Name: immunohistochemistry techniques to analyze cellular proliferation and neurogenesis in rats using the thymidine analog brdu
Uploaded: 2020-09-09T14:30:00
Duration: 8 min 37 s
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Gostaríamos de agradecer ao Sr. Miguel Burgos e Gustavo Lago pela prestação de assistência técnica. Também queremos agradecer à Dra. Clorinda Arias, à Dra. Karla Hernandez e ao Dr. Oscar Galicia por seu apoio gentil no fornecimento de reagentes e material. Agradecemos também à División de Investigación y Posgrado da Universidad Iberoamericana Ciudad de México por fornecer financiamento para a realização deste trabalho e por cobrir as despesas de produção de vídeo.

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Os autores não têm nada a revelar.

A neurogênese adulta é um processo que ocorre com mais frequência em nichos de células precursoras neurais adultas que têm o potencial de gerar novos neurônios ao longo de sua vida útil. A marcação com bromodeoxiuridina (BrdU) é amplamente utilizada em imunologia para caracterizar o número de células recém-geradas em um cérebro adulto. BrdU será incorporado principalmente em células de regiões cerebrais discretas (zonas neurogênicas). Essas células estão localizadas na zona subventricular (ZSV), o giro dentado do hipocampo, entre o hilo e as células granulares conhecidas como zona subgranular (ZG)1,2,18. Além disso, existem diferentes regiões cerebrais caracterizadas por uma menor capacidade proliferativa na idade adulta, incluindo o hipotálamo, estriado, neocórtex e amígdala19. Como mencionado anteriormente, a coloração BrdU é o método comumente usado para pesquisa de neurogênese adulta para detectar a proliferação celular. No entanto, o uso de BrdU como marcador tem limitações e armadilhas. A primeira é que BrdU é um marcador de ciclo celular. Portanto, a coloração dupla ou tripla deve ser realizada para identificar o destino celular e incluir marcadores celulares para detectar o estágio específico de desenvolvimento das células marcadas. Mais uma preocupação sobre o BrdU é que é uma solução tóxica e mutagênica que modifica a estabilidade do DNA pode alterar a função celular e os ciclos celulares. Deve-se considerar as informações prévias ao decidir seguir um protocolo de administração e doses de administração (50 a 1600 mg/kg). Outra característica crucial é que o BrdU é um marcador de síntese de DNA, não um marcador de proliferação celular14. Portanto, é relevante distinguir a proliferação celular de outros eventos, como um reparo de DNA, reentrada abortiva do ciclo celular e duplicação de genes. Os pesquisadores devem seguir os controles apropriados para garantir o uso apropriado do BrdU. Para uma discussão mais detalhada sobre esses problemas e limitações, recomendamos a revisão do trabalho de Taupin14. O processo de padronização de um protocolo de imuno-histoquímica pode ser lento e desafiador. Neste trabalho, apresentamos todas as etapas gerais para gerenciar um protocolo IHC bem-sucedido. No entanto, recomendamos que todos os grupos de pesquisa testem e avaliem tecidos, anticorpos e condições com antecedência. Testes e avaliações devem ser realizados com pelo menos três níveis diferentes de incubações, etapas de lavagem e dosagens para cada anticorpo e tecido testado. Recomenda-se também que os pesquisadores revisem protocolos adicionais para poder escolher o melhor que atenda às necessidades e requisitos específicos 20,21,22,23,24,25.
