin-biotine (LSAB) amplificatiemethode. Het toonde Cy3 streptavidin geconjugeerd antilichaam voor het aangeven van BrdU (rood), DAPI als een counterstaining (blauw) en glial fibrillary acidic protein (GFAP) als een astrogliale marker (groen). ML = moleculaire laag; GCL = korrelige cellaag; SGZ = subgranulaire zone. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Het doel van dit werk is om een gedetailleerde beschrijving te geven van de stappen om positieve en succesvolle resultaten te verkrijgen met immunostaining en om veelgebruikte stappen in BrdU-gebaseerde studies te vermelden, zonder het gebruik van een confocale microscoop. BrdU-kleuring is een techniek die verschillende stappen vereist die zorgvuldig moeten worden gevolgd om een succesvolle vlek te bereiken. Het standaardiseren van deze kleuringstechnieken duurt meestal maanden en is tijd- en middelenintensief. We verwachtten dat dit artikel informatie zou kunnen bieden aan de groepen die binnen dit veld beginnen door tijd en fouten te verminderen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENT PREPARATION AND SETUP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donor Horse Serum</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>S0900</td>
			<td>Blocking and incubation solutions in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde reagent grade, crystalline (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>toxic, flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746436-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, monobasic</td>
			<td>J.T Bker</td>
			<td>3246-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sacarose</td>
			<td>J.T Baker</td>
			<td>4072-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Meyer</td>
			<td>2365-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td>Corrisive, to calibrate pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phophate Dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9763-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-x 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THYMIDINE ANALOGUE BRDU ADMINISTRATION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Bromo-2&#8242;-deoxyuridine, BrdU</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9285</td>
			<td>toxic (mutagenic, teratogenic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23&#8211;27G hypodermic needle</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution</td>
			<td>PiSA</td>
			<td>30130032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 1 mL</td>
			<td>NIPRO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TISSUE PREPARATION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-ml polypropylene conical tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-ml polypropylene conical tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guillotine</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome Cryostat</td>
			<td>MICROM</td>
			<td>HM525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netwell 15 mm polyester mesh membrane inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3477</td>
			<td>pre-loaded in 12-well culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netwell plastic 12-well carrier kit</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3520</td>
			<td>for 15 mm polyester mesh membrane inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netwell plastic 6-well carrier kit</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>7553-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>IKA</td>
			<td>ROKCER 3D Digital</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMMUNOSTAINING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td>1%, Light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit (with Nickel), 3,3&#8217;-diaminobenzidine</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>carcinogenic, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydochloric Acid</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>9535-05</td>
			<td>Corrosive, to calibrate pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide, 50%</td>
			<td>Meyer</td>
			<td>5375-1L</td>
			<td>Toxic, oxidative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASTAIN&#174; Elite&#174; ABC Kit Peroxidase (HRP)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td>enzymatic, avidin/biotin based amplification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HPA056030</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-BrdU antibody produced in Mouse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2531</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-065-151</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, HRP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>G-21040</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG (whole molecule), TRITC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5393</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed, FITC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F-2765</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Cy3</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SA-1300</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAGING AND ANALYSIS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell Computer Company</td>
			<td>T8P8T-7G8MR-4YPQV-96C2F-7THHB</td>
			<td>For controlling and monitoring protocols&#8217; processes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD-camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UC50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSens Standard software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>cellSens Standard Edition</td>
			<td>Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-pressure 130 W mercury arc lamp</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-HGLGPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low autofluorescence immersion oil</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MOIL-30 Type F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover-glasses (VWR, cat no 48404 454; 24&#160; 60 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (VWR, cat no 48323-185; 76&#160; 26 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-FBW filter cube</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-FBW</td>
			<td>excitation 460 - 495 nm, dichroic mirror 505 nm, suppression 510 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-FGW filter cube</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-FGW</td>
			<td>excitation 530 - 550 nm, dichroic mirror 570 nm, suppression 575 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-FUW filter cube</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-FUW</td>
			<td>excitation 340 - 490 nm, dichroic mirror 410 nm, suppression 420 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemistry techniques to analyze cellular proliferation and neurogenesis in rats using the thymidine analog brdu

