Name: immunohistochemistry techniques to analyze cellular proliferation and neurogenesis in rats using the thymidine analog brdu
Uploaded: 2020-09-09T14:30:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemistry Techniques to Analyze Cellular Proliferation and Neurogenesis in Rats Using the Thymidine Analog BrdU at JoVE.com

ברצוננו להודות למר מיגל בורגוס ולגוסטבו לאגו על מתן סיוע טכני. אנו רוצים להודות גם לד"ר קלורינדה אריאס, ד"ר קרלה הרננדז וד"ר אוסקר גליציה על תמיכתם האדיבה במתן ריאגנטים וחומרים. אנו מודים גם ל- División de Investigación y Posgrado של אוניברסיטת איברואמריקנה סיודאד דה מקסיקו על מתן מימון לביצוע עבודה זו ועל כיסוי הוצאות הפקת וידאו.

<ol>
	<li>Altman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+new+neurons+formed+in+the+brains+of+adult+mammals.">Are new neurons formed in the brains of adult mammals.</a> Science. 135 (3509), 1127-1128 (1962).</li><li>Altman, J., Das, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoradiographic+and+histological+evidence+of+postnatal+hippocampal+neurogenesis+in+rats.">Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats.</a> The Journal of Comparative Neurology. 124 (3), 319-335 (1965).</li><li>Miller, M. W., Nowakowski, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bromodeoxyuridine-immunohistochemistry+to+examine+the+proliferation,+migration+and+time+of+origin+of+cells+in+the+central+nervous+system.">Use of bromodeoxyuridine-immunohistochemistry to examine the proliferation, migration and time of origin of cells in the central nervous system.</a> Brain Research. 457 (1), 44-52 (1988).</li><li>Eriksson, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+adult+human+hippocampus.">Neurogenesis in the adult human hippocampus.</a> Nature Medicine. 4 (11), 1313-1317 (1998).</li><li>Filippov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpopulation+of+nestin-expressing+progenitor+cells+in+the+adult+murine+hippocampus+shows+electrophysiological+and+morphological+characteristics+of+astrocytes.">Subpopulation of nestin-expressing progenitor cells in the adult murine hippocampus shows electrophysiological and morphological characteristics of astrocytes.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 23 (3), 373-382 (2003).</li><li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus.">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends in Neurosciences. 27 (8), 447-452 (2004).</li><li>Matia&#353;ov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+determination+of+5-bromo-2'-deoxyuridine+pharmacokinetics+in+blood+serum+after+intraperitoneal+administration+to+rats+and+mice.">Flow cytometric determination of 5-bromo-2'-deoxyuridine pharmacokinetics in blood serum after intraperitoneal administration to rats and mice.</a> Histochemistry and Cell Biology. 142 (6), 703-712 (2014).</li><li>Von Bohlen Und Halbach, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistological+markers+for+proliferative+events,+gliogenesis,+and+neurogenesis+within+the+adult+hippocampus.">Immunohistological markers for proliferative events, gliogenesis, and neurogenesis within the adult hippocampus.</a> Cell and Tissue Research. 345 (1), 1-19 (2011).</li><li>Sage, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DeconvolutionLab2:+An+open-source+software+for+deconvolution+microscopy.">DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy.</a> Methods. 115, 28-41 (2017).</li><li>Manz, W., Arp, G., Schumann-Kindel, G., Szewzyk, U., Reitner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widefield+deconvolution+epifluorescence+microscopy+combined+with+fluorescence+in+situ+hybridization+reveals+the+spatial+arrangement+of+bacteria+in+sponge+tissue.">Widefield deconvolution epifluorescence microscopy combined with fluorescence in situ hybridization reveals the spatial arrangement of bacteria in sponge tissue.</a> Journal of Microbiological Methods. 40 (2), 125-134 (2000).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Abr&#224;moff, M. D., Magalh&#227;es, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+with+imageJ.">Image processing with imageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 36-41 (2004).</li><li>. 2D and 3D Fluorescence Deconvolution Manual Available from: <a target="_blank" href="https://pages.stolaf.edu/wp-content/uploads/sites/803/2016/12/Giannini_Giannini_Deconvolution_Manual_20161215.p">https://pages.stolaf.edu/wp-content/uploads/sites/803/2016/12/Giannini_Giannini_Deconvolution_Manual_20161215.p</a> (2016)</li><li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrdU+immunohistochemistry+for+studying+adult+neurogenesis:+Paradigms,+pitfalls,+limitations,+and+validation.">BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation.</a> Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).</li><li>Revilla, V., Jones, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryostat+sectioning+of+brains.">Cryostat sectioning of brains.</a> International Review of Neurobiology. 47, 61-70 (2002).</li><li>Amaral, D. G., Scharfman, H. E., Lavenex, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dentate+gyrus:+fundamental+neuroanatomical+organization+(dentate+gyrus+for+dummies).">The dentate gyrus: fundamental neuroanatomical organization (dentate gyrus for dummies).</a> Progress in brain research. 163, 3-22 (2007).</li><li>Eadie, B. D., Redila, V. A., Christie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voluntary+exercise+alters+the+cytoarchitecture+of+the+adult+dentate+gyrus+by+increasing+cellular+proliferation,+dendritic+complexity,+and+spine+density.">Voluntary exercise alters the cytoarchitecture of the adult dentate gyrus by increasing cellular proliferation, dendritic complexity, and spine density.</a> Journal of Comparative Neurology. 486 (1), 39-47 (2005).</li><li>Leal-Galicia, P., Romo-Parra, H., Rodr&#237;guez-Serrano, L. M., Buenrostro-J&#225;uregui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+adult+hippocampal+neurogenesis+exerted+by+sexual,+cognitive+and+physical+activity:+An+update.">Regulation of adult hippocampal neurogenesis exerted by sexual, cognitive and physical activity: An update.</a> Journal of Chemical Neuroanatomy. 101, 101667 (2019).</li><li>Gould, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+widespread+is+adult+neurogenesis+in+mammals.">How widespread is adult neurogenesis in mammals.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 481-488 (2007).</li><li>Ngwenya, L. B., Peters, A., Rosene, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+and+electron+microscopic+immunohistochemical+detection+of+bromodeoxyuridine-labeled+cells+in+the+brain:+Different+fixation+and+processing+protocols.">Light and electron microscopic immunohistochemical detection of bromodeoxyuridine-labeled cells in the brain: Different fixation and processing protocols.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (7), 821-832 (2005).</li><li>Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+and+multiple+labeling+with+antibodies+from+the+same+host+species+to+study+adult+hippocampal+neurogenesis.">Immunohistochemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52551 (2015).</li><li>Tuttle, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+detection+of+two+thymidine+analogues+(CldU+and+IdU)+in+primary+tissue.">Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (46), e2166 (2010).</li><li>Tischler, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple+immunohistochemical+staining+for+bromodeoxyuridine+and+catecholamine+biosynthetic+enzymes+using+microwave+antigen+retrieval.">Triple immunohistochemical staining for bromodeoxyuridine and catecholamine biosynthetic enzymes using microwave antigen retrieval.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 1-4 (1995).</li><li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+studying+adult+neurogenesis:+Insights+and+recent+developments.">Protocols for studying adult neurogenesis: Insights and recent developments.</a> Regenerative Medicine. 2 (1), 51-62 (2007).</li><li>Leuner, B., Glasper, E. R., Gould, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymidine+analog+methods+for+studies+of+adult+neurogenesis+are+not+equally+sensitive.">Thymidine analog methods for studies of adult neurogenesis are not equally sensitive.</a> Biosystems. 517 (2), 123-133 (2010).</li><li>Magavi, S. S., MacKlis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+newborn+cells+by+BrdU+labeling+and+immunocytochemistry+in+vivo.">Identification of newborn cells by BrdU labeling and immunocytochemistry in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 438, 335-343 (2008).</li><li>Kempermann, G., Gast, D., Kronenberg, G., Yamaguchi, M., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+determination+and+long-term+persistence+of+adult-generated+new+neurons+in+the+hippocampus+of+mice.">Early determination and long-term persistence of adult-generated new neurons in the hippocampus of mice.</a> Development. , 391-399 (2003).</li><li>Ramos-Vara, J. A., Beissenherz, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+immunohistochemical+methods+using+two+different+antigen+retrieval+methods+on+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues:+Experience+with+63+markers.">Optimization of immunohistochemical methods using two different antigen retrieval methods on formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: Experience with 63 markers.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 12 (4), 307-311 (2000).</li><li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+methods+of+immunohistochemistry.">Principles and methods of immunohistochemistry.</a> Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).</li><li>Wojtowicz, J. M., Kee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrdU+assay+for+neurogenesis+in+rodents.">BrdU assay for neurogenesis in rodents.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