Como mencionado anteriormente, o procedimento envolve várias etapas e considerações metodológicas que são comumente utilizadas e mencionadas em artigos científicos, que serão discutidas posteriormente. Recomendamos que os pesquisadores escolham os anticorpos com cuidado e corretamente em termos de técnica, orçamento, equipamento, configuração e principal objetivo de pesquisa. Os anticorpos devem ser testados com o mesmo tipo de tecido que será posteriormente testado no experimento. Também recomendamos o uso de um anticorpo que foi testado para a mesma finalidade (IHC) (ou seja, não apenas em técnicas de western blot ou citometria de fluxo) para testar sua compatibilidade com a técnica de fixação. Diferentes vias podem ser usadas para administrar a coloração BrdU, como injeção intraperitoneal, infusão intraperitoneal, ingestão oral ou infusão intraventricular (para uma descrição mais detalhada de cada técnica, ver referência26). Se a injeção intraperitoneal for selecionada, certifique-se de que o BrdU é administrado na cavidade peritoneal, evitando a área do intestino. Uma vez que o intestino tem várias células em duplicação que podem esgotar o BrdU antes de chegar ao cérebro, o que afetará o número de células marcadas. É crucial obter seções finas, uma vez que permitem uma melhor penetração das soluções. Cortes coronais de 40 μm de espessura foram cortados rostro-caudalmente e transferidos para uma placa de cultura celular de 24 poços, seguindo o procedimento estereológico proposto por Kempermann et al.27. A imuno-histoquímica pode ser realizada com tecido montado em lâminas ou como seções flutuantes. Uma vez que o BrdU está localizado profundamente nos núcleos das células, permite a penetração de soluções em secções flutuantes livres, o que proporciona melhores resultados e melhor acesso à área de interesse. É importante abrir ligações de DNA (desnaturação do DNA) para permitir o acesso primário ao anticorpo anti-BrdU. Neste trabalho, realizamos esses procedimentos específicos com o uso da incubação de IHC. Por outro lado, o processo de bloqueio de epítopos inespecíficos permitiu uma identificação mais precisa do sinal celular.
A boa permeabilização da membrana permite que os anticorpos penetrem adequadamente na área de interesse. A adição de um permeabilizador como o Triton X-100 às soluções PBS++ e PBS+ melhora a permeabilização da membrana. Ambos os reagentes PBS e Tris-buffered saline (TBS) podem ser usados neste protocolo. Em termos de orçamento, o TBS poderia ser relatividade mais barato do que o PBS. No entanto, a PBS pode interferir com anticorpos antifosfato e inibir anticorpos conjugados com fosfatase alcalina, portanto, evite o uso de PBS se o alvo for pós-translacionalmente modificado por fosforilação (ou seja, fosforilado). Utilizamos o PBS para este trabalho e descobrimos que as etapas de lavagem de tecidos davam um sinal mais específico. Também recomendamos que os pesquisadores realizem pelo menos três ciclos de lavagem usando TBS ou PBS. As soluções devem ser preparadas na hora. A recuperação de antígenos (RA) é um método destinado a reduzir a perda de antigenicidade causada pela fixação que modifica a estrutura dos antígenos terciários e quaternários. Essa redução torna os antígenos indetectáveis por anticorpos28,29. A recuperação de epítopos induzida pelo calor (HIER) utilizada neste protocolo tentou reverter as reações químicas entre formaldeído e proteínas por alta temperatura ou forte hidrólise alcalina (com outras soluções tampão como EDTA pH 8,5 ou Tris pH 9,5). É essencial testar novos anticorpos com diferentes protocolos de RA para comparar os resultados e escolher o melhor para o protocolo. Esta última etapa pode ser opcional em um protocolo regular; no entanto, tratamos tecidos com um protocolo de recuperação de antígenos para fornecer melhores resultados para este protocolo.
É crucial selecionar a cor contrastante final correta e a técnica de contracoloração em consideração à cor de coloração primária e ao método usado para tornar visível uma estrutura não corante e evitar mascarar a cor de coloração primária da reação imune. Para a microscopia de fluorescência, o DAPI (4', 6-diamidino-2-fenilindol) é uma contramancha nuclear e cromossômica muito popular que emite fluorescência azul (absorção: 360 nm, emissão: 460 nm) ao se ligar a regiões AT do DNA. O meio de montagem contendo DAPI está disponível e é fácil de usar; isso fornece excelente retenção de sinal para aquisição de imagens. Para a reação de peróxido, a IHC estava disponível em diferentes opções, como violeta cresil, hematoxilina, vermelho neutro ou coloração verde metila. Para técnicas de imunocoloração múltipla, é crucial escolher um anticorpo compatível com a técnica de fixação utilizada para evitar a reatividade cruzada30. Quando problemas e complicações com coloração única forem resolvidos, administre outra coloração de cor, conforme considerado necessário. É crucial controlar a ligação inespecífica entre os anticorpos secundários. Isso pode ser feito saturando os anticorpos primários antes de usar um anticorpo secundário produzido na mesma espécie hospedeira dos anticorpos primários. Por exemplo, ao utilizar anti-rato produzido em coelho e anti-coelho produzido em anticorpos secundários de cabra, o anti-coelho produzido em anticorpo de cabra deve ser utilizado antes do anti-rato produzido em anticorpo de coelho. Quando o método sequencial é dominado completamente, o processo de imunocoloração simultânea pode ser iniciado. Neste método, é essencial escolher anticorpos secundários adequadamente. Idealmente, todos esses anticorpos devem vir do mesmo animal hospedeiro para evitar a reatividade cruzada. Recomendamos executar um controle positivo para confirmar que o método de coloração funciona com precisão no tecido pós-natal do hipocampo (neurogênese abundante em torno dessa idade). Se o tecido de controle positivo apresentar problemas de coloração, revise e reveja o procedimento, faça correções e ajustes e repita até que uma boa coloração seja produzida. Em seguida, execute um controle negativo para testar se o anticorpo funciona corretamente, omitindo ou substituindo um anticorpo primário específico por soro normal (mesma espécie que o anticorpo primário). Como mencionado na introdução, a deconvolução de imagem é uma ferramenta poderosa e fornece uma alternativa quando um microscópio confocal não está disponível. Ele pode aplicar a deconvolução da imagem a todas as imagens obtidas usando campo brilhante de luz transmitida, fluorescência de campo largo e microscopia de fluorescência confocal. O objetivo final da deconvolução da imagem é reconstruir o sinal original de que o sistema de aquisição se deteriora10.