Een van de belangrijkste dingen op het gebied van volwassen hippocampus neurogenese (AHN) is de identificatie van de nieuw gegenereerde cellen. De immunodetectie van thymidine-analogen (zoals 5-Bromo-2'-deoxyuridine (BrdU)) is een standaardtechniek die wordt gebruikt voor het visualiseren van deze nieuw gegenereerde cellen. Daarom wordt BrdU meestal intraperitoneaal geïnjecteerd bij kleine dieren, dus het thymidine-analoog wordt opgenomen in delende cellen tijdens dna-synthese. Detectie wordt uitgevoerd door immunohistochemische analyse van hersenplakken. Elke onderzoeksgroep die deze techniek heeft gebruikt, kan begrijpen dat het speciale aandacht vereist voor minuscule details om een succesvolle vlek te bereiken. Een belangrijke stap is bijvoorbeeld DNA-denaturatie met HCl, waardoor het de celkern kan bereiken om het te kleuren. De bestaande wetenschappelijke rapporten beschrijven echter zeer weinig van dergelijke stappen in detail. Daarom is het standaardiseren van de techniek een uitdaging voor nieuwe laboratoria, omdat het enkele maanden kan duren om positieve en succesvolle resultaten op te leveren. Het doel van dit werk is om de stappen voor het verkrijgen van positieve en succesvolle resultaten van de immunostaining-techniek in detail te beschrijven en uit te werken bij het werken met het thymidine-analoog BrdU. Het protocol omvat de reagensvoorbereiding en -opstelling, toediening van thymidine-analoog bij een knaagdier, transcardiale perfusie, weefselpreparaat, peroxidase immunohistochemische reactie, gebruik van avidine-biotinecomplex, immunofluorescentie, counterstaining, microscopiebeeldvorming en celanalyse.

