Name: immunohistochemistry techniques to analyze cellular proliferation and neurogenesis in rats using the thymidine analog brdu
Uploaded: 2020-09-09T14:30:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemistry Techniques to Analyze Cellular Proliferation and Neurogenesis in Rats Using the Thymidine Analog BrdU at JoVE.com

Vi vil gjerne takke Miguel Burgos og Gustavo Lago for å gi teknisk assistanse. Vi ønsker også å takke Dr. Clorinda Arias, Dr. Karla Hernandez og Dr. Oscar Galicia for deres vennlige støtte i å gi reagenser og materiale. Vi takker også División de Investigación y Posgrado fra Universidad Iberoamericana Ciudad de México for å gi finansiering til utførelsen av dette arbeidet og for å dekke videoproduksjonsutgifter.

<ol>
	<li>Altman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+new+neurons+formed+in+the+brains+of+adult+mammals.">Are new neurons formed in the brains of adult mammals.</a> Science. 135 (3509), 1127-1128 (1962).</li><li>Altman, J., Das, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoradiographic+and+histological+evidence+of+postnatal+hippocampal+neurogenesis+in+rats.">Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats.</a> The Journal of Comparative Neurology. 124 (3), 319-335 (1965).</li><li>Miller, M. W., Nowakowski, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bromodeoxyuridine-immunohistochemistry+to+examine+the+proliferation,+migration+and+time+of+origin+of+cells+in+the+central+nervous+system.">Use of bromodeoxyuridine-immunohistochemistry to examine the proliferation, migration and time of origin of cells in the central nervous system.</a> Brain Research. 457 (1), 44-52 (1988).</li><li>Eriksson, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+adult+human+hippocampus.">Neurogenesis in the adult human hippocampus.</a> Nature Medicine. 4 (11), 1313-1317 (1998).</li><li>Filippov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpopulation+of+nestin-expressing+progenitor+cells+in+the+adult+murine+hippocampus+shows+electrophysiological+and+morphological+characteristics+of+astrocytes.">Subpopulation of nestin-expressing progenitor cells in the adult murine hippocampus shows electrophysiological and morphological characteristics of astrocytes.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 23 (3), 373-382 (2003).</li><li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus.">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends in Neurosciences. 27 (8), 447-452 (2004).</li><li>Matia&#353;ov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+determination+of+5-bromo-2'-deoxyuridine+pharmacokinetics+in+blood+serum+after+intraperitoneal+administration+to+rats+and+mice.">Flow cytometric determination of 5-bromo-2'-deoxyuridine pharmacokinetics in blood serum after intraperitoneal administration to rats and mice.</a> Histochemistry and Cell Biology. 142 (6), 703-712 (2014).</li><li>Von Bohlen Und Halbach, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistological+markers+for+proliferative+events,+gliogenesis,+and+neurogenesis+within+the+adult+hippocampus.">Immunohistological markers for proliferative events, gliogenesis, and neurogenesis within the adult hippocampus.</a> Cell and Tissue Research. 345 (1), 1-19 (2011).</li><li>Sage, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DeconvolutionLab2:+An+open-source+software+for+deconvolution+microscopy.">DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy.</a> Methods. 115, 28-41 (2017).</li><li>Manz, W., Arp, G., Schumann-Kindel, G., Szewzyk, U., Reitner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widefield+deconvolution+epifluorescence+microscopy+combined+with+fluorescence+in+situ+hybridization+reveals+the+spatial+arrangement+of+bacteria+in+sponge+tissue.">Widefield deconvolution epifluorescence microscopy combined with fluorescence in situ hybridization reveals the spatial arrangement of bacteria in sponge tissue.</a> Journal of Microbiological Methods. 40 (2), 125-134 (2000).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Abr&#224;moff, M. D., Magalh&#227;es, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+with+imageJ.">Image processing with imageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 36-41 (2004).</li><li>. 2D and 3D Fluorescence Deconvolution Manual Available from: <a target="_blank" href="https://pages.stolaf.edu/wp-content/uploads/sites/803/2016/12/Giannini_Giannini_Deconvolution_Manual_20161215.p">https://pages.stolaf.edu/wp-content/uploads/sites/803/2016/12/Giannini_Giannini_Deconvolution_Manual_20161215.p</a> (2016)</li><li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrdU+immunohistochemistry+for+studying+adult+neurogenesis:+Paradigms,+pitfalls,+limitations,+and+validation.">BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation.</a> Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).</li><li>Revilla, V., Jones, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryostat+sectioning+of+brains.">Cryostat sectioning of brains.</a> International Review of Neurobiology. 47, 61-70 (2002).</li><li>Amaral, D. G., Scharfman, H. E., Lavenex, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dentate+gyrus:+fundamental+neuroanatomical+organization+(dentate+gyrus+for+dummies).">The dentate gyrus: fundamental neuroanatomical organization (dentate gyrus for dummies).</a> Progress in brain research. 163, 3-22 (2007).</li><li>Eadie, B. D., Redila, V. A., Christie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voluntary+exercise+alters+the+cytoarchitecture+of+the+adult+dentate+gyrus+by+increasing+cellular+proliferation,+dendritic+complexity,+and+spine+density.">Voluntary exercise alters the cytoarchitecture of the adult dentate gyrus by increasing cellular proliferation, dendritic complexity, and spine density.</a> Journal of Comparative Neurology. 486 (1), 39-47 (2005).</li><li>Leal-Galicia, P., Romo-Parra, H., Rodr&#237;guez-Serrano, L. M., Buenrostro-J&#225;uregui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+adult+hippocampal+neurogenesis+exerted+by+sexual,+cognitive+and+physical+activity:+An+update.">Regulation of adult hippocampal neurogenesis exerted by sexual, cognitive and physical activity: An update.</a> Journal of Chemical Neuroanatomy. 101, 101667 (2019).