Em resumo, a identificação das células recém-geradas visualizadas pela imunodetecção do BrdU análogo da timidina é uma técnica complicada, mas poderosa. Este trabalho é uma tentativa de ajudar os cientistas, particularmente no campo da neurogênese hipocampal adulta, a quantificar novas células com mais precisão. Esperamos que este esforço tenha sido útil para a comunidade científica e facilite o ajuste do estudo da proliferação celular pela técnica de imuno-histoquímica.

A ideia de que novos neurônios são gerados no cérebro humano adulto ao longo da vida tem fascinado a comunidade científica por décadas. O conhecimento de que o cérebro gera novos neurônios ao longo de sua vida útil foi alcançado por meio da detecção de células em divisão 1,2. A detecção de neurônios recém-gerados no cérebro adulto foi primeiramente identificada por injeção intracraniana de timidina tritiada (timidina-H3) em ratos e detecção de células no ciclo celular por auto-radiogramas 1,2. Foi relatada divisão celular da glia e presença de neuroblastos, o que foi o primeiro dado promissor sobre a neurogênese pós-natal1. No entanto, o uso e a detecção da timidina-H3 implicaram o uso de radioatividade, o que pode ser prejudicial para as pessoas que a gerenciam. O primeiro esforço examinando a adequação da imuno-histoquímica BrdU no estudo da proliferação, migração e origem das células no sistema nervoso apareceu em 1988 por Miller e Nowakowski3. Em 1998, um artigo publicado por Eriksson e colegas mostrou que novos neurônios foram visualizados post-mortem no cérebro adulto humano de pacientes injetados com 5-Bromo-2′-desoxiuridina (BrdU)4. Esses pacientes receberam a injeção de BrdU (250 mg por via intravenosa) para marcar o crescimento de tumores4. Essa técnica foi adotada em modelos animais. A introdução desses métodos marcou um marco para o campo, uma vez que permitiu a detecção de células recém-geradas sem o uso de compostos radioativos. Este procedimento tornou-se o padrão-ouro para medir a proliferação celular em nichos cerebrais adultos para promover mais pesquisas no campo.
A limitação da técnica analógica da timidina é que ela não permite a determinação da identidade celular para as células recém-geradas. No entanto, a imuno-histoquímica nos permite realizar a técnica de dupla ou tripla marcação de uma mesma célula, que valida o destino celular das células recém-geradas e até mesmo seus estágios de maturação, levando a uma maior evolução do campo. Este método foi caracterizado para diferenciar células recém-geradas em glia, neurônios indiferenciados ou uma célula granular totalmente madura, e até mesmo para determinar se eles estão participando ativamente do circuito. Outro avanço no campo foi o uso de modelos transgênicos para identificar células indiferenciadas sob o domínio da nestina. Os camundongos transgênicos nestina-GFP expressam uma proteína fluorescente verde (GFP) aprimorada, que está sob o controle do promotor de nestina. A nestina é um filamento intermediário caracterizado por células progenitoras5. Os camundongos transgênicos nestina-GFP permitiram estabelecer etapas iniciais de desenvolvimento envolvidas na neurogênese6. No entanto, uma limitação significativa é ser capaz de manter uma colônia de camundongos transgênicos nestina-GFP sob condições especiais em uma instalação de laboratório que se torna rentável para alguns grupos científicos, especialmente aqueles de países em desenvolvimento.