נוירוגנזה בוגרת היא תהליך המתרחש בתדירות הגבוהה ביותר בנישות של תאים מבשרים עצביים בוגרים שיש להם פוטנציאל ליצור נוירונים חדשים לאורך תוחלת חייהם. תיוג Bromodeoxyuridine (BrdU) נמצא בשימוש נרחב באימונולוגיה כדי לאפיין את מספר התאים החדשים שנוצרו במוח בוגר. BrdU ישולב בעיקר בתאים של אזורי מוח בדידים (אזורים נוירוגניים). תאים אלה ממוקמים באזור התת-חדרי (SVZ), הפיתול המשונן של ההיפוקמפוס – בין ההילוס לתאים הגרעיניים המכונה אזור תת-גרגירי (SGZ)1,2,18. יתר על כן, ישנם אזורים שונים במוח המאופיינים ביכולת שגשוג נמוכה יותר בבגרות, כולל ההיפותלמוס, הסטריאטום, ניאוקורטקס ואמיגדלה19. כפי שהוזכר קודם לכן, צביעת BrdU היא השיטה הנפוצה למחקר נוירוגנזה למבוגרים לזיהוי התפשטות תאים. עם זאת, לשימוש ב- BrdU כסמן יש מגבלות ומלכודות. הראשון הוא כי BrdU הוא סמן מחזור התא. לכן, יש לבצע צביעה כפולה או משולשת כדי לזהות את גורל התא ולכלול סמני תאים כדי לזהות את השלב ההתפתחותי הספציפי של התאים המסומנים. דאגה נוספת לגבי BrdU היא שמדובר בתמיסה רעילה ומוטגנית המשנה את יציבות הדנ"א ועשויה לשנות את תפקוד התאים ואת מחזורי התאים. יש לתת את הדעת למידע הקודם כאשר מחליטים לעקוב אחר פרוטוקול מתן ומינוני מתן (50\u2012600 מ"ג/ק"ג). תכונה חיונית נוספת היא ש-BrdU הוא סמן סינתזת DNA, ולא סמן התפשטות תאים14. לכן, רלוונטי להבחין בין התפשטות תאים לבין אירועים אחרים כגון תיקון DNA, כניסה חוזרת של מחזור התא ושכפול גנים. החוקרים חייבים לעקוב אחר בקרות מתאימות כדי להבטיח את השימוש המתאים ב- BrdU. לדיון מפורט יותר על בעיות ומגבלות אלה, אנו ממליצים לעיין בעבודתו של טאופין14. תהליך התקינה של פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה עשוי להיות איטי ומאתגר. בעבודה זו, הצגנו את כל השלבים הכלליים לניהול פרוטוקול IHC מוצלח. עם זאת, אנו ממליצים לכל קבוצת מחקר לבדוק ולהעריך מראש רקמות, נוגדנים ומצבים. בדיקות והערכות חייבות להתבצע עם לפחות שלוש רמות שונות של דגירה, שלבי שטיפה ועוצמות עבור כל נוגדן ורקמה שנבדקו. אנו ממליצים גם לחוקרים לסקור פרוטוקולים נוספים כדי שיוכלו לבחור את הטוב ביותר העונה על צרכים ודרישות ספציפיים 20,21,22,23,24,25.
כאמור, הנוהל כולל מספר שלבים ושיקולים מתודולוגיים המשמשים בדרך כלל ומוזכרים במאמרים מדעיים, אשר יידונו בהמשך. אנו ממליצים לחוקרים לבחור את הנוגדנים בקפידה ובצורה נכונה מבחינת טכניקה, תקציב, ציוד, התקנה ומטרת המחקר העיקרית. נוגדנים חייבים להיבדק עם אותו סוג של רקמה שתיבדק מאוחר יותר בניסוי. אנו ממליצים גם על שימוש בנוגדן שנבדק לאותה מטרה (IHC) (כלומר, לא רק בטכניקות של כתם מערבי או ציטומטריה של זרימה) כדי לבדוק את התאמתו לטכניקת הקיבוע. מסלולים שונים יכולים לשמש למתן מכתים BrdU כגון הזרקה תוך-צפקית, עירוי תוך-צפקי, בליעה דרך הפה או עירוי תוך-חדרי (לתיאור מפורט יותר של כל טכניקה, ראו הפניה26). אם נבחרה ההזרקה התוך-צפקית, ודא כי BrdU מנוהל לתוך חלל הצפק הימנעות מאזור המעי. מכיוון שבמעי יש מספר תאים בכפילות שיכולים למצות את ה- BrdU לפני שהוא מגיע למוח מה שישפיע על מספר התאים המסומנים. חשוב להשיג חתכים דקים שכן הם מאפשרים חדירה טובה יותר של פתרונות. פרוסות קורונליות בעובי 40 מיקרומטר נחתכו ברוסטרו-קאודאלי והועברו לצלחת תרבית תאים בת 24 בארות, בעקבות ההליך הסטריאולוגי שהוצע על ידי Kempermann et al.27. האימונוהיסטוכימיה יכולה להתבצע עם רקמה המותקנת על מגלשות או כקטעים צפים חופשיים. מכיוון ש-BrdU ממוקם עמוק בגרעיני התאים, הוא מאפשר חדירה של תמיסות במקטעים צפים חופשיים המספקים תוצאות טובות יותר וגישה טובה יותר לאזור העניין. חשוב לפתוח קשרי דנ"א (דנטורציה של דנ"א) כדי לאפשר גישה לנוגדנים העיקריים נגד BrdU. בעבודה זו, ביצענו את ההליכים הספציפיים הללו תוך שימוש בדגירה של HCI. מאידך גיסא, תהליך חסימת אפיטופים לא ספציפיים איפשר זיהוי מדויק יותר של אות סלולרי.
חלחול הממברנה הטוב מאפשר לנוגדנים לחדור כראוי לאזור העניין. הוספת פרמבילייזר כגון Triton X-100 לתמיסות PBS++ ו-PBS+ משפרת את חלחול הממברנה. ניתן להשתמש הן בריאגנטים של PBS והן בריאגנטים של מלח עם מאגר טריס (TBS) בפרוטוקול זה. במונחים של תקציב, TBS יכול להיות תורת היחסות זולה יותר מאשר PBS. עם זאת, PBS עלול להפריע לנוגדנים נגד פוספטים ולעכב נוגדנים מצומדים של פוספטאז אלקליין, לכן הימנע משימוש ב- PBS אם המטרה שונה לאחר תרגום על ידי זרחון (כלומר, זרחון). השתמשנו ב-PBS לעבודה זו, וגילינו ששלבי שטיפת רקמות נתנו אות ספציפי יותר. אנו גם ממליצים לחוקרים לבצע לפחות שלושה מחזורי כביסה באמצעות TBS o PBS. הפתרונות חייבים להיות מוכנים טריים. שליפת אנטיגן (AR) היא שיטה שנועדה להפחית את אובדן האנטיגניות הנגרמת על ידי הקיבוע המשנה את מבנה האנטיגנים השלישוניים והרבעוניים. הפחתה זו הופכת את האנטיגנים לבלתי ניתנים לגילוי על ידי נוגדנים28,29. שליפת האפיטופ המושרה בחום (HIER) המשמשת בפרוטוקול זה ניסתה להפוך את התגובות הכימיות בין פורמלדהיד לחלבונים על ידי טמפרטורה גבוהה או הידרוליזה אלקליין חזקה (עם תמיסות חיץ אחרות כמו EDTA pH 8.5 או Tris pH 9.5). חיוני לבדוק נוגדנים חדשים עם פרוטוקולי AR שונים כדי להשוות את התוצאות ולבחור את הטוב ביותר עבור הפרוטוקול. שלב אחרון זה עשוי להיות אופציונלי בפרוטוקול רגיל; עם זאת, טיפלנו ברקמות באמצעות פרוטוקול אחזור אנטיגן כדי לספק תוצאות טובות יותר עבור פרוטוקול זה.
חשוב לבחור את הצבע המנוגד הסופי הנכון ואת טכניקת הכתם הנגדי בהתחשב בצבע הצביעה הראשוני ובשיטה המשמשת להפיכת מבנה שאינו מכתים לגלוי לעין ולהימנע מהסתרת צבע הכתם הראשוני מהתגובה החיסונית. עבור המיקרוסקופיה הפלואורסצנטית, ה-DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) הוא כתם נגדי גרעיני וכרומוזומי פופולרי מאוד הפולט פלואורסצנטיות כחולה (ספיגה: 360 ננומטר, פליטה: 460 ננומטר) עם קשירתו לאזורי AT של הדנ"א. אמצעי הרכבה המכיל DAPI זמין וקל לשימוש; זה מספק שמירת אותות מצוינת לרכישת תמונה. עבור תגובת החמצן, IHC היה זמין באפשרויות שונות כגון צבע סגול קרזיל, המטוקסילין, אדום נייטרלי או כתמים בצבע ירוק מתיל. עבור טכניקות חיסוניות מרובות, חיוני לבחור נוגדן תואם עם טכניקת הקיבוע המשמשת למניעת תגובתיות צולבת30. כאשר נפתרות בעיות וסיבוכים עם צביעה בודדת, יש לבצע צביעת צבע נוספת לפי הצורך. חשוב לשלוט בקשירה הלא ספציפית בין הנוגדנים המשניים. ניתן לעשות זאת על ידי רוויית הנוגדנים הראשוניים לפני שימוש בנוגדן משני המיוצר באותו מין מארח של הנוגדנים הראשוניים. לדוגמה, בעת שימוש באנטי-עכבר המיוצר בארנב ואנטי-ארנב המיוצר בנוגדנים משניים של עזים, יש להשתמש בנוגדן האנטי-ארנב המיוצר בנוגדן עז לפני האנטי-עכבר המיוצר בנוגדן ארנב. כאשר השיטה הרציפה נשלטת לחלוטין, אז תהליך immunostaining בו זמנית ניתן ליזום. בשיטה זו, חיוני לבחור נוגדנים משניים כראוי. באופן אידיאלי, כל הנוגדנים האלה חייבים להגיע מאותה חיה מארחת כדי למנוע תגובתיות צולבת. אנו ממליצים לבצע בקרה חיובית כדי לוודא ששיטת הצביעה פועלת באופן מדויק ברקמת ההיפוקמפוס לאחר הלידה (נוירוגנזה בשפע סביב גיל זה). אם רקמת הבקרה החיובית מראה בעיות צביעה, בדקו ועברו על ההליך, בצעו תיקונים והתאמות, וחזרו על הפעולה עד ליצירת צביעה טובה. לאחר מכן, הפעל בקרה שלילית כדי לבדוק שהנוגדן פועל כראוי על ידי השמטה או החלפה של נוגדן ראשוני מסוים בסרום רגיל (אותו מין כמו הנוגדן הראשוני). כפי שצוין במבוא, פירוק תמונה הוא כלי רב עוצמה ומספק אלטרנטיבה כאשר מיקרוסקופ קונפוקלי אינו זמין. הוא יכול להחיל את פירוק התמונה על כל התמונות המתקבלות באמצעות שדה בהיר של אור המועבר, פלואורסצנציה של שדה רחב ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית. המטרה הסופית של פירוק תמונה היא לשחזר את האות המקורי כי מערכת הרכישה מתדרדרת10.
לסיכום, זיהוי התאים החדשים שנוצרו על ידי זיהוי חיסוני של תימידין אנלוגי BrdU הוא טכניקה מורכבת אך רבת עוצמה. עבודה זו היא ניסיון לסייע למדענים, במיוחד בתחום של נוירוגנזה בהיפוקמפוס בוגר, לכמת תאים חדשים בצורה מדויקת יותר. אנו מקווים שמאמץ זה היה מועיל לקהילה המדעית ומקל על כוונון עדין של חקר התפשטות התאים על ידי טכניקת האימונוהיסטוכימיה.