</li><li>Gould, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+widespread+is+adult+neurogenesis+in+mammals.">How widespread is adult neurogenesis in mammals.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 481-488 (2007).</li><li>Ngwenya, L. B., Peters, A., Rosene, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+and+electron+microscopic+immunohistochemical+detection+of+bromodeoxyuridine-labeled+cells+in+the+brain:+Different+fixation+and+processing+protocols.">Light and electron microscopic immunohistochemical detection of bromodeoxyuridine-labeled cells in the brain: Different fixation and processing protocols.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (7), 821-832 (2005).</li><li>Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+and+multiple+labeling+with+antibodies+from+the+same+host+species+to+study+adult+hippocampal+neurogenesis.">Immunohistochemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52551 (2015).</li><li>Tuttle, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+detection+of+two+thymidine+analogues+(CldU+and+IdU)+in+primary+tissue.">Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (46), e2166 (2010).</li><li>Tischler, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple+immunohistochemical+staining+for+bromodeoxyuridine+and+catecholamine+biosynthetic+enzymes+using+microwave+antigen+retrieval.">Triple immunohistochemical staining for bromodeoxyuridine and catecholamine biosynthetic enzymes using microwave antigen retrieval.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 1-4 (1995).</li><li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+studying+adult+neurogenesis:+Insights+and+recent+developments.">Protocols for studying adult neurogenesis: Insights and recent developments.</a> Regenerative Medicine. 2 (1), 51-62 (2007).</li><li>Leuner, B., Glasper, E. R., Gould, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymidine+analog+methods+for+studies+of+adult+neurogenesis+are+not+equally+sensitive.">Thymidine analog methods for studies of adult neurogenesis are not equally sensitive.</a> Biosystems. 517 (2), 123-133 (2010).</li><li>Magavi, S. S., MacKlis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+newborn+cells+by+BrdU+labeling+and+immunocytochemistry+in+vivo.">Identification of newborn cells by BrdU labeling and immunocytochemistry in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 438, 335-343 (2008).</li><li>Kempermann, G., Gast, D., Kronenberg, G., Yamaguchi, M., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+determination+and+long-term+persistence+of+adult-generated+new+neurons+in+the+hippocampus+of+mice.">Early determination and long-term persistence of adult-generated new neurons in the hippocampus of mice.</a> Development. , 391-399 (2003).</li><li>Ramos-Vara, J. A., Beissenherz, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+immunohistochemical+methods+using+two+different+antigen+retrieval+methods+on+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues:+Experience+with+63+markers.">Optimization of immunohistochemical methods using two different antigen retrieval methods on formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: Experience with 63 markers.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 12 (4), 307-311 (2000).</li><li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+methods+of+immunohistochemistry.">Principles and methods of immunohistochemistry.</a> Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).</li><li>Wojtowicz, J. M., Kee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrdU+assay+for+neurogenesis+in+rodents.">BrdU assay for neurogenesis in rodents.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Voksen neurogenese er en prosess som forekommer hyppigst i nisjer av voksne nevrale forløperceller som har potensial til å generere nye nevroner gjennom hele levetiden. Bromodeoxyuridine (BrdU) merking er mye brukt i immunologi for å karakterisere antall nylig genererte celler i en voksen hjerne. BrdU vil hovedsakelig bli innlemmet i celler i diskrete hjernegrupper (nevrogene soner). Disse cellene er lokalisert i sub-ventrikulær sone (SVZ), dentate gyrus av hippocampus - mellom hilus og granulære celler kjent som sub-granulær sone (SGZ) 1,2,18. Videre er det forskjellige hjernegrupper preget av lavere proliferativ kapasitet i voksen alder, inkludert hypothalamus, striatum, neocortex og amygdala19. Som nevnt tidligere er BrdU-farging den mest brukte metoden for nevrogeneseforskning hos voksne for å oppdage celleproliferasjon. Bruken av BrdU som markør har imidlertid begrensninger og fallgruver. Den første er at BrdU er en cellesyklusmarkør. Derfor må dobbel eller trippel farging utføres for å identifisere cellens skjebne og inkludere cellemarkører for å oppdage det spesifikke utviklingsstadiet av cellene som er merket. En annen bekymring om BrdU er at det er en giftig og mutagen løsning som endrer DNA-stabilitet, kan endre cellulær funksjon og cellesykluser. Det bør tas hensyn til tidligere informasjon når man bestemmer seg for å følge en administrasjonsprotokoll og administrasjonsdoser (50\u2012600 mg/kg). En annen viktig funksjon er at BrdU er en DNA-syntesemarkør, ikke en celleproliferasjonsmarkør14. Derfor er det relevant å skille celleproliferasjon fra andre hendelser som DNA-reparasjon, abortiv cellesyklus-re-entry og genduplisering. Forskeren må følge hensiktsmessige kontroller for å sikre riktig bruk av BrdU. For en mer detaljert diskusjon om disse problemene og begrensningene, anbefaler vi å gjennomgå Taupins arbeid14. Standardiseringsprosessen av en immunhistokjemiprotokoll kan være langsom og utfordrende. I dette arbeidet har vi presentert alle de generelle trinnene for å administrere en vellykket IHC-protokoll. Vi anbefaler imidlertid at hver forskningsgruppe tester og evaluerer vev, antistoffer og forhold på forhånd. Tester og evalueringer må utføres med minst tre forskjellige nivåer av inkubasjoner, vasketrinn og styrker for hvert antistoff og vev som testes. Vi anbefaler også at forskere gjennomgår tilleggsprotokoller for å kunne velge den beste som oppfyller spesifikke behov og krav 20,21,22,23,24,25.