As técnicas mencionadas acima têm vantagens e desvantagens. No entanto, a identificação de células proliferantes por imuno-histoquímica (IHC) e a possibilidade de realizar a técnica de marcação dupla ou tripla por imunofluorescência para identificar o estágio de maturação celular ou o destino celular representam a maneira mais viável de medir a neurogênese adulta, até o momento. O processo de identificação usando imuno-histoquímica consiste em marcar proteínas, domínio proteico ou nucleotídeos com um anticorpo específico que permite seu reconhecimento conhecido como anticorpo primário. Este último é reconhecido pelo anticorpo secundário, que é marcado com um cromogênio (por exemplo, peroxidase de rábano) ou um fluorocromo (por exemplo, FITC) acoplado ao anticorpo secundário. Os microscópios podem detectar sinais de cromogênios e fluorocromos. Usando IHC, é possível identificar proteínas de membrana, proteínas do citoesqueleto ou componentes nucleares, como o BrdU. Por outro lado, o BrdU pode ser encontrado no núcleo celular, uma vez que é incorporado ao DNA durante a fase S por competição. Portanto, um passo crucial é a desnaturação do DNA com HCl, que abre ligações de DNA para permitir o acesso do anticorpo BrdU ao BrdU dentro do DNA. É essencial saber que a BrdU está presente em uma concentração saturada no soro de camundongos e ratos por 15 e 60 min, respectivamente, após administração intraperitoneal, e depois cai rapidamente para níveis indetectáveis em 60 e 120 min, respectivamente7.
Aqui, descrevemos quatro técnicas de IHC diferentes, mas intimamente relacionadas: detecção indireta cromogênica usando reação de peroxidase de rábano (HRP) com DAB (3,3'-diaminobenzidina) sem amplificação de sinal (etapa 4.1), amplificação do complexo avidina-biotina (ABC) (etapa 4.1), detecção de imunofluorescência indireta sem amplificação de sinal (etapa 4.4) e amplificação marcada de estreptavidina-biotina (LSAB) (etapa 4.3). Cada método tem vantagens e desvantagens e pode ser útil para necessidades teciduais específicas (ver Tabela 1). Decidimos seguir os métodos indiretos de ICH devido à sua acessibilidade e simplicidade para fazer mudanças de métodos de detecção cromogênica para fluorescente ao usar anticorpos primários não conjugados. A abordagem HRP é um método IHC comumente usado devido à sua acessibilidade, alta estabilidade, alta taxa de rotatividade e disponibilidade total dos substratos. No entanto, recomendamos o uso de um controle positivo para confirmar que o método de coloração funciona com precisão e o uso de controle negativo para testar a função do anticorpo de forma eficaz. Imunocolorações múltiplas ou métodos multiplex IHC (ver etapa 6) são ferramentas potentes para adquirir grandes quantidades de dados da seção de tecido em um único experimento. Esta técnica é particularmente importante quando a disponibilidade de amostras é limitada. Outra vantagem é a possibilidade de identificar simultaneamente proteínas específicas co-expressas no mesmo espaço celular, preservando a integridade do tecido. O Multiplex permite corar diferentes marcadores expressos durante estágios proliferativos específicos (por exemplo, nestina, GFAP, DCX, Ki-67), permitindo-nos chegar a uma pesquisa mais detalhada de proliferação e diferenciação8. É crucial escolher anticorpos compatíveis com a técnica de fixação utilizada para evitar a reatividade cruzada. Recomendamos testar cada novo anticorpo (incluindo BrdU) individualmente para ajustar e refinar o método. Em seguida, introduza a coloração sequencial dupla e, finalmente, inicie o processo de imunocoloração simultânea quando o método sequencial estiver totalmente dominado. É crucial escolher anticorpos secundários apropriados para este método.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Método</td>
			<td>Método específico</td>
			<td>Vantagens</td>
			<td>Desvantagens</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Método de detecção indireta</td>
			<td>Reação da peroxidase com DAB</td>
			<td>1. Maior sensibilidade do que o método de detecção direta e fluorescência indireta. 2. Maior resistência ao fotobranqueamento do que os fluorocromos. 3. Menor custo do que o método de detecção de fluorescência</td>
			<td>1. Difícil para multiplexação com menos corantes de cor. 2. Complicado para alvos co-expressos no mesmo espaço celular. 3. Faixa Dinâmica Reduzida para alvos simultâneos escassos e altamente abundantes no mesmo tecido.</td>
		</tr><tr><td>Fluorescência</td>
			<td>1. Melhor e mais fácil para multiplexação com mais corantes de cor. 2. Melhor para alvos co-expressos no mesmo espaço celular. 3. Melhor Faixa Dinâmica para alvos simultâneos escassos e altamente abundantes no mesmo tecido. 4. Sem etapas adicionais.</td>
			<td>1. Sensibilidade inferior à reacção indirecta da peroxidase com o método DAB. 2. Resistência fraca ao fotobranqueamento ao longo do tempo. 3. Mais caro.</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Método de amplificação de sinal</td>