De hierboven beschreven methoden werden toegepast om pasgeboren cellen in volwassen rat hippocampus te kwantificeren na vrijwillige fysieke activiteit, in tegenstelling tot een controlegroep zonder extra fysieke activiteit. We gebruikten de postnatale hippocampus van de rat als een positieve controle. Mannelijke ratten van 3 maanden oud waren zeven dagen lang onder een vrijwillig fysiek activiteitsprotocol (eindeloos wiel). Op dag 6 werden ratten geïnjecteerd met BrdU (rubriek 2) en elke 12 uur daarna tot drie volledige injecties. Om drie celcyclusdelingen te voltooien, werden de dieren transcardiaal geïnfundeerd (rubriek 3) 8 uur na de laatste BrdU-injectie. Dezelfde procedure werd gebruikt bij drie maanden oude ratten die geen fysieke activiteit ondergingen om als vergelijkende controle te worden gebruikt. Als positieve controle werden rattenpups van één dag oud (postnatale dag 1) één keer geïnjecteerd met BrdU, zoals beschreven in rubriek 2 hierboven. Een dag na de injectie (postnatale dag 2) werden pups geëuthanaseerd en werden hun hoofden ondergedompeld in PFA-oplossing, zoals beschreven in stap 3.4. Volwassen ratten werden diep verdoofd (stap 3.1), transcardiaal geïnfundeerd, zoals beschreven in stap 3.2. Hersenen werden ontleed en post-gefixeerd (stap 3.4). Hersenen werden gesneden in coronale secties van 40 μm (stap 3.5). Secties werden verwerkt voor BrdU immunohistochemie, zoals beschreven in stap 4.
We gebruikten mierikswortelperoxidasereactie met DAB IHC voor kleuring (stap 4.1) en het tellen van BrdU-positieve cellen in DG. Figuur 5 toont een DG-sectie met BrdU-gelabelde cellen. Figuur 5C,D toont een representatief deel van het DG-gedeelte bij hogere vergroting. Gelabelde cellen vertoonden intense donkere vlekken, die werden gemarkeerd met pijlen. De inzet toont het gemiddelde aantal gelabelde cellen in de experimentele en controlegroepen (getelde positieve cellen vermenigvuldigd met zes zoals beschreven in stap 8.1). De t-test van een student onthulde significantieverschillen tussen de aantallen BrdU-positieve cellen (t(10) = 2,704, p = 0,0222). De controlegroep die geen fysieke activiteit onderging, vertoonde 2.040 ± 314 cellen (n = 6 ratten). Ter vergelijking: de fysieke activiteitsgroep vertoonde gemiddeld 3.606 ± 486 (n = 6 ratten) BrdU-positieve cellen. Zoals waargenomen, verhoogt blootstelling aan fysieke activiteit BrdU-positieve cellen. Daarom zijn deze resultaten consistent met andere gerapporteerde resultaten die aantonen dat fysieke activiteit de cellulaire proliferatie in de volwassen gyrus dentate verhoogde17.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig03.jpg"> Figuur 3: Voorbeelden van verschillende morfologie van BrdU-gelabelde celkern. BrdU is een DNA-synthesemarker die de kern labelt. In het hippocampusgebied hadden de BrdU-positieve kernen een semi-ovale vorm in de subkorrelige zone van gyrus dentate. Omdat BrdU wordt opgenomen door concurrentie, zal de hoeveelheid die voor elke cel wordt opgenomen een variatie hebben die later zal worden weerspiegeld in hoe de kern zal worden gevisualiseerd. (A) Immunofluorescentiebeeld. (B) Er wordt een afbeelding gepresenteerd met behulp van een peroxidasereactie zonder aanvullende amplificatiemethode. Gele pijlen tonen artefacten en niet-specifieke signalen. Zwarte of witte pijlen tonen BrdU+-cellen. 1 – Volledig gevijlde kern, semi-ovale kernen sterk gekleurd. 2 – Kernen met stippen, de rand van de kernen is gemarkeerd en heeft binnenkant verschillende stippen. 3 – Kernen met weinig stippen, de rand van de kernen zijn gemarkeerd en hebben een klein aantal stippen binnenin. 4 – Kleine kern is mogelijk cellen in een ander differentiatiestadium, maar nog steeds onderdeel van de niche. 5 – Clusters zijn voorlopercellen onder deling, daarom kunnen meerdere cellen samen in gecondenseerde groepen worden waargenomen. Binnen deze groepen moet het tellen bijzonder zorgvuldig worden gedaan om te voorkomen dat positieve cellen verkeerd worden gelabeld. Rode pijlen tonen de kern onder deling die kan worden verward met een enkele cel. Elke cel is ingesloten in een vak en kan in realtime worden onderscheiden in een Z-asvlak. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig04.jpg"> Figuur 4: Representatieve RGB-afbeelding voor enkele en samengevoegde kanalen. De bovenste afbeelding toont de oorspronkelijke z-stack-afbeelding en de onderste afbeelding toont de 3D-gedeconvolueerde z-stack-afbeelding. (A) Lage vergroting van het DG. (B) RGB-afbeelding voor elk kanaal en (C) RGB samengevoegde afbeelding. Dit was een brein uit de controlegroep. Immunofluorescentie werd gebruikt zonder een aanvullende amplificatiemethode. BrdU (rood), DAPI als counterstaining (blauw) en GFAP (glial fibrillary acidic protein) als astrogliale marker (groen). ML = moleculaire laag; GCL = korrelige cellaag; SGZ = subgranulaire zone. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig05.jpg"> Figuur 5: Representatieve DG-sectie met BrdU-gelabelde cellen (intens donker) voor elke experimentele groep. De peroxidasereactie werd gebruikt met de avidine-biotine-peroxidase complexe amplificatiemethode. (A, B) Een lage vergroting van de DG weergeven en (C, D) het vakgebied weergeven bij een hogere vergroting. Panelen A en C zijn weefsels uit de fysieke activiteitsgroep, panelen B en D zijn van de controlegroep. De inzet toont het gemiddelde aantal gelabelde cellen in de fysieke activiteits- en controlegroepen (getelde positieve cellen vermenigvuldigd met zes zoals beschreven in stap 8.1). ML = moleculaire laag; GCL = korrelige cellaag; SGZ = subgranulaire zone; pijlen geven BrdU+-cellen aan. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