Som nevnt tidligere innebærer prosedyren flere trinn og metodologiske hensyn som ofte brukes og nevnes i vitenskapelige artikler, som senere vil bli diskutert. Vi anbefaler at forskere velger antistoffene nøye og riktig når det gjelder teknikk, budsjett, utstyr, oppsett og hovedforskningsmål. Antistoffer må testes med samme type vev som senere skal testes i forsøket. Vi anbefaler også bruk av et antistoff som ble testet for samme formål (IHC) (dvs. ikke bare i western blot eller flowcytometri teknikker) for å teste kompatibiliteten med fikseringsteknikken. Ulike ruter kan brukes til å administrere BrdU-farging, som intraperitoneal injeksjon, intraperitoneal infusjon, oralt inntak eller intraventrikulær infusjon (for en mer detaljert beskrivelse av hver teknikk, se referanse26). Hvis den intraperitoneale injeksjonen er valgt, må du sørge for at BrdU administreres i bukhulen og unngår tarmområdet. Siden tarmen har flere celler i duplisering som kan utmatte BrdU før den kommer til hjernen som vil påvirke antall merkede celler. Det er avgjørende å få tynne seksjoner siden de tillater bedre penetrasjon av løsninger. Koronale skiver på 40 μm tykke ble kuttet rostro-kaudalt og ble overført til en 24-brønns cellekulturplate, etter den stereologiske prosedyren foreslått av Kempermann et al.27. Immunhistokjemien kan utføres med vev montert på lysbilder eller som frittflytende seksjoner. Siden BrdU ligger dypt i cellekjerner, tillater det penetrasjon av løsninger i frittflytende seksjoner som gir bedre resultater og bedre tilgang til interesseområdet. Det er viktig å åpne DNA-bindinger (DNA-denaturering) for å gi den primære anti-BrdU-antistofftilgangen. I dette arbeidet utførte vi disse spesifikke prosedyrene ved bruk av HCI-inkubasjon. På den annen side tillot prosessen med å blokkere uspesifikke epitoper en mer nøyaktig identifisering av cellesignal.
Den gode membranpermeabiliseringen gjør at antistoffene kan trenge ordentlig inn i interesseområdet. Tilsetning av en permeabilizer som Triton X-100 til PBS ++ og PBS + løsninger forbedrer membranpermeabilisering. Både PBS- og Tris-bufrede saltvannsreagenser (TBS) kan brukes i denne protokollen. Når det gjelder budsjett, kan TBS være relativitet billigere enn PBS. PBS kan imidlertid forstyrre antifosfatantistoffer og hemme alkaliske fosfatasekonjugerte antistoffer, så unngå bruk av PBS hvis målet er posttranslasjonelt modifisert ved fosforylering (dvs. fosforylert). Vi brukte PBS til dette arbeidet, og vi fant ut at vevsvasketrinn ga et mer spesifikt signal. Vi anbefaler også forskere å utføre minst tre vaskesykluser ved hjelp av enten TBS o PBS. Løsningene må være nyforberedt. Antigenuthenting (AR) er en metode som er ment å redusere tap av antigenitet forårsaket av fiksering som endrer strukturen til tertiære og kvartære antigener. Denne reduksjonen gjør antigener uoppdagelige av antistoffer28,29. Den varmeinduserte epitopinnhentingen (HIER) brukt i denne protokollen forsøkte å reversere de kjemiske reaksjonene mellom formaldehyd og proteiner ved høy temperatur eller sterk alkalisk hydrolyse (med andre bufferløsninger som EDTA pH 8,5 eller Tris pH 9,5). Det er viktig å teste nye antistoffer med forskjellige AR-protokoller for å sammenligne resultater og velge den beste for protokollen. Dette siste trinnet kan være valgfritt i en vanlig protokoll; Vi behandlet imidlertid vev med en antigeninnhentingsprotokoll for å gi bedre resultater for denne protokollen.
Det er avgjørende å velge riktig endelig kontrastfarge og motbesetningsteknikk med tanke på den primære fargefargen og metoden som brukes til å gjøre en ikke-fargingsstruktur synlig og unngå å maskere den primære fargefargen fra immunreaksjonen. For fluorescensmikroskopien er DAPI (4', 6-diamidino-2-fenylidol) en veldig populær kjerne- og kromosommotvekt som avgir blå fluorescens (absorpsjon: 360 nm, utslipp: 460 nm) ved binding til AT-regioner av DNA. DAPI-holdig monteringsmedium er tilgjengelig og er enkelt å bruke; Dette gir utmerket signaloppbevaring for bildeopptak. For peroksidreaksjonen var IHC tilgjengelig i forskjellige alternativer som kresylfiolett, hematoksylin, nøytral rød eller metylgrønn farging. For flere immunostaining-teknikker er det avgjørende å velge et kompatibelt antistoff med fikseringsteknikken som brukes for å unngå kryssreaktivitet30. Når problemer og komplikasjoner med enkelt farging er løst, administrere en annen farge farging som anses nødvendig. Det er avgjørende å kontrollere den uspesifikke bindingen mellom de sekundære antistoffene. Dette kan gjøres ved å mette de primære antistoffene før du bruker et sekundært antistoff produsert i samme vertsart av de primære antistoffene. For eksempel, når du bruker anti-mus produsert i kanin og anti-kanin produsert i geit sekundære antistoffer, må anti-kanin produsert i geit antistoff brukes før anti-mus produsert i kanin antistoff. Når den sekvensielle metoden domineres helt, kan den samtidige immunostaining-prosessen startes. I denne metoden er det viktig å velge sekundære antistoffer på riktig måte. Ideelt sett må alle disse antistoffene komme fra samme vertsdyr for å unngå kryssreaktivitet. Vi anbefaler å kjøre en positiv kontroll for å bekrefte at fargemetoden fungerer nøyaktig i postnatal hippocampusvev (rikelig nevrogenese rundt denne alderen). Hvis det positive kontrollvevet viser fargeproblemer, gjennomgå og gå over prosedyren, gjør korreksjoner og justeringer, og gjenta til en god farging er produsert. Kjør deretter en negativ kontroll for å teste at antistoffet fungerer riktig ved å utelate eller erstatte et bestemt primært antistoff med normalt serum (samme art som det primære antistoffet). Som nevnt i innledningen er bildedekonvolusjon et kraftig verktøy og gir et alternativ når et konfokalt mikroskop ikke er tilgjengelig. Det kan bruke bildedekonvolusjonen på alle bilder som er oppnådd ved hjelp av overført lysfelt, bredfeltfluorescens og konfokal fluorescensmikroskopi. Det endelige formålet med bildedekonvolusjon er å rekonstruere det opprinnelige signalet om at innsamlingssystemet forverres10.
Oppsummert er identifiseringen av de nylig genererte cellene visualisert ved immundeteksjon av tymidinanalog BrdU en komplisert, men kraftig teknikk. Dette arbeidet er et forsøk på å hjelpe forskere, spesielt innen voksen hippocampal neurogenese, for å kvantifisere nye celler mer nøyaktig. Vi håper at denne innsatsen har vært nyttig for det vitenskapelige samfunnet og gjør det lettere å finjustere studiet av celleproliferasjon ved immunhistokjemi-teknikken.