			<td>Complexo Avidina-Biotina (ABC)</td>
			<td>1. Maior sensibilidade do que o método de detecção direta e indireta. 2. Reduza o plano de fundo</td>
			<td>1. Etapas adicionais. 2. Mais caro do que não amplificação.</td>
		</tr><tr><td>Rotulado Streptavidin-Biotina (LSAB)</td>
			<td>1. Maior sensibilidade do que o método de detecção direta e indireta. 2. Penetração tecidual mais substancial do que o método ABC. 3. Reduza o plano de fundo</td>
			<td>1. Etapas adicionais. 2. Mais caro que o método ABC.</td>
		</tr><tr><td>Não método de amplificação adicional</td>
			<td>1. Menor custo. 2. Sem etapas adicionais. 3. Ideal para alvos altamente abundantes.</td>
			<td>1. Menor sensibilidade: problemático sem alvos abundantes.</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Vantagens/desvantagens das técnicas de IHC. Esta tabela mostra as vantagens/desvantagens para os métodos de detecção indireta: reação da peroxidase com DAB (3,3'-diaminobenzidina) e fluorescência; e métodos de amplificação de sinal: complexo avidina-biotina (ABC), estreptavidina-biotina marcada (LSAB) e não método de amplificação adicional.
Uma imagem de alta resolução é fundamental para realizar uma análise adequada e apresentar os resultados. Existem duas abordagens para melhorar a resolução: 1) uso de um melhor design de microscópio (por exemplo, confocal, multifóton) ou 2) inversão numérica do processo de desfoque para melhorar as imagens usando a deconvolução9. Infelizmente, a microscopia confocal não é acessível devido aos altos custos do equipamento e sua manutenção10. Um microscópio de epifluorescência de campo amplo e a subsequente deconvolução das imagens z-stack fornecem uma alternativa adequada e de baixo custo à microscopia confocal 8,9. Como observado acima, o objetivo da deconvolução é restaurar o sinal original que foi degradado pelo sistema de aquisição9, reduzindo o desfoque, a neblina fora de foco e a distorção mostrada na imagem obtida por um microscópio de epifluorescência ou confocal usando algoritmos matemáticosde remoção 10. A imagem borrada adquirida pode ser modelada matematicamente como resultado da covolvição dos objetos observados com uma função de dispersão de ponto (PSF) 3D. PSF é um padrão teórico de difração dos pontos de luz emitidos pela amostra de tecido e coletados pelo microscópio. O arquivo PSF é criado com as condições específicas de cada imagem, como o espaçamento celular CCD da câmera, o índice de refração da mídia utilizada, a abertura numérica da lente objetiva, o comprimento de onda de emissão do fluoróforo, os tamanhos das imagens, o número de imagens no método de processamento z-stack e o espaço entre elas (ver especificação técnica na Tabela 2). Em outras palavras, o arquivo PSF resume os efeitos da configuração de imagem nas observações do microscópio9. No entanto, usamos o plugin PSF 3D de difração (https://imagej.net/Diffraction_PSF_3D) para criar nosso próprio arquivo PSF específico para cada imagem z-stack. As imagens Z-stack são uma série de seções ópticas digitalizadas de profundidades definidas (eixo z) no mesmo local XY do slide. Um computador compila as informações obtidas a partir do plano de foco reatribuindo sinais que se originaram de objetos localizados em outros planos focais. Para criar imagens z-stack, é necessário tirar imagens de diferentes camadas focadas dos slides (por exemplo, dez imagens diferentes da mesma área XY a cada 1 μm de profundidade). Em seguida, usamos software de microscopia fornecido pelo fabricante ou Fiji para criar uma z-stack ou imagem 3D. O resultado será um único arquivo de imagem de pilha (por exemplo, dez imagens com focos diferentes). Existem várias ferramentas e soluções de software específicas do cliente, como software de código aberto para microscopia de deconvolução. Mostraremos as saídas do processo de deconvolução usando o DeconvolutionLab29, que é um plugin Fiji11 (distribuição do ImageJ12). A deconvolução ajudará a melhorar a resolução das micrografias finais (ver Figura 1B,C). Para mais informações e instruções, recomendamos vivamente a leitura da referência13.