הרעיון שתאי עצב חדשים נוצרים במוח האנושי הבוגר לאורך תוחלת החיים ריתק את הקהילה המדעית במשך עשרות שנים. הידיעה שהמוח מייצר תאי עצב חדשים לאורך תוחלת החיים שלו הושגה באמצעות זיהוי תאים תחת חלוקה 1,2. זיהוי של נוירונים חדשים שנוצרו במוח הבוגר זוהה לראשונה על ידי הזרקה תוך גולגולתית של תימידין טריטידין (תימידין-H3) בחולדות וזיהוי תאים במחזור התא על ידי אוטורדיוגרמות 1,2. דווח על חלוקת תאים של גליה ונוכחות של נוירובלסטים, שהיו הנתונים המבטיחים הראשונים על נוירוגנזה לאחר הלידה1. עם זאת, השימוש והזיהוי של thymidine-H3 רמז על השימוש ברדיואקטיביות, אשר יכול להזיק לאנשים המנהלים אותו. המאמץ הראשון שבחן את ההתאמה של אימונוהיסטוכימיה של BrdU בחקר ההתרבות, ההגירה והמקור של תאים במערכות העצבים הופיע בשנת 1988 על ידי מילר ונובאקובסקי3. בשנת 1998, מאמר שפורסם על ידי אריקסון ועמיתיו הראה כי נוירונים חדשים הודגמו לאחר המוות במוח הבוגר האנושי של מטופלים שהוזרקו להם 5-Bromo-2′-deoxyuridine (BrdU)4. חולים אלה קיבלו את זריקת BrdU (250 מ"ג תוך ורידי) כדי לסמן את הצמיחה של גידולים4. טכניקה זו אומצה למודלים של בעלי חיים. הכנסת שיטות אלה סימנה אבן דרך עבור התחום שכן זה איפשר גילוי של תאים חדשים שנוצרו ללא שימוש בתרכובות רדיואקטיביות. הליך זה הפך לסטנדרט הזהב למדידת התפשטות תאים בנישות מוח בוגרות כדי לקדם מחקר נוסף בתחום.
המגבלה של הטכניקה האנלוגית של תימידין היא שהיא אינה מאפשרת קביעת זהות תאית עבור התאים החדשים שנוצרו. עם זאת, אימונוהיסטוכימיה מאפשרת לנו לבצע טכניקת תיוג כפולה או משולשת של אותו תא, אשר מאמתת את גורלם התאי של התאים החדשים שנוצרו ואפילו את שלבי ההתבגרות שלהם, מה שמוביל לאבולוציה נוספת של השדה. שיטה זו אופיינה כדי להבדיל תאים חדשים שנוצרו לתוך גליה, נוירונים לא מובחנים, או תא גרגירי בוגר לחלוטין, ואפילו כדי לקבוע אם הם משתתפים באופן פעיל במעגלים. פריצת דרך נוספת בתחום הייתה השימוש במודלים מהונדסים לזיהוי תאים לא מובחנים בתחום ה-nestin. העכברים המהונדסים של nestin-GFP מבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (GFP), שנמצא תחת שליטתו של מקדם ה-nestin. נסטין הוא נימה ביניים המאופיינת בתאי אב5. העכברים המהונדסים של nestin-GFP אפשרו להם לקבוע שלבים התפתחותיים מוקדמים המעורבים בנוירוגנזה6. עם זאת, מגבלה משמעותית היא היכולת לשמור על מושבת עכברים מהונדסים מסוג nestin-GFP בתנאים מיוחדים במתקן מעבדה שהופך לחסכוני עבור קבוצות מדעיות מסוימות, במיוחד אלה ממדינות מתפתחות.
לטכניקות שהוזכרו לעיל יש יתרונות וחסרונות. עם זאת, זיהוי של תאים מתרבים על ידי אימונוהיסטוכימיה (IHC) והאפשרות לבצע טכניקת תיוג כפולה או משולשת על ידי אימונופלואורסצנציה כדי לזהות את שלב ההבשלה של התא או את גורל התא מייצג את הדרך האפשרית ביותר למדוד נוירוגנזה בוגרת, עד כה. תהליך הזיהוי באמצעות אימונוהיסטוכימיה מורכב מתיוג חלבונים, תחום חלבונים או נוקלאוטידים עם נוגדן ספציפי המאפשר את זיהוים המכונה נוגדן ראשוני. זה האחרון מוכר על ידי הנוגדן המשני, המסומן בכרומוגן (למשל, חזרת פרוקסידאז) או פלואורוכרום (למשל, FITC) יחד עם הנוגדן המשני. מיקרוסקופים יכולים לזהות גם כרומוגנים וגם אותות פלואורוכרומטים. באמצעות IHC, ניתן לזהות חלבוני ממברנה, חלבוני שלד או רכיבים גרעיניים כגון BrdU. מצד שני, BrdU ניתן למצוא בגרעין התא שכן הוא משולב בדנ"א במהלך S-phase על ידי תחרות. לכן, שלב מכריע הוא דנטורציה של דנ"א עם HCl, אשר פותחת קשרי דנ"א כדי לאפשר לנוגדן BrdU גישה ל-BrdU בתוך הדנ"א. זה חיוני כדי לדעת כי BrdU קיים בריכוז רווי בעכברים ובסרום חולדות במשך 15 ו 60 דקות בהתאמה, לאחר ניהול intraperitoneal, ולאחר מכן יורד במהירות לרמות בלתי ניתנות לגילוי ב 60 ו 120 דקות בהתאמה7.
כאן אנו מתארים ארבע טכניקות IHC שונות אך קשורות זו לזו: זיהוי עקיף כרומוגני באמצעות תגובת פרוקסידאז חזרת (HRP) עם DAB (3,3'-diaminobenzidine) הגברת אות sans (שלב 4.1), הגברה של קומפלקס אבידין-ביוטין (ABC) (שלב 4.1), זיהוי אימונופלואורסצנציה עקיפה ללא הגברת אות (שלב 4.4) והגברת סטרפטאווידין-ביוטין (LSAB) (שלב 4.3). לכל שיטה יש יתרונות וחסרונות והיא יכולה להיות שימושית עבור דרישות רקמות ספציפיות (ראה טבלה 1). החלטנו לעקוב אחר שיטות ICH עקיפות בשל מחירן הזול והפשטות שלהן כדי לבצע שינויים משיטות זיהוי כרומוגניות לפלואורסצנטיות בעת שימוש בנוגדנים ראשוניים לא מצומדים. גישת תוכנית המענה ההומניטרי היא שיטת IHC נפוצה בשל המחיר הזול שלה, היציבות הגבוהה, שיעור התחלופה הגבוה והזמינות המלאה של המצעים. עם זאת, אנו ממליצים להשתמש בבקרה חיובית כדי לוודא ששיטת ההכתמה פועלת במדויק ולהשתמש בבקרה שלילית כדי לבדוק את תפקוד הנוגדנים ביעילות. חיסונים מרובים או שיטות IHC מרובות (ראה שלב 6) הם כלים רבי עוצמה לרכישת כמויות גדולות של נתונים מקטע הרקמה בניסוי יחיד. טכניקה זו חשובה במיוחד כאשר הזמינות של דגימות מוגבלת. יתרון נוסף הוא האפשרות לזהות בו זמנית חלבונים ספציפיים המתבטאים יחד באותו חלל תאי תוך שמירה על שלמות הרקמות. מולטיפלקס מאפשר להכתים סמנים שונים המתבטאים בשלבי שגשוג ספציפיים (למשל, nestin, GFAP, DCX, Ki-67), ומאפשר לנו להגיע למחקר התפשטות ובידול מפורט יותר8. חשוב לבחור נוגדנים התואמים לטכניקת הקיבוע המשמשת למניעת תגובתיות צולבת. אנו ממליצים לבדוק כל נוגדן חדש (כולל BrdU) בנפרד כדי להתאים ולחדד את השיטה. לאחר מכן, הציגו את הכתם הרציף הכפול, ולבסוף, התחילו את תהליך החיסון בו זמנית כאשר השיטה הרציפה נשלטת לחלוטין. חשוב לבחור נוגדנים משניים מתאימים לשיטה זו.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>שיטת</td>
			<td>שיטה ספציפית</td>
			<td>יתרונות</td>
			<td>חסרונות</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">שיטת איתור עקיף</td>
			<td>תגובת פרוקסידאז עם DAB</td>
			<td>1. רגישות גבוהה יותר משיטת הגילוי הישיר והפלואורסצנציה העקיפה. 2. עמידות גבוהה יותר לפוטו-הלבנה מאשר פלואורוכרומים. 3. עלות נמוכה יותר משיטת זיהוי פלואורסצנציה</td>
			<td>1. קשה לריבוב עם פחות צבעים צבעוניים. 2. מסובך עבור מטרות ביטוי משותף באותו מרחב סלולרי. 3. טווח דינמי מופחת עבור מטרות נדירות ושופעות בו-זמנית על אותה רקמה.</td>
		</tr><tr><td>פלואורסצנציה</td>
			<td>1. הטוב והקל ביותר לריבוב עם יותר צבעים צבעוניים. 2. הטוב ביותר עבור מטרות מבוטאות באותו מרחב סלולרי. 3. טווח דינמי טוב יותר עבור מטרות נדירות ושופעות בו זמנית על אותה רקמה. 4. אין צעדים נוספים.</td>
			<td>1. רגישות נמוכה יותר מתגובת הפרוקסידאז העקיפה בשיטת DAB. 2. התנגדות חלשה ל-Photobleaching לאורך זמן. 3. יקר יותר.</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">שיטת הגברת אות</td>
			<td>קומפלקס אבידין-ביוטין (ABC)</td>
			<td>1. רגישות גבוהה יותר משיטת האיתור הישירה והעקיפה. 2. צמצם את הרקע</td>
			<td>1. שלבים נוספים. 2. יקר יותר מאשר לא הגברה.</td>
		</tr><tr><td>עם התווית סטרפטאווידין-ביוטין (LSAB)</td>
			<td>1. רגישות גבוהה יותר משיטת האיתור הישירה והעקיפה. 2. חדירת רקמות משמעותית יותר משיטת ABC. 3. צמצם את הרקע</td>
			<td>1. שלבים נוספים. 2. יקר יותר משיטת ABC.</td>
		</tr><tr><td>לא שיטת הגברה נוספת</td>
			<td>1. עלות נמוכה יותר. 2. אין צעדים נוספים. 3. אידיאלי למטרות שופעות גבוהות.</td>
			<td>1. רגישות נמוכה יותר: בעייתית ללא מטרות בשפע.</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: יתרונות/חסרונות של טכניקות IHC. טבלה זו מציגה את היתרונות/חסרונות של שיטות גילוי עקיפות: תגובת פרוקסידאז עם (3,3'-diaminobenzidine) DAB ופלואורסצנציה; ושיטות להגברת אותות: קומפלקס אבידין-ביוטין (ABC), שכותרתו סטרפטאווידין-ביוטין (LSAB), ולא שיטת הגברה נוספת.
תמונה ברזולוציה גבוהה היא בסיסית לביצוע ניתוח נכון ולהצגת התוצאות. ישנן שתי גישות לשיפור הרזולוציה: 1) שימוש בעיצוב מיקרוסקופ טוב יותר (למשל, קונפוקל, מולטיפוטון) או 2) היפוך מספרי של תהליך הטשטוש כדי לשפר תמונות באמצעות deconvolution9. למרבה הצער, מיקרוסקופיה קונפוקלית אינה משתלמת בשל העלויות הגבוהות של הציוד ושירות10 שלה. מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי רחב שדה והפירוק שלאחר מכן של תמונות z-stack מספקים חלופה מתאימה בעלות נמוכה למיקרוסקופיה קונפוקלית 8,9. כפי שצוין לעיל, מטרת הדה-קונבולוציה היא לשחזר את האות המקורי שהושפל על ידי מערכת הרכישה9, על ידי הפחתת טשטוש, אובך מחוץ למיקוד ועיוות המוצגים בתמונה המתקבלת על ידי מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי או קונפוקלי באמצעות אלגוריתמי הסרה מתמטיים10. ניתן למדל מתמטית את התמונה המטושטשת הנרכשת כתוצאה מסיבוב העצמים הנצפים באמצעות פונקציית התפשטות נקודה תלת-ממדית (PSF). PSF היא תבנית עקיפה תיאורטית של נקודות האור הנפלטות מדגימת הרקמה ונאספות על ידי המיקרוסקופ. קובץ PSF נוצר עם התנאים הספציפיים של כל תמונה, כגון מרווח תאי CCD של המצלמה, מקדם השבירה של המדיה שבה נעשה שימוש, הצמצם המספרי של העדשה האובייקטיבית, אורך גל הפליטה של הפלואורופור, גדלי התמונה, מספר התמונות בשיטת העיבוד z-stack והרווח ביניהן (ראה מפרט טכני בטבלה 2). במילים אחרות, קובץ PSF מסכם את ההשפעות של מערך ההדמיה על תצפיות המיקרוסקופ9. עם זאת, אנו משתמשים בתוסף התלת-ממד PSF עקיפה (https://imagej.net/Diffraction_PSF_3D) כדי ליצור קובץ PSF ספציפי משלנו עבור כל תמונת z-stack. תמונות Z-stack הן סדרה של מקטעים אופטיים שעברו דיגיטציה מעומקים מוגדרים (ציר z) באותו מיקום XY של השקופית. מחשב אוסף את המידע המתקבל ממישור המיקוד על-ידי הקצאה מחדש של אותות שמקורם בעצמים הממוקמים במישורי מוקד אחרים. כדי ליצור z-stack תמונות, יש צורך לצלם תמונות משכבות ממוקדות שונות של השקופיות (לדוגמה, עשר תמונות שונות של אותו אזור XY בכל עומק של 1 מיקרומטר). לאחר מכן, אנו משתמשים בתוכנת מיקרוסקופיה המסופקת על ידי היצרן או פיג'י כדי ליצור z-stack או תמונה תלת-ממדית. התוצאה תהיה קובץ תמונה בערימה אחת (לדוגמה, עשר תמונות עם מוקדים שונים). ישנם מספר כלים ופתרונות תוכנה ספציפיים ללקוח, כגון תוכנת קוד פתוח למיקרוסקופיה של פירוק. אנו נציג את הפלטים של תהליך הדה-קונבולוציה באמצעות DeconvolutionLab29 שהוא תוסף פיג'י11 (התפלגות של ImageJ12). פירוק פעולה יעזור לשפר את הרזולוציה של מיקרוגרפים סופיים (ראו איור 1B,C ). למידע נוסף והדרכה, אנו ממליצים בחום לקרוא את הפניה13.