Ideen om at nye nevroner genereres i den voksne menneskelige hjerne gjennom hele levetiden har fascinert det vitenskapelige samfunn i flere tiår. Kunnskapen om at hjernen genererer nye nevroner gjennom hele levetiden ble oppnådd gjennom påvisning av celler under deling 1,2. Påvisning av nylig genererte nevroner i den voksne hjernen ble først identifisert ved intrakranialt injeksjon av tritiert tymidin (tymidin-H3) hos rotter og påvisning av celler i cellesyklusen ved autoradiogram 1,2. Celledeling av glia og tilstedeværelse av neuroblaster ble rapportert, som var de første lovende dataene om postnatal neurogenese1. Likevel innebar bruk og deteksjon av tymidin-H3 bruk av radioaktivitet, noe som kan være skadelig for de som klarer det. Den første innsatsen som undersøkte egnetheten til BrdU immunhistokjemi i studiet av spredning, migrasjon og opprinnelse av celler i nervesystemet dukket opp i 1988 av Miller og Nowakowski3. I 1998 viste et papir publisert av Eriksson og kolleger at nye nevroner ble visualisert postmortem i den menneskelige voksne hjernen til pasienter injisert med 5-Bromo-2′-deoksyuridin (BrdU)4. Disse pasientene fikk BrdU-injeksjonen (250 mg intravenøst) for å merke veksten av svulster4. Denne teknikken ble vedtatt i dyremodeller. Innføringen av disse metodene markerte en milepæl for feltet siden dette tillot påvisning av nylig genererte celler uten bruk av radioaktive forbindelser. Denne prosedyren ble gullstandarden for å måle celleproliferasjon i voksne hjernenisjer for å fremme videre forskning på feltet.
Begrensningen av tymidinanalogteknikken er at den ikke tillater bestemmelse av cellulær identitet for de nylig genererte cellene. Imidlertid tillater immunhistokjemi oss å utføre dobbelt- eller trippelmerkingsteknikk av samme celle, som validerer den cellulære skjebnen til de nylig genererte cellene og til og med deres modningsstadier, noe som fører til videre utvikling av feltet. Denne metoden ble karakterisert for å skille nylig genererte celler til glia, utifferentierte nevroner eller en fullt moden granulær celle, og til og med for å avgjøre om de deltar aktivt i kretsene. Et annet gjennombrudd i feltet var bruken av transgene modeller for å identifisere utifferentierte celler under domenet til nestin. Nestin-GFP-transgene mus uttrykker et forbedret grønt fluorescerende protein (GFP), som er under kontroll av nestinpromotoren. Nestin er et mellomliggende filament preget av stamceller5. De nestin-GFP transgene musene fikk lov til å etablere tidlige utviklingstrinn involvert i nevrogenese6. En betydelig begrensning er imidlertid å kunne opprettholde en nestin-GFP transgen muskoloni under spesielle forhold i et laboratorieanlegg som blir kostnadseffektivt for enkelte vitenskapelige grupper, spesielt de fra utviklingsland.
Teknikkene nevnt ovenfor har fordeler og ulemper. Imidlertid representerer identifisering av prolifererende celler ved immunhistokjemi (IHC) og muligheten til å utføre dobbelt- eller trippelmerkingsteknikk ved immunfluorescens for å identifisere cellemodningsstadium eller celleskjebne den mest gjennomførbare måten å måle voksen neurogenese på, så langt. Identifikasjonsprosessen ved bruk av immunhistokjemi består av merking av proteiner, proteindomene eller nukleotider med et spesifikt antistoff som gjør det mulig å gjenkjenne dem kjent som primært antistoff. Sistnevnte gjenkjennes av det sekundære antistoffet, som er merket med et kromogen (f.eks. Pepperrotperoksidase) eller et fluorokrom (f.eks. FITC) kombinert med det sekundære antistoffet. Mikroskoper kan oppdage både kromogener og fluorokromsignaler. Ved hjelp av IHC er det mulig å identifisere membranproteiner, cytoskelettproteiner eller kjernefysiske komponenter som BrdU. På den annen side kan BrdU finnes i den cellulære kjernen siden den er innlemmet i DNA under S-fase ved konkurranse. Derfor er et avgjørende skritt DNA-denatureringen med HCl, som åpner DNA-bindinger for å gi BrdU-antistoffet tilgang til BrdU i DNA. Det er viktig å vite at BrdU er tilstede i en mettet konsentrasjon i mus og rotteserum i henholdsvis 15 og 60 minutter, etter intraperitoneal administrering, og deretter faller raskt til uoppdagelige nivåer ved henholdsvis 60 og 120 minutter7.
Her beskriver vi fire forskjellige, men nært beslektede IHC-teknikker: kromogen indirekte deteksjon ved bruk av pepperrotperoksidase (HRP) reaksjon med DAB (3,3'-diaminobenzidin) uten signalforsterkning (trinn 4.1), avidin-biotinkompleks (ABC) forsterkning (trinn 4.1), indirekte immunfluorescensdeteksjon uten signalforsterkning (trinn 4.4) og merket streptavidin-biotin (LSAB) amplifisering (trinn 4.3). Hver metode har fordeler og ulemper og kan være nyttig for spesifikke vevskrav (se tabell 1). Vi bestemte oss for å følge indirekte ICH-metoder på grunn av deres overkommelige priser og enkelhet for å gjøre endringer fra kromogene til fluorescerende deteksjonsmetoder ved bruk av ukonjugerte primære antistoffer. HRP-tilnærmingen er en ofte brukt IHC-metode på grunn av overkommelig pris, høy stabilitet, høy omsetningshastighet og substratenes fulle tilgjengelighet. Likevel anbefaler vi å bruke en positiv kontroll for å bekrefte at fargemetoden fungerer nøyaktig og bruk av negativ kontroll for å teste antistoffet fungerer effektivt. Flere immunostainings eller multiplex IHC-metoder (se trinn 6) er potente verktøy for å skaffe store mengder data fra vevsseksjonen i et enkelt eksperiment. Denne teknikken er spesielt viktig når tilgjengeligheten av prøver er begrenset. En annen fordel er muligheten til samtidig å identifisere spesifikke proteiner som er uttrykt i samme cellulære rom, samtidig som vevets integritet bevares. Multiplex gjør det mulig å flekke forskjellige markører uttrykt under spesifikke proliferative stadier (f.eks. Nestin, GFAP, DCX, Ki-67), slik at vi kan nå en mer detaljert sprednings- og differensieringsforskning8. Det er avgjørende å velge antistoffer som er kompatible med fikseringsteknikken som brukes for å unngå kryssreaktivitet. Vi anbefaler å teste hvert nytt antistoff (inkludert BrdU) individuelt for å justere og avgrense metoden. Deretter introduserer du den doble sekvensielle fargingen, og til slutt starter du den samtidige immunostaining-prosessen når den sekvensielle metoden er helt dominert. Det er avgjørende å velge passende sekundære antistoffer for denne metoden.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Metode</td>
			<td>Spesifikk metode</td>
			<td>Fordeler</td>
			<td>Ulemper</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Indirekte deteksjonsmetode</td>
			<td>Peroksidasereaksjon med DAB</td>
			<td>1. Høyere følsomhet enn direkte deteksjon og indirekte fluorescensmetode. 2. Høyere motstand mot fotobleking enn fluorokromer. 3. Lavere kostnad enn fluorescensdeteksjonsmetode</td>
			<td>1. Vanskelig for multipleksing med færre fargestoffer. 2. Komplisert for Co-uttrykte mål i samme mobilrom. 3. Redusert dynamisk område for samtidig knappe og høye mål på samme vev.</td>
		</tr><tr><td>Fluorescens</td>
			<td>1. Best og enklest for multipleksing med flere fargestoffer. 2. Best for Co-uttrykte mål i samme mobilrom. 3. Bedre dynamisk område for samtidig knappe og høye mål på samme vev. 4. Ingen ekstra trinn.</td>
			<td>1. Lavere følsomhet enn den indirekte peroksidasereaksjonen med DAB-metoden. 2. Svak motstand mot fotobleking over tid. 3. Dyrere.</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Metode for signalforsterkning</td>
			<td>Avidin-Biotin-komplekset (ABC)</td>
			<td>1. Høyere følsomhet enn den direkte og indirekte deteksjonsmetoden. 2. Reduser bakgrunnen</td>
			<td>1. Ytterligere trinn. 2. Dyrere enn ikke forsterkning.</td>
		</tr><tr><td>Merket streptavidin-biotin (LSAB)</td>
			<td>1. Høyere følsomhet enn den direkte og indirekte deteksjonsmetoden. 2. Mer betydelig vevspenetrasjon enn ABC-metoden. 3. Reduser bakgrunnen</td>
			<td>1. Ytterligere trinn. 2. Dyrere enn ABC-metoden.</td>
		</tr><tr><td>Ikke ytterligere forsterkningsmetode</td>
			<td>1. Lavere kostnader. 2. Ingen ekstra trinn. 3. Ideell for høye tallrike mål.</td>
			<td>1. Lavere følsomhet: problematisk uten rikelig mål.</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 1: Fordeler/ulemper ved IHC-teknikker. Denne tabellen viser fordeler/ulemper ved indirekte deteksjonsmetoder: Peroksidasereaksjon med (3,3'-diaminobenzidin) DAB og fluorescens; og signalforsterkningsmetoder: avidin-biotinkompleks (ABC), merket streptavidin-biotin (LSAB), og ikke ytterligere forsterkningsmetode.