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig01.jpg"> Figura 1: Imagem representativa da deconvolução 3D para vários canais de cores. (A) GD em baixa ampliação. (B) As imagens z-stack originais para cada canal e a imagem mesclada. (C) Imagens z-stack descomplicadas 3D para cada canal e a imagem mesclada. Este cérebro era do rato que fazia parte do grupo de atividade física. Utilizou-se o método de amplificação da estreptavidina-biotina (LSAB) marcado. Mostrou anticorpo conjugado com estreptavidina Cy3 para indicação de BrdU (vermelho), DAPI como contracoloração (azul) e proteína glial fibrilar ácida (GFAP) como marcador astroglial (verde). ML = camada molecular; GCL = camada de células granulares; SGZ = zona subgranular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig01large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O objetivo deste trabalho é fornecer uma descrição detalhada das etapas para a obtenção de resultados positivos e bem-sucedidos com a imunocoloração e listar as etapas comumente utilizadas em estudos baseados em BrdU, sem o uso de um microscópio confocal. A coloração BrdU é uma técnica que requer vários passos que devem ser cuidadosamente seguidos para alcançar uma coloração bem-sucedida. A padronização dessas técnicas de coloração normalmente leva meses e consome tempo e recursos. Antecipamos que este artigo poderia fornecer informações para os grupos que estão começando dentro deste campo, reduzindo o tempo e os erros.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENT PREPARATION AND SETUP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donor Horse Serum</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>S0900</td>
			<td>Blocking and incubation solutions in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde reagent grade, crystalline (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>toxic, flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746436-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, monobasic</td>
			<td>J.T Bker</td>
			<td>3246-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sacarose</td>
			<td>J.T Baker</td>
			<td>4072-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Meyer</td>
			<td>2365-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td>Corrisive, to calibrate pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phophate Dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9763-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-x 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THYMIDINE ANALOGUE BRDU ADMINISTRATION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Bromo-2&#8242;-deoxyuridine, BrdU</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9285</td>
			<td>toxic (mutagenic, teratogenic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23&#8211;27G hypodermic needle</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution</td>
			<td>PiSA</td>
			<td>30130032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 1 mL</td>
			<td>NIPRO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TISSUE PREPARATION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-ml polypropylene conical tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-ml polypropylene conical tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guillotine</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome Cryostat</td>
			<td>MICROM</td>
			<td>HM525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netwell 15 mm polyester mesh membrane inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3477</td>
			<td>pre-loaded in 12-well culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netwell plastic 12-well carrier kit</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3520</td>
			<td>for 15 mm polyester mesh membrane inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netwell plastic 6-well carrier kit</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>7553-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>IKA</td>
			<td>ROKCER 3D Digital</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMMUNOSTAINING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td>1%, Light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit (with Nickel), 3,3&#8217;-diaminobenzidine</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>carcinogenic, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydochloric Acid</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>9535-05</td>
			<td>Corrosive, to calibrate pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide, 50%</td>
			<td>Meyer</td>
			<td>5375-1L</td>
			<td>Toxic, oxidative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASTAIN&#174; Elite&#174; ABC Kit Peroxidase (HRP)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td>enzymatic, avidin/biotin based amplification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HPA056030</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-BrdU antibody produced in Mouse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2531</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-065-151</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, HRP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>G-21040</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG (whole molecule), TRITC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5393</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed, FITC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F-2765</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Cy3</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SA-1300</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAGING AND ANALYSIS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell Computer Company</td>