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig01.jpg"> איור 1: תמונה מייצגת של דה-קונבולוציה תלת-ממדית עבור ערוצי צבע מרובים. (A) DG בהגדלה נמוכה. (B) תמונות z-stack המקוריות לכל אחד מהערוצים ולתמונה הממוזגת. (C) תמונות z-stack מפורקות בתלת-ממד עבור כל ערוץ והתמונה הממוזגת. המוח הזה היה מהחולדה שהייתה חלק מקבוצת הפעילות הגופנית. נעשה שימוש בשיטת ההגברה של סטרפטאווידין-ביוטין (LSAB). הוא הראה נוגדן מצומד של Cy3 סטרפטווידין לציון BrdU (אדום), DAPI ככתם נגדי (כחול), וחלבון חומצי פיברילרי גליאלי (GFAP) כסמן אסטרוגליאלי (ירוק). ML = שכבה מולקולרית; GCL = שכבת תא גרעינית; SGZ = אזור תת-גרנולרי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
מטרת עבודה זו היא לספק תיאור מפורט של השלבים להשגת תוצאות חיוביות ומוצלחות עם חיסון ולרשום צעדים נפוצים במחקרים מבוססי BrdU, ללא שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי. צביעת BrdU היא טכניקה הדורשת מספר שלבים שיש לעקוב אחריהם בזהירות כדי להשיג כתם מוצלח. סטנדרטיזציה של טכניקות צביעה אלה אורכת בדרך כלל חודשים והיא דורשת זמן ומשאבים. ציפינו שמאמר זה יוכל לספק מידע לקבוצות המתחילות בתחום זה על ידי צמצום הזמן והשגיאות.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENT PREPARATION AND SETUP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donor Horse Serum</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>S0900</td>
			<td>Blocking and incubation solutions in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde reagent grade, crystalline (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>toxic, flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746436-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, monobasic</td>
			<td>J.T Bker</td>
			<td>3246-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sacarose</td>
			<td>J.T Baker</td>
			<td>4072-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Meyer</td>
			<td>2365-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td>Corrisive, to calibrate pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phophate Dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9763-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-x 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THYMIDINE ANALOGUE BRDU ADMINISTRATION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Bromo-2&#8242;-deoxyuridine, BrdU</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9285</td>
			<td>toxic (mutagenic, teratogenic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23&#8211;27G hypodermic needle</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution</td>
			<td>PiSA</td>
			<td>30130032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 1 mL</td>
			<td>NIPRO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TISSUE PREPARATION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-ml polypropylene conical tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-ml polypropylene conical tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guillotine</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome Cryostat</td>
			<td>MICROM</td>
			<td>HM525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netwell 15 mm polyester mesh membrane inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3477</td>
			<td>pre-loaded in 12-well culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netwell plastic 12-well carrier kit</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3520</td>
			<td>for 15 mm polyester mesh membrane inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netwell plastic 6-well carrier kit</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>7553-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>IKA</td>
			<td>ROKCER 3D Digital</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMMUNOSTAINING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td>1%, Light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit (with Nickel), 3,3&#8217;-diaminobenzidine</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>carcinogenic, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydochloric Acid</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>9535-05</td>
			<td>Corrosive, to calibrate pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide, 50%</td>
			<td>Meyer</td>
			<td>5375-1L</td>
			<td>Toxic, oxidative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASTAIN&#174; Elite&#174; ABC Kit Peroxidase (HRP)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td>enzymatic, avidin/biotin based amplification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HPA056030</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-BrdU antibody produced in Mouse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2531</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-065-151</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, HRP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>G-21040</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG (whole molecule), TRITC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5393</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed, FITC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F-2765</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Cy3</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SA-1300</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAGING AND ANALYSIS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell Computer Company</td>
			<td>T8P8T-7G8MR-4YPQV-96C2F-7THHB</td>
			<td>For controlling and monitoring protocols&#8217; processes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD-camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UC50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSens Standard software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>cellSens Standard Edition</td>
			<td>Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-pressure 130 W mercury arc lamp</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-HGLGPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low autofluorescence immersion oil</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MOIL-30 Type F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover-glasses (VWR, cat no 48404 454; 24&#160; 60 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (VWR, cat no 48323-185; 76&#160; 26 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-FBW filter cube</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-FBW</td>
			<td>excitation 460 - 495 nm, dichroic mirror 505 nm, suppression 510 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-FGW filter cube</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-FGW</td>
			<td>excitation 530 - 550 nm, dichroic mirror 570 nm, suppression 575 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-FUW filter cube</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-FUW</td>
			<td>excitation 340 - 490 nm, dichroic mirror 410 nm, suppression 420 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemistry techniques to analyze cellular proliferation and neurogenesis in rats using the thymidine analog brdu