Et høyoppløselig bilde er grunnleggende for å utføre riktig analyse og presentere resultatene. Det er to tilnærminger for å forbedre oppløsningen: 1) bruk av et bedre mikroskopdesign (f.eks. Konfokal, multifoton) eller 2) numerisk invertering av uskarphetsprosessen for å forbedre bilder ved hjelp av dekonvolusjon9. Dessverre er konfokalmikroskopi ikke rimelig på grunn av de høye kostnadene ved utstyr og service10. Et bredfelt epifluorescensmikroskop og påfølgende dekonvolusjon av z-stack-bildene gir et passende, rimelig alternativ til konfokalmikroskopi 8,9. Som nevnt ovenfor er dekonvolusjonsmålet å gjenopprette det opprinnelige signalet som ble degradert av oppkjøpssystemet9, ved å redusere uskarphet, ufokusert tåke og forvrengning vist i bildet oppnådd ved epifluorescens eller konfokalmikroskop ved hjelp av matematiske fjerningsalgoritmer10. Det ervervede uskarpe bildet kan modelleres matematisk som et resultat av å konvoldere de observerte objektene med en 3D-punktspredningsfunksjon (PSF). PSF er et teoretisk diffraksjonsmønster av lyspunktene som sendes ut av vevsprøven og samles inn av mikroskopet. PSF-filen er opprettet med de spesifikke forholdene til hvert bilde, for eksempel kameraets CCD-celleavstand, brytningsindeks for mediet som brukes, den numeriske blenderåpningen til objektivlinsen, fluoroforens emisjonsbølgelengde, bildestørrelser, antall bilder i z-stack-behandlingsmetoden og mellomrommet mellom dem (se teknisk spesifikasjon i tabell 2). Med andre ord oppsummerer PSF-filen effekten av bildeoppsettet på mikroskopobservasjonene9. Vi bruker imidlertid diffraksjon PSF 3D Plugin (https://imagej.net/Diffraction_PSF_3D) for å lage vår egen spesifikke PSF-fil for hvert z-stack-bilde. Z-stack-bilder er en serie digitaliserte optiske seksjoner fra definerte dybder (z-aksen) på samme XY-plassering av lysbildet. En datamaskin samler informasjonen hentet fra fokusplanet ved å tilordne signaler som stammer fra objekter som befinner seg i andre fokalplan. For å lage z-stack-bilder er det nødvendig å ta bilder fra forskjellige fokuserte lag av lysbildene (f.eks. ti forskjellige bilder av det samme XY-området hver 1 μm dybde). Deretter bruker vi mikroskopi programvare levert av produsenten eller Fiji for å lage en z-stack eller 3D-bilde. Resultatet blir en enkelt stabelbildefil (f.eks. ti bilder med forskjellig fokus). Det finnes flere kundespesifikke verktøy og programvareløsninger, for eksempel åpen kildekode-programvare for dekonvolusjonsmikroskopi. Vi vil vise utgangene fra dekonvolusjonsprosessen ved hjelp av DeconvolutionLab29 som er et Fiji11-plugin (distribusjon av ImageJ12). Dekonvolusjon vil bidra til å forbedre oppløsningen til endelige mikrografer (se figur 1B, C ). For ytterligere informasjon og instruksjon anbefaler vi på det sterkeste å lese referanse13.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig01.jpg"> Figur 1: Representativt bilde av 3D-dekonvolusjon for flere fargekanaler. (A) DG ved lav forstørrelse. (B) De opprinnelige z-stack-bildene for hver kanal og det sammenslåtte bildet. (C) 3D-dekonvoluterte z-stack-bilder for hver kanal og det sammenslåtte bildet. Denne hjernen var fra rotta som var en del av fysisk aktivitetsgruppe. Merket streptavidin-biotin (LSAB) amplifikasjonsmetode ble brukt. Det viste Cy3 streptavidin konjugert antistoff for å indikere BrdU (rød), DAPI som en counterstaining (blå) og glial fibrillary acidic protein (GFAP) som en astroglial markør (grønn). ML = molekylært lag; GCL = granulært cellelag; SGZ = subgranulær sone. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig01large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Formålet med dette arbeidet er å gi en detaljert beskrivelse av trinnene for å oppnå positive og vellykkede resultater med immunostaining og å liste opp vanlige trinn i BrdU-baserte studier, uten bruk av et konfokalt mikroskop. BrdU-farging er en teknikk som krever flere trinn som må følges nøye for å oppnå en vellykket flekk. Standardisering av disse fargeteknikkene tar vanligvis måneder og er tids- og ressurskrevende. Vi forventet at denne artikkelen kunne gi informasjon til gruppene som starter innenfor dette feltet ved å redusere tid og feil.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENT PREPARATION AND SETUP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donor Horse Serum</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>S0900</td>
			<td>Blocking and incubation solutions in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde reagent grade, crystalline (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>toxic, flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746436-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, monobasic</td>
			<td>J.T Bker</td>
			<td>3246-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sacarose</td>
			<td>J.T Baker</td>
			<td>4072-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Meyer</td>
			<td>2365-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td>Corrisive, to calibrate pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phophate Dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9763-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-x 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THYMIDINE ANALOGUE BRDU ADMINISTRATION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Bromo-2&#8242;-deoxyuridine, BrdU</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9285</td>
			<td>toxic (mutagenic, teratogenic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23&#8211;27G hypodermic needle</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution</td>
			<td>PiSA</td>
			<td>30130032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 1 mL</td>
			<td>NIPRO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TISSUE PREPARATION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-ml polypropylene conical tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-ml polypropylene conical tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guillotine</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome Cryostat</td>
			<td>MICROM</td>
			<td>HM525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netwell 15 mm polyester mesh membrane inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3477</td>
			<td>pre-loaded in 12-well culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netwell plastic 12-well carrier kit</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3520</td>
			<td>for 15 mm polyester mesh membrane inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netwell plastic 6-well carrier kit</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>7553-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>IKA</td>
			<td>ROKCER 3D Digital</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMMUNOSTAINING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td>1%, Light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit (with Nickel), 3,3&#8217;-diaminobenzidine</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>carcinogenic, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydochloric Acid</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>9535-05</td>
			<td>Corrosive, to calibrate pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide, 50%</td>
			<td>Meyer</td>
			<td>5375-1L</td>
			<td>Toxic, oxidative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASTAIN&#174; Elite&#174; ABC Kit Peroxidase (HRP)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td>enzymatic, avidin/biotin based amplification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HPA056030</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-BrdU antibody produced in Mouse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2531</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-065-151</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, HRP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>G-21040</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG (whole molecule), TRITC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5393</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed, FITC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F-2765</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Cy3</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SA-1300</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAGING AND ANALYSIS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell Computer Company</td>
			<td>T8P8T-7G8MR-4YPQV-96C2F-7THHB</td>
			<td>For controlling and monitoring protocols&#8217; processes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD-camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UC50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSens Standard software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>cellSens Standard Edition</td>
			<td>Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-pressure 130 W mercury arc lamp</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-HGLGPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low autofluorescence immersion oil</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MOIL-30 Type F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover-glasses (VWR, cat no 48404 454; 24&#160; 60 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (VWR, cat no 48323-185; 76&#160; 26 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-FBW filter cube</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-FBW</td>
			<td>excitation 460 - 495 nm, dichroic mirror 505 nm, suppression 510 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-FGW filter cube</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-FGW</td>
			<td>excitation 530 - 550 nm, dichroic mirror 570 nm, suppression 575 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-FUW filter cube</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-FUW</td>
			<td>excitation 340 - 490 nm, dichroic mirror 410 nm, suppression 420 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemistry techniques to analyze cellular proliferation and neurogenesis in rats using the thymidine analog brdu