			<td>T8P8T-7G8MR-4YPQV-96C2F-7THHB</td>
			<td>For controlling and monitoring protocols&#8217; processes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD-camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UC50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSens Standard software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>cellSens Standard Edition</td>
			<td>Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-pressure 130 W mercury arc lamp</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-HGLGPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low autofluorescence immersion oil</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MOIL-30 Type F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover-glasses (VWR, cat no 48404 454; 24&#160; 60 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (VWR, cat no 48323-185; 76&#160; 26 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-FBW filter cube</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-FBW</td>
			<td>excitation 460 - 495 nm, dichroic mirror 505 nm, suppression 510 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-FGW filter cube</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-FGW</td>
			<td>excitation 530 - 550 nm, dichroic mirror 570 nm, suppression 575 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-FUW filter cube</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-FUW</td>
			<td>excitation 340 - 490 nm, dichroic mirror 410 nm, suppression 420 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemistry techniques to analyze cellular proliferation and neurogenesis in rats using the thymidine analog brdu

Uma das coisas mais importantes no campo da neurogênese hipocampal adulta (AHN) é a identificação das células recém-geradas. A imunodetecção de análogos da timidina (como a 5-Bromo-2'-desoxiuridina (BrdU)) é uma técnica padrão usada para visualizar essas células recém-geradas. Portanto, o BrdU é geralmente injetado em pequenos animais por via intraperitoneal, de modo que o análogo da timidina é incorporado às células em divisão durante a síntese de DNA. A detecção é realizada por análise imuno-histoquímica de fatias cerebrais. Todo grupo de pesquisa que tem usado essa técnica pode apreciar que ela requer atenção especial aos mínimos detalhes para alcançar uma mancha bem-sucedida. Por exemplo, um passo importante é a desnaturação do DNA com HCl, que permite que ele atinja o núcleo da célula para manchá-lo. No entanto, os relatórios científicos existentes descrevem muito poucas dessas etapas em detalhes. Portanto, padronizar a técnica é um desafio para novos laboratórios, pois pode levar vários meses para produzir resultados positivos e bem-sucedidos. O objetivo deste trabalho é descrever e elaborar os passos para a obtenção de resultados positivos e bem-sucedidos da técnica de imunocoloração em detalhes ao trabalhar com o análogo da timidina BrdU. O protocolo inclui a preparação e configuração do reagente, administração de análogo de timidina em um roedor, perfusão transcárdica, preparação tecidual, reação imuno-histoquímica da peroxidase, uso do complexo avidina-biotina, imunofluorescência, contracoloração, microscopia e análise celular.

Os métodos descritos acima foram aplicados para quantificar células recém-nascidas no hipocampo de ratos adultos após atividade física voluntária, em contraste com um grupo controle sem qualquer atividade física extra. Utilizou-se o hipocampo pós-natal de ratos como controle positivo. Ratos machos de 3 meses de idade estavam sob um protocolo de atividade física voluntária (roda sem fim) por sete dias. No dia 6, os ratos foram injetados com BrdU (secção 2) e de 12 em 12 h após três injeções completas. Para completar três divisões do ciclo celular, os animais foram perfundidos transcardialmente (secção 3) 8 h após a última injeção de BrdU. O mesmo procedimento foi utilizado em ratos de três meses de idade que não foram submetidos à atividade física para ser utilizado como controle comparativo. Como controlo positivo, os filhotes de ratos com um dia de idade (dia 1 pós-natal) foram injetados com BrdU uma vez, conforme descrito na secção 2 acima. Um dia após a injeção (dia 2 pós-natal), os filhotes foram sacrificados e suas cabeças foram imersas em solução de PFA, conforme descrito na etapa 3.4. Os ratos adultos foram profundamente anestesiados (passo 3.1), perfundidos transcardialmente, conforme descrito no passo 3.2. Os cérebros foram dissecados e pós-fixados (etapa 3.4). Os cérebros foram cortados em cortes coronais de 40 μm (etapa 3.5). Os cortes foram processados para imuno-histoquímica de BrdU, conforme descrito na etapa 4.