Video 1: Video met een andere focus van positieve cellen langs de z-as verdeeld over verschillende lagen. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61483/VIDEO_1.avi" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>
Video 2: Video met een andere focus van positieve celclusters langs de z-as verdeeld over verschillende lagen. Beweeg langzaam over de z-as om alle verschillende kernen te kwantificeren die een cluster integreren. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61483/VIDEO_2.mp4" target="_blank">Klik hier om deze video te downloaden.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Microscoop Type:</td>
			<td colspan="5">Epifluorescentie Microscoop Olympus BX53</td>
		</tr><tr><td>Licht:</td>
			<td colspan="5">Hogedruk kwikbooglamp van 130 W (U-HGLGPS)</td>
		</tr><tr><td>Acquisitie Software:</td>
			<td colspan="5">CellSens Standaard</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Filtersets:</td>
			<td colspan="2">Catalogusnummer</td>
			<td>Excitatie bereik</td>
			<td>Dichromatische spiegel</td>
			<td>Onderdrukkingsbereik</td>
		</tr><tr><td colspan="2">U-FUW</td>
			<td>340 - 490 nm</td>
			<td>410 NM</td>
			<td>420 NM</td>
		</tr><tr><td colspan="2">U-FBW</td>
			<td>460 - 495 nm</td>
			<td>505 NM</td>
			<td>510 NM</td>
		</tr><tr><td colspan="2">U-FGW</td>
			<td>530 - 550 nm</td>
			<td>570 NM</td>
			<td>575 NM</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Fototoestel:</td>
			<td colspan="2">Model:</td>
			<td colspan="3">CCD-camera UC50</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Spectraal bereik:</td>
			<td colspan="3">290 – 1000 nm</td>
		</tr><tr><td colspan="2">CCD chip grootte:</td>
			<td colspan="3">2/3 in, 2588 (Breedte *7) X 1960 (Hoogte *8) pixels</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Pixelgrootte:</td>
			<td colspan="3">3,4 x 3,4 μm</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">Fluorochroom:</td>
			<td colspan="2">Naam</td>
			<td>Excitatie Golflengte (nm)</td>
			<td>Emissie *3 Golflengte (nm)</td>
			<td>Emissie Kleur</td>
		</tr><tr><td colspan="2">4, 6-diamidino-2-fenyl-indool HCI (DAPI)</td>
			<td>345</td>
			<td>455</td>
			<td>Blauw</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Tetramethylrhodamine-isothyocyanaat (TRITC)</td>
			<td>541</td>
			<td>572</td>
			<td>Rood</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)</td>
			<td>494</td>
			<td>519</td>
			<td>Groen</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Cy3</td>
			<td>552</td>
			<td>565</td>
			<td>Rood</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">Montagemedium en dompelolie:</td>
			<td colspan="3">Naam</td>
			<td colspan="2">Brekingsindex van het medium *1</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Lucht (niets tussen de dia en de lens)</td>
			<td colspan="2">1.00029</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Antifade montagemedium met DAPI</td>
			<td colspan="2">1.45</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Montagemedium voor permontatie</td>
			<td colspan="2">1.519</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Lage autofluorescentie-onderdompelingsolie (MOIL-30 Type F)</td>
			<td colspan="2">1.518</td>
		</tr><tr><td rowspan="6">Vergroting Lens (Plan Fluoriet)</td>
			<td>Vergroting</td>
			<td>Numeriek diafragma (NA) *2</td>
			<td>Resolutie (μm)</td>
			<td>Pixelafstand afbeelding (nm) *5</td>
			<td>Segmentafstand Z-as (nm) *6</td>
		</tr><tr><td>4x</td>
			<td>0.13</td>
			<td>2.12</td>
			<td>850</td>
			<td>3000</td>
		</tr><tr><td>10x</td>
			<td>0.3</td>
			<td>0.92</td>
			<td>340</td>
			<td>3000</td>
		</tr><tr><td>20x</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.55</td>
			<td>170</td>
			<td>2000</td>
		</tr><tr><td>40x</td>
			<td>0.75</td>
			<td>0.37</td>
			<td>85</td>
			<td>1000</td>
		</tr><tr><td>100x</td>
			<td>1.3</td>
			<td>0.21</td>
			<td>34</td>
			<td>1000</td>
		</tr></tbody></table>Tabel 2: Specificaties voor het instellen van microscoop en vereisten voor het maken van PSF-bestanden (Point Spread Function). Er zijn 11 slots in het diffractie PSF 3D plugin venster om het PSF bestand te maken. Elke sleuf wordt als volgt beschreven: *1 - Brekingsindex van het medium: brekingsindex voor het medium tussen de dia en de lens (bijv. Lucht = 1,00029). *2 - Numeriek diafragma: NA van de gebruikte lens (deze moet worden gecorrigeerd wanneer een ander onderdompelingsmedium wordt gebruikt en de lens is toegewezen). *3 - Golflengte: Fluorochrome maximale emissiegolflengte (nm). *4 - Longitudinale sferische aberratie: 0,00. *5 - Beeldpixelafstand: CCD-pixelgrootte (nm)/vergroting (bijv. 3,4 μm en 100X lens, 3400/100 = 34 nm). *6 - Afstand tussen afbeeldingen Z-as. *7 - Breedte: Voer de breedte in van de afbeelding die in pixels moet worden gedeconcentreerd. *8 - Hoogte: Voer de hoogte in van de afbeelding die in pixels moet worden gedeconcentreerd. *9 - Diepte, segmenten: het aantal afbeeldingen in de z-stack. *10 - Normalisatie: Som van pixelwaarden = 1. *11 - Titel: Gewenste naam voor het PSF-bestand. Het bestand moet overeenkomen met de unieke gegeven z-stack-afbeelding.

Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemistry Techniques to Analyze Cellular Proliferation and Neurogenesis in Rats Using the Thymidine Analog BrdU at JoVE.com

Immunohistochemistry Techniques to Analyze Cellular Proliferation and Neurogenesis in Rats Using the Thymidine Analog BrdU

Dit artikel presenteert vier van de meest voorkomende technieken voor het visualiseren van BrdU-positieve cellen om volwassen neurogenese bij ratten te meten. Dit werk omvat instructies voor reagenspreparaatatie, thymidine-analoge toediening, transcardiale perfusie, weefselvoorbereiding, peroxidase immunohistochemische reactie, immunofluorescentie, signaalversterking, counterstaining, microscopiebeeldvorming en celanalyse.

Immunohistochemische technieken om cellulaire proliferatie en neurogenese bij ratten te analyseren met behulp van de Thymidine Analog BrdU

One of the most important things in the field of adult hippocampal neurogenesis (AHN) is the identification of the newly generated cells. The ...

Research

JoVE Journal

Biology

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

Corticale Neurogenese: Overstappen van Vooruitgang in het Laboratorium voor Cell-gebaseerde therapieën

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Immunohistochemie: Paraffinecoupes Met behulp van de Vectastain ABC Kit van Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

Immunohistochemie op paraffine secties van Mouse Opperhuid gebruik van fluorescerende antilichamen

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

Drosophila larven NMJ Immunohistochemie

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Micro-injectie technieken voor het bestuderen van mitose in de Drosophila melanogaster Syncytieel Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp en perfusie technieken voor het bestuderen van Ion Channels Uitgedrukt in Xenopus Eicellen

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Onderzoek van eiwitten gebonden aan ontluikende DNA in zoogdiercellen met behulp van BrdU-ChIP-Slot-westerse techniek

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Met behulp van microfluïdische apparaten te meten Levensduur en Cellulaire Phenotypes in Single Budding gistcellen

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

Technieken voor het induceren en te kwantificeren Cellulaire senescentie

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

Eenvoudig en effectief beheer en visualisatie van deeltjes in de bloedsomloop van kleine vissen met behulp van nier injectie

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...