אחד הדברים החשובים ביותר בתחום של נוירוגנזה בהיפוקמפוס בוגר (AHN) הוא זיהוי התאים החדשים שנוצרו. זיהוי חיסוני של אנלוגים של תימידין (כגון 5-Bromo-2'-deoxyuridine (BrdU)) היא טכניקה סטנדרטית המשמשת להדמיה של תאים חדשים אלה שנוצרו. לכן, BrdU מוזרק בדרך כלל בבעלי חיים קטנים באופן תוך-צפקי, כך שהאנלוגיה של תימידין משולבת בחלוקת תאים במהלך סינתזת DNA. הגילוי מתבצע על ידי ניתוח אימונוהיסטוכימי של פרוסות המוח. כל קבוצת מחקר שהשתמשה בטכניקה זו יכולה להעריך שהיא דורשת תשומת לב מיוחדת לפרטים הקטנים כדי להשיג כתם מוצלח. לדוגמה, שלב חשוב הוא דנטורציה של דנטורציה של דנ"א עם HCl, המאפשרת לו להגיע לגרעין התא כדי להכתים אותו. עם זאת, הדו"חות המדעיים הקיימים מתארים מעט מאוד צעדים כאלה בפירוט. לכן, סטנדרטיזציה של הטכניקה היא מאתגרת עבור מעבדות חדשות מכיוון שזה יכול לקחת כמה חודשים כדי להניב תוצאות חיוביות ומוצלחות. מטרת עבודה זו היא לתאר ולפרט את השלבים להשגת תוצאות חיוביות ומוצלחות של טכניקת החיסון, בפירוט בעת עבודה עם התימידין האנלוגי BrdU. הפרוטוקול כולל הכנה והתקנה של ריאגנטים, מתן אנלוגי של תימידין במכרסם, פרפוזיה של שריר הלב, הכנת רקמות, תגובה אימונוהיסטוכימית של פרוקסידאז, שימוש בקומפלקס אבידין-ביוטין, אימונופלואורסנציה, צביעה נגדית, הדמיית מיקרוסקופיה ואנליזת תאים.