En av de viktigste tingene innen voksen hippocampal neurogenese (AHN) er identifisering av de nylig genererte cellene. Immundeteksjon av tymidinanaloger (som 5-Bromo-2'-deoksyuridin (BrdU)) er en standardteknikk som brukes til å visualisere disse nylig genererte cellene. Derfor injiseres BrdU vanligvis i små dyr intraperitonealt, slik at tymidinanalogen blir innlemmet i delende celler under DNA-syntese. Deteksjon utføres ved immunhistokjemisk analyse av hjerneskiver. Hver forskningsgruppe som har brukt denne teknikken, kan forstå at det krever spesiell oppmerksomhet på små detaljer for å oppnå en vellykket flekk. For eksempel er et viktig skritt DNA-denaturering med HCl, som gjør det mulig å nå cellekjernen for å flekke den. De eksisterende vitenskapelige rapportene beskriver imidlertid svært få av slike trinn i detalj. Derfor er standardisering av teknikken utfordrende for nye laboratorier, da det kan ta flere måneder å gi positive og vellykkede resultater. Formålet med dette arbeidet er å beskrive og utdype trinnene for å oppnå positive og vellykkede resultater av immunostaining-teknikken i detalj når man arbeider med tymidinanalogen BrdU. Protokollen inkluderer reagensfremstilling og oppsett, administrering av tymidinanalog i en gnager, transkardial perfusjon, vevspreparasjon, peroksidaseimmunhistokjemisk reaksjon, bruk av avidin-biotinkompleks, immunfluorescens, motfarging, mikroskopiavbildning og celleanalyse.