השיטות שתוארו לעיל יושמו כדי לכמת תאי יילוד בהיפוקמפוס של חולדות בוגרות לאחר פעילות גופנית רצונית, בניגוד לקבוצת ביקורת ללא כל פעילות גופנית נוספת. השתמשנו בהיפוקמפוס של חולדה לאחר הלידה כבקרה חיובית. חולדות זכרים בני 3 חודשים היו תחת פרוטוקול פעילות גופנית מרצון (גלגל אינסופי) במשך שבעה ימים. ביום השישי הוזרקו לחולדות BrdU (קטע 2), וכל 12 שעות לאחר מכן עד שלוש זריקות מלאות. כדי להשלים שלוש חלוקות מחזור תאים, בעלי החיים הושפעו באופן טרנסקרדי (סעיף 3) 8 שעות לאחר הזרקת BrdU האחרונה. אותו הליך שימש בחודות בנות שלושה חודשים שלא עברו פעילות גופנית כדי לשמש כבקרה השוואתית. כבקרה חיובית, גורי חולדות בני יום אחד (יום 1 לאחר הלידה) הוזרקו עם BrdU פעם אחת, כפי שתואר בסעיף 2 לעיל. יום לאחר ההזרקה (יום 2 לאחר הלידה), גורים הומתו, וראשיהם היו שקועים בתמיסת PFA, כפי שמתואר בשלב 3.4. חולדות בוגרות הרדימו עמוקות (שלב 3.1), עברו טרנסקרדיאליות, כפי שמתואר בשלב 3.2. המוחות נותחו ופוסט-מקובעים (שלב 3.4). המוחות נחתכו ל-40 מיקרומטר (שלב 3.5). המקטעים עובדו עבור אימונוהיסטוכימיה של BrdU, כמתואר בשלב 4.
השתמשנו בתגובת פרוקסידאז חזרת עם DAB IHC להכתמה (שלב 4.1) וספירת תאים חיוביים ל-BrdU ב-DG. איור 5 מראה מקטע DG עם תאים המסומנים ב-BrdU. איור 5C,D מראה חלק מייצג של מקטע DG בהגדלה גבוהה יותר. תאים מסומנים הראו כתמים כהים עזים, אשר סומנו בחצים. הכניסה מציגה את המספרים הממוצעים של תאים מסומנים בקבוצות הניסוי והביקורת (תאים חיוביים שנספרו כפול שישה כמתואר בשלב 8.1). מבחן t של סטודנט חשף הבדלי מובהקות בין מספר התאים החיוביים ל-BrdU (t(10) = 2.704, p = 0.0222). קבוצת הביקורת שלא עברה פעילות גופנית הראתה 2,040 ± 314 תאים (n = 6 חולדות). לשם השוואה, קבוצת הפעילות הגופנית הראתה בממוצע 3,606 ± 486 (n = 6 חולדות) תאים חיוביים ל-BrdU. כפי שנצפה, חשיפה לפעילות גופנית מגבירה תאים חיוביים ל-BrdU. לכן, תוצאות אלה עולות בקנה אחד עם תוצאות מדווחות אחרות המראות כי פעילות גופנית הגבירה את התפשטות התאים בפיתול המשונןהבוגר 17.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig03.jpg"> איור 3: דוגמאות למורפולוגיה שונה של גרעין תא המסומן ב-BrdU. BrdU הוא סמן סינתזת DNA המתייג את הגרעין. באזור ההיפוקמפוס, לגרעינים החיוביים ל-BrdU הייתה צורה סגלגלה למחצה הממוקמת באזור התת-גרגירי של הפיתול המשונן. מכיוון ש-BrdU משולב על ידי תחרות, לכמות המשולבת עבור כל תא תהיה וריאציה שתבוא לידי ביטוי מאוחר יותר באופן שבו הגרעין יודמי. (A) תמונת אימונופלואורסצנציה. (B) מוצגת תמונה המשתמשת בתגובת פרוקסידאז ללא שיטת הגברה נוספת. חצים צהובים מראים ממצאים ואותות לא ספציפיים. חצים שחורים או לבנים מציגים תאי BrdU+ . 1 – גרעין מתויק במלואו, גרעינים סגלגלים למחצה צבעוניים מאוד. 2 – גרעינים עם נקודות, גבול הגרעינים מסומן ויש לו בתוך כמה נקודות. 3 – גרעינים עם מעט נקודות, גבול הגרעינים מסומנים ויש בתוכם מספר קטן של נקודות. 4 – גרעין קטן הוא תאים אפשריים בשלב התמיינות שונה אך עדיין חלק מהגומחה. 5 – אשכולות הם תאים מקדימים בחלוקה, ולכן ניתן לראות מספר תאים יחד בקבוצות מעובות. בתוך קבוצות אלה, הספירה חייבת להיעשות בזהירות רבה במיוחד כדי למנוע תיוג שגוי של תאים חיוביים. חיצים אדומים מראים את הגרעין שמתחת לחלוקה שיכול להתבלבל כתא בודד. כל תא מוקף בתיבה וניתן להבחין בו במישור ציר Z בזמן אמת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig04.jpg"> איור 4: תמונת RGB מייצגת לערוצים בודדים ולערוצים ממוזגים. התמונה העליונה מציגה את תמונת z-stack המקורית, והתמונה התחתונה מציגה את תמונת z-stack התלת-ממדית. (A) הגדלה נמוכה של DG. (B) תמונת RGB לכל ערוץ, ו- (C) תמונה ממוזגת RGB. זה היה מוח מקבוצת הביקורת. אימונופלואורסצנציה שימשה ללא שיטת הגברה נוספת. BrdU (אדום), DAPI ככתם נגדי (כחול), ו- GFAP (חלבון חומצי פיברילרי) כסמן אסטרוגליאלי (ירוק). ML = שכבה מולקולרית; GCL = שכבת תא גרעינית; SGZ = אזור תת-גרנולרי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig05.jpg"> איור 5: מקטע DG מייצג עם תאים מסומנים BrdU (כהה עז) עבור כל קבוצת ניסוי. תגובת הפרוקסידאז שימשה בשיטת ההגברה המורכבת אבידין-ביוטין-פרוקסידאז. (א, ב) הצג הגדלה נמוכה של ה- DG, ו- (C, D) הצג את אזור התיבה בהגדלה גבוהה יותר. לוחות A ו- C הם רקמות מקבוצת הפעילות הגופנית, לוחות B ו- D הם מקבוצת הביקורת. הכניסה מציגה את המספרים הממוצעים של תאים מסומנים בקבוצות הפעילות הגופנית והביקורת (תאים חיוביים שנספרו כפול שישה כמתואר בשלב 8.1). ML = שכבה מולקולרית; GCL = שכבת תא גרעינית; SGZ = אזור תת-גרני; חצים מציינים תאי BrdU+ . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
סרטון 1: סרטון המציג מיקוד שונה של תאים חיוביים לאורך ציר z המפוזר בשכבות שונות. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61483/VIDEO_1.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.</a>
סרטון 2: סרטון המציג מוקד שונה של אשכולות תאים חיוביים לאורך ציר z המפוזרים בשכבות שונות. לנוע באיטיות על ציר z כדי לכמת את כל כמה גרעינים המשלבים צביר. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61483/VIDEO_2.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>סוג מיקרוסקופ:</td>
			<td colspan="5">מיקרוסקופ אפיפלואורסצנציה אולימפוס BX53</td>
		</tr><tr><td>מקור אור:</td>
			<td colspan="5">מנורת קשת כספית בלחץ גבוה 130 W (U-HGLGPS)</td>
		</tr><tr><td>רכישת תוכנה:</td>
			<td colspan="5">סנסורים סלולריים סטנדרטיים</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">ערכות מסננים:</td>
			<td colspan="2">מספר קטלוגי</td>
			<td>טווח עירור</td>
			<td>מראה דיכרומטית</td>
			<td>טווח דיכוי</td>
		</tr><tr><td colspan="2">U-FUW</td>
			<td>340 - 490 ננומטר</td>
			<td>410 נאנומטר</td>
			<td>420 נאנומטר</td>
		</tr><tr><td colspan="2">U-FBW</td>
			<td>460 - 495 ננומטר</td>
			<td>505 נאנומטר</td>
			<td>510 נאנומטר</td>
		</tr><tr><td colspan="2">U-FGW</td>
			<td>530 - 550 ננומטר</td>
			<td>570 נאנומטר</td>
			<td>575 נאנומטר</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">מצלמה:</td>
			<td colspan="2">מודל:</td>
			<td colspan="3">מצלמת CCD UC50</td>
		</tr><tr><td colspan="2">טווח ספקטרלי:</td>
			<td colspan="3">290 – 1000 ננומטר</td>
		</tr><tr><td colspan="2">גודל שבב CCD:</td>
			<td colspan="3">2/3 אינץ', 2588 (רוחב *7) X 1960 (גובה *8) פיקסלים</td>
		</tr><tr><td colspan="2">גודל פיקסלים:</td>
			<td colspan="3">3.4 X 3.4 מיקרומטר</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">פלואורוכרום:</td>
			<td colspan="2">שם</td>
			<td>עירור אורך גל (nm)</td>
			<td>פליטה *3 אורך גל (ננומטר)</td>
			<td>צבע פליטה</td>
		</tr><tr><td colspan="2">4, 6-דיאמידינו-2-פניל-אינדול הידרוכלוריד (DAPI)</td>
			<td>345</td>
			<td>455</td>
			<td>כחול</td>
		</tr><tr><td colspan="2">טטרה-מתילרהודאמין-איזותיוציאנט (TRITC)</td>
			<td>541</td>
			<td>572</td>
			<td>אדום</td>
		</tr><tr><td colspan="2">פלואורסצין-איזותיוציאנט (FITC)</td>
			<td>494</td>
			<td>519</td>
			<td>ירוק</td>
		</tr><tr><td colspan="2">סי3</td>
			<td>552</td>
			<td>565</td>
			<td>אדום</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">הרכבה בינונית ושמן טבילה:</td>
			<td colspan="3">שם</td>
			<td colspan="2">מדד השבירה של התקשורת *1</td>
		</tr><tr><td colspan="3">אוויר (שום דבר בין המגלשה לעדשה)</td>
			<td colspan="2">1.00029</td>
		</tr><tr><td colspan="3">מדיום הרכבה נגד פעימה עם DAPI</td>
			<td colspan="2">1.45</td>
		</tr><tr><td colspan="3">מדיום הרכבה פרמאונט</td>
			<td colspan="2">1.519</td>
		</tr><tr><td colspan="3">שמן טבילה אוטופלואורסצנטי נמוך (MOIL-30 Type F)</td>
			<td colspan="2">1.518</td>
		</tr><tr><td rowspan="6">עדשת הגדלה (תוכנית פלואוריט)</td>
			<td>הגדלה</td>
			<td>צמצם מספרי (NA) *2</td>
			<td>רזולוציה (מיקרומטר)</td>
			<td>מרווח בין פיקסלים בתמונה (nm) *5</td>
			<td>מרווח פרוסות ציר Z (ננומטר) *6</td>
		</tr><tr><td>פי 4</td>
			<td>0.13</td>
			<td>2.12</td>
			<td>850</td>
			<td>3000</td>
		</tr><tr><td>פי 10</td>
			<td>0.3</td>
			<td>0.92</td>
			<td>340</td>
			<td>3000</td>
		</tr><tr><td>פי 20</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.55</td>
			<td>27 שניות</td>
			<td>2000</td>
		</tr><tr><td>פי 40</td>
			<td>0.75</td>
			<td>0.37</td>
			<td>85</td>
			<td>1000</td>
		</tr><tr><td>פי 100</td>
			<td>1.3</td>
			<td>0.21</td>
			<td>34</td>
			<td>1000</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 2: מפרטי הגדרת מיקרוסקופ ודרישות יצירת קבצים של פונקציית התפשטות נקודה (PSF). ישנם 11 חריצים בחלון תוסף PSF 3D עקיפה כדי ליצור את קובץ PSF. כל חריץ מתואר כך: *1 - אינדקס שבירה של המדיה: אינדקס שבירה עבור התווך שבין השקופית לעדשה (למשל, אוויר = 1.00029). *2 - מפתח צמצם נומרי: NA של העדשה בשימוש (יש לתקן אותה כאשר נעשה שימוש במדיית טבילה אחרת והעדשה הוקצתה). *3 - אורך גל: אורך גל פליטה מרבי של פלואורוכרום (ננומטר). *4 - סטייה כדורית אורכית: 0.00. *5 - מרווח בין פיקסלים בתמונה: גודל פיקסל CCD (nm)/הגדלה (לדוגמה, עדשת 3.4 מיקרומטר ו-100X, 3400/100 = 34 ננומטר). *6 - מרחק בין תמונות ציר Z. *7 - רוחב: הזן את רוחב התמונה לפירוק בפיקסלים. *8 - גובה: הזן את גובה התמונה כדי לפרק אותה בפיקסלים. *9 - עומק, פרוסות: מספר התמונות בערימת z. *10 - נורמליזציה: סכום ערכי הפיקסלים = 1. *11 - כותרת: השם הרצוי לקובץ PSF. הקובץ צריך להתאים לתמונת z-stack הייחודית הנתונה.

Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemistry Techniques to Analyze Cellular Proliferation and Neurogenesis in Rats Using the Thymidine Analog BrdU at JoVE.com

Immunohistochemistry Techniques to Analyze Cellular Proliferation and Neurogenesis in Rats Using the Thymidine Analog BrdU

מאמר זה מציג ארבע מהטכניקות הנפוצות ביותר להדמיית תאים חיוביים של BrdU למדידת נוירוגנזה בוגרת בחולדות. עבודה זו כוללת הוראות להכנת מגיבים, ניהול אנלוגי של תימידין, פרפוזיה של שריר הלב, הכנת רקמות, תגובה אימונוהיסטוכימית של פרוקסידאז, אימונופלואורסצנציה, הגברת אותות, צביעה נגדית, הדמיית מיקרוסקופיה וניתוח תאים.

טכניקות אימונוהיסטוכימיה לניתוח התפשטות תאים ונוירוגנזה בחולדות באמצעות BrdU אנלוגי של תימידין

One of the most important things in the field of adult hippocampal neurogenesis (AHN) is the identification of the newly generated cells. The ...

Research

JoVE Journal

Biology

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

Neurogenesis קליפתיים: מעבר מן ההתקדמות מעבדה כדי Cell טיפולים מבוססי

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

אימונוהיסטוכימיה: מדורים פרפין שימוש ABC Vectastain קיט מ וקטור Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

אימונוהיסטוכימיה על סעיפים פרפין של האפידרמיס עכבר באמצעות נוגדנים פלורסנט

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

תסיסנית הזחל NMJ אימונוהיסטוכימיה

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection טכניקות לימוד מיטוזה ב תסיסנית melanogaster סינסיציאלי עובריים

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

הצמד תיקון וטכניקות זלוף עבור לימוד תעלות יונים מתבטא Xenopus ביציות

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

בדיקה של החלבונים Bound לינוקא DNA בתאי יונקים באמצעות טכניקת BrdU-שבב חריץ-מערבי

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

באמצעות מכשירים microfluidic למדוד פנוטיפים תוחלת החיים סלולר בתאי שמרים ניצני יחיד

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

טכניקות כדי להשרות ולכמת סלולר הזדקנות

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

ניהול פשוטה ויעילה והדמיה של Microparticles במערכת הדם של דגים קטנים באמצעות הזרקת כליות

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...