Metodene beskrevet ovenfor ble brukt for å kvantifisere nyfødte celler i voksen rotte hippocampus etter frivillig fysisk aktivitet, i motsetning til en kontrollgruppe uten ekstra fysisk aktivitet. Vi brukte barselrotte hippocampus som en positiv kontroll. Hannrotter 3 måneder var under en frivillig fysisk aktivitetsprotokoll (endeløst hjul) i syv dager. På dag 6 ble rotter injisert med BrdU (avsnitt 2), og hver 12. time etter til tre komplette injeksjoner. For å fullføre tre cellesyklusdelinger ble dyrene transkardialt perfundert (avsnitt 3) 8 timer etter siste BrdU-injeksjon. Den samme prosedyren ble brukt på tre måneder gamle rotter som ikke gjennomgikk fysisk aktivitet for å bli brukt som en komparativ kontroll. Som positiv kontroll ble en dag gamle rottevalper (postnatal dag 1) injisert med BrdU én gang, som beskrevet i avsnitt 2 ovenfor. En dag etter injeksjonen (postnatal dag 2) ble avkom avlivet, og hodet ble nedsenket i PFA-oppløsning, som beskrevet i trinn 3.4. Voksne rotter ble dypt bedøvet (trinn 3.1), transkardialt perfundert, som beskrevet i trinn 3.2. Hjernene ble dissekert og postfiksert (trinn 3.4). Hjernen ble kuttet i 40 μm koronale seksjoner (trinn 3.5). Seksjoner ble behandlet for BrdU immunhistokjemi, som beskrevet i trinn 4.
Vi brukte pepperrotperoksidasereaksjon med DAB IHC for farging (trinn 4.1) og telling av BrdU-positive celler i DG. Figur 5 viser en DG-seksjon med BrdU-merkede celler. Figur 5C,D viser en representativ del av DG-delen ved høyere forstørrelse. Merkede celler viste intens mørk farging, som var merket med piler. Innfellingen viser gjennomsnittlig antall merkede celler i eksperiment- og kontrollgruppene (telles positive celler multiplisert med seks som beskrevet i trinn 8.1). Student t-test viste signifikansforskjeller mellom antall BrdU-positive celler (t(10) = 2,704, p = 0,0222). Kontrollgruppen som ikke gjennomgikk fysisk aktivitet viste 2 040 ± 314 celler (n = 6 rotter). Til sammenligning viste gruppen med fysisk aktivitet i gjennomsnitt 3 606 ± 486 (n = 6 rotter) BrdU-positive celler. Som observert øker eksponeringen for fysisk aktivitet BrdU-positive celler. Derfor er disse resultatene i samsvar med andre rapporterte resultater som viser at fysisk aktivitet økte cellulær proliferasjon i den voksne dentate gyrus17.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig03.jpg"> Figur 3: Eksempler på forskjellig morfologi av BrdU-merket cellekjerne. BrdU er en DNA-syntesemarkør som merker kjernen. I hippocampus-regionen hadde de BrdU-positive kjernene en semi-oval form plassert i dentate gyrus sub-granulær sone. Siden BrdU er inkorporert ved konkurranse, vil mengden innlemmet for hver celle ha en variasjon som senere vil bli reflektert i hvordan kjernen vil bli visualisert. (A) Immunfluorescensbilde. (B) Et bilde som bruker peroksidasereaksjon uten en ytterligere forsterkningsmetode presenteres. Gule piler viser artefakter og ikke-spesifikke signaler. Svarte eller hvite piler viser BrdU+-celler. 1 - Fullt arkivert kjerne, semi-ovale kjerner svært farget. 2 - Kjerner med prikker, grensen til kjernene er merket og har inne flere prikker. 3 – Kjerner med få prikker, grensen til kjernene er merket og har et lite antall prikker inni. 4 - Liten kjerne er mulige celler i et annet differensieringsstadium, men fortsatt en del av nisjen. 5 - Klynger er forløperceller under divisjon, derfor kan flere celler sammen i kondenserte grupper observeres. Innenfor disse gruppene må tellingen gjøres spesielt nøye for å unngå feilmerking av positive celler. Røde piler viser kjernen under deling som kan forveksles til å være en enkelt celle. Hver celle er innelukket i en boks og kan skilles i et Z-akseplan i sanntid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig03large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig04.jpg"> Figur 4: Representativt RGB-bilde for enkeltkanaler og sammenslåtte kanaler. Det øverste bildet viser det opprinnelige z-stack-bildet, og det nedre bildet viser det 3D-dekonvoluterte z-stack-bildet. (A) Lav forstørrelse av DG. (B) RGB-bilde for hver kanal, og (C) RGB-sammenslått bilde. Dette var en hjerne fra kontrollgruppen. Immunfluorescens ble brukt uten ytterligere amplifikasjonsmetode. BrdU (rød), DAPI som motvekt (blå) og GFAP (glial fibrillært surt protein) som astrogliamarkør (grønn). ML = molekylært lag; GCL = granulært cellelag; SGZ = subgranulær sone. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig04large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig05.jpg"> Figur 5: Representativ DG-seksjon med BrdU-merkede celler (intens mørk) for hver eksperimentell gruppe. Peroksidasereaksjonen ble brukt med avidin-biotin-peroksidasekompleksforsterkningsmetoden. (A, B) Vis en lav forstørrelse av DG, og (C, D) viser boksområdet ved høyere forstørrelse. Panel A og C er vev fra den fysiske aktivitetsgruppen, panelene B og D er fra kontrollgruppen. Innfellingen viser gjennomsnittlig antall merkede celler i fysisk aktivitet og kontrollgrupper (telles positive celler multiplisert med seks som beskrevet i trinn 8.1). ML = molekylært lag; GCL = granulært cellelag; SGZ = subgranulær sone; pilene angir BrdU+-celler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig05large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Video 1: Video som viser et annet fokus på positive celler langs z-aksen fordelt i forskjellige lag. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61483/VIDEO_1.avi" target="_blank">Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.</a>
Video 2: Video som viser et annet fokus på positive celleklynger langs z-aksen fordelt i forskjellige lag. Beveg deg sakte over z-aksen for å kvantifisere alle flere kjerner som integrerer en klynge. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61483/VIDEO_2.mp4" target="_blank">Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Mikroskop Type:</td>
			<td colspan="5">Epifluorescens mikroskop Olympus BX53</td>
		</tr><tr><td>Lyskilde:</td>
			<td colspan="5">Høytrykks 130 W kvikksølvbuelampe (U-HGLGPS)</td>
		</tr><tr><td>Oppkjøp Programvare:</td>
			<td colspan="5">CellSens Standard</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Filtre Sett:</td>
			<td colspan="2">Katalog nummer</td>
			<td>Eksitasjonsområde</td>
			<td>Dikromatisk speil</td>
			<td>Undertrykkelse Range</td>
		</tr><tr><td colspan="2">U-FUW</td>
			<td>340 - 490 nm</td>
			<td>410 nm</td>
			<td>420 nm</td>
		</tr><tr><td colspan="2">U-FBW</td>
			<td>460 - 495 nm</td>
			<td>505 nm</td>
			<td>510 nm</td>
		</tr><tr><td colspan="2">U-FGW</td>
			<td>530 - 550 nm</td>
			<td>570 nm</td>
			<td>575 nm</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Kamera:</td>
			<td colspan="2">Modell:</td>
			<td colspan="3">CCD-kamera UC50</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Spektral rekkevidde:</td>
			<td colspan="3">290 – 1000 nm</td>
		</tr><tr><td colspan="2">CCD chip størrelse:</td>
			<td colspan="3">2/3 tommer, 2588 piksler (bredde *7) X 1960 (høyde *8)</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Pixel Størrelse:</td>
			<td colspan="3">3,4 X 3,4 μm</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">Fluorokrom:</td>
			<td colspan="2">Navn</td>
			<td>Bølgelengde for eksitasjon (nm)</td>
			<td>Utslipp *3 Bølgelengde (nm)</td>
			<td>Utslipp Farge</td>
		</tr><tr><td colspan="2">4, 6-diamidino-2-fenyl-indol HCI (DAPI)</td>
			<td>345</td>
			<td>455</td>
			<td>Blå</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Tetrametylrhodamin-isotyocyanat (TRITC)</td>
			<td>541</td>
			<td>572</td>
			<td>Rød</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Fluorescein-isotiocyanat (FITC)</td>
			<td>494</td>
			<td>519</td>
			<td>Grønn</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Cy3</td>
			<td>552</td>
			<td>565</td>
			<td>Rød</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">Montering Medium og nedsenkningsolje:</td>
			<td colspan="3">Navn</td>
			<td colspan="2">Indeks for brytning av media * 1</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Luft (ingenting mellom lysbildet og linsen)</td>
			<td colspan="2">1.00029</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Antifade monteringsmedium med DAPI</td>
			<td colspan="2">1.45</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Permount monteringsmedium</td>
			<td colspan="2">1.519</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Lav autofluorescens nedsenkningsolje (MOIL-30 Type F)</td>
			<td colspan="2">1.518</td>
		</tr><tr><td rowspan="6">Forstørrelseslinse (Plan Fluorite)</td>
			<td>Forstørrelse</td>
			<td>Numerisk blenderåpning (NA) *2</td>
			<td>Oppløsning (μm)</td>
			<td>Bildepikselavstand (nm) *5</td>
			<td>Avstand mellom deler Z-aksen (nm) *6</td>
		</tr><tr><td>4X</td>
			<td>0.13</td>
			<td>2.12</td>
			<td>850</td>
			<td>3000</td>
		</tr><tr><td>10X</td>
			<td>0.3</td>
			<td>0.92</td>
			<td>340</td>
			<td>3000</td>
		</tr><tr><td>20X</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.55</td>
			<td>170</td>
			<td>2000</td>
		</tr><tr><td>40X</td>
			<td>0.75</td>
			<td>0.37</td>
			<td>85</td>
			<td>1000</td>
		</tr><tr><td>100X</td>
			<td>1.3</td>
			<td>0.21</td>
			<td>34</td>
			<td>1000</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 2: Spesifikasjoner for mikroskopoppsett og krav til oppretting av PSF-filer (Point Spread Function). Det er 11 spor i diffraksjon PSF 3D plugin-vinduet for å opprette PSF-filen. Hvert spor er beskrevet som følger: *1 - Brytningsindeks for mediet: brytningsindeks for mediet mellom lysbildet og objektivet (f.eks. luft = 1,00029). *2 - Numerisk blenderåpning: NA for objektivet som brukes (det må korrigeres når et annet nedsenkningsmedium brukes og objektivet ble tilordnet). *3 - Bølgelengde: Fluorokrom maksimal utslippsbølgelengde (nm). *4 - Langsgående sfærisk aberrasjon: 0,00. *5 – Bildepikselavstand: CCD-pikselstørrelse (nm)/forstørrelse (f.eks. 3,4 μm og 100X-objektiv, 3400/100 = 34 nm). *6 - Avstand mellom bilder Z-aksen. 7 - Bredde: Angi bredden på bildet som skal avvikles i piksler. *8 - Høyde: Angi høyden på bildet som skal dekonvolbles i piksler. 9 - Dybde, stykker: antall bilder i z-stacken. *10 – Normalisering: Summen av bildepunktverdier = 1. *11 – Tittel: Ønsket navn på PSF-filen. Filen skal samsvare med det unike gitte z-stack-bildet.

Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemistry Techniques to Analyze Cellular Proliferation and Neurogenesis in Rats Using the Thymidine Analog BrdU at JoVE.com

Immunohistochemistry Techniques to Analyze Cellular Proliferation and Neurogenesis in Rats Using the Thymidine Analog BrdU

Dette papiret presenterer fire av de vanligste teknikkene for å visualisere BrdU-positive celler for å måle voksen neurogenese hos rotter. Dette arbeidet inkluderer instruksjoner for reagensfremstilling, tymidinanalog administrering, transkardial perfusjon, vevspreparasjon, peroksidaseimmunhistokjemisk reaksjon, immunfluorescens, signalforsterkning, motfarging, mikroskopiavbildning og celleanalyse.

Immunhistokjemi teknikker for å analysere cellulær proliferasjon og neurogenese hos rotter ved bruk av tymidinanalog BrdU

One of the most important things in the field of adult hippocampal neurogenesis (AHN) is the identification of the newly generated cells. The ...

Research

JoVE Journal

Biology

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Undersøkelse av Proteiner Bundet til begynnende DNA i pattedyrceller Bruke BrdU-chip-Slot-vestlig Technique

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Ved hjelp av mikrofluid enheter for å måle levetid og Cellular fenotyper i enkelt spirende gjærceller

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

Teknikker for å indusere og kvantifisere Cellular Senescence

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

Enkel og effektiv administrasjon og visualisering av Microparticles i sirkulasjonssystemet av små fisk med nyre injeksjon

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...