Utilizou-se reação de peroxidase de rábano com DAB IHC para coloração (etapa 4.1) e contagem de células BrdU-positivas em GD. A Figura 5 mostra uma seção DG com células marcadas com BrdU. A Figura 5C,D mostra uma parte representativa da secção DG com maior ampliação. As células marcadas apresentavam coloração escura intensa, marcadas com setas. A inserção mostra o número médio de células marcadas nos grupos experimental e controle (células positivas contadas multiplicadas por seis, conforme descrito na etapa 8.1). O teste t de Student revelou diferenças de significância entre os números de células BrdU-positivas (t(10) = 2,704, p = 0,0222). O grupo controle que não realizou atividade física apresentou 2.040 ± 314 células (n = 6 ratos). Em comparação, o grupo de atividade física mostrou, em média, 3.606 ± 486 (n = 6 ratos) células BrdU-positivas. Como observado, a exposição à atividade física aumenta as células BrdU-positivas. Portanto, esses resultados são consistentes com outros resultados relatados que mostram que a atividade física aumentou a proliferação celular no giro dentado adulto17.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig03.jpg"> Figura 3: Exemplos de diferentes morfologias do núcleo celular marcado com BrdU. BrdU é um marcador de síntese de DNA que marca o núcleo. Na região do hipocampo, os núcleos BrdU-positivos tinham uma forma semi-oval localizada na zona subgranular do giro dentado. Como o BrdU é incorporado por competição, a quantidade incorporada para cada célula terá uma variação que mais tarde será refletida em como o núcleo será visualizado. (A) Imagem de imunofluorescência. (B) Uma imagem usando a reação da peroxidase sem um método de amplificação adicional é apresentada. Setas amarelas mostram artefatos e sinais não específicos. Setas pretas ou brancas mostram células BrdU+. 1 – Núcleo totalmente arquivado, núcleos semi-ovais altamente coloridos. 2 – Núcleos com pontos, a borda dos núcleos é marcada e tem dentro vários pontos. 3 – Núcleos com poucos pontos, a borda dos núcleos são marcados e têm um pequeno número de pontos dentro. 4 – Núcleo pequeno é possível células em um estágio de diferenciação diferente, mas ainda parte do nicho. 5 – Os aglomerados são células precursoras em divisão, pelo que podem ser observadas várias células juntas em grupos condensados. Dentro desses grupos, a contagem deve ser feita com especial cuidado para evitar a rotulagem incorreta de células positivas. As setas vermelhas mostram o núcleo sob divisão que pode ser confundido como sendo uma única célula. Cada célula é colocada em uma caixa e pode ser distinguida em um plano do eixo Z em tempo real. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig03large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig04.jpg"> Figura 4: Imagem RGB representativa para canais únicos e mesclados. A imagem superior mostra a imagem original da pilha z e a imagem inferior mostra a imagem da pilha z descomplicada em 3D. (A) Baixa ampliação da DG. (B) imagem RGB para cada canal e (C) imagem mesclada RGB. Este era um cérebro do grupo de controle. A imunofluorescência foi utilizada sem um método de amplificação adicional. BrdU (vermelho), DAPI como contracoloração (azul) e GFAP (proteína glial fibrilar ácida) como marcador astroglial (verde). ML = camada molecular; GCL = camada de células granulares; SGZ = zona subgranular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig04large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig05.jpg"> Figura 5: Seção DG representativa com células marcadas com BrdU (escuro intenso) para cada grupo experimental. A reação da peroxidase foi utilizada com o método de amplificação do complexo avidina-biotina-peroxidase. (A, B) Mostrar uma ampliação baixa do GD e (C, D) mostrar a área da caixa com ampliação mais alta. Os painéis A e C são tecidos do grupo de atividade física, os painéis B e D são do grupo controle. A inserção mostra o número médio de células marcadas nos grupos de atividade física e controle (células positivas contadas multiplicadas por seis, conforme descrito na etapa 8.1). ML = camada molecular; GCL = camada de células granulares; SGZ = zona subgranular; as setas indicam células BrdU+. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig05large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Vídeo 1: Vídeo mostrando um foco diferente de células positivas ao longo do eixo z distribuídas em diferentes camadas. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61483/VIDEO_1.avi" target="_blank">Por favor, clique aqui para baixar este vídeo.</a>
Vídeo 2: Vídeo mostrando um foco diferente de aglomerados de células positivas ao longo do eixo z distribuído em diferentes camadas. Mova-se lentamente sobre o eixo z para quantificar todos os vários núcleos que integram um aglomerado. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61483/VIDEO_2.mp4" target="_blank">Por favor, clique aqui para baixar este vídeo.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Tipo de microscópio:</td>
			<td colspan="5">Microscópio de epifluorescência Olympus BX53</td>
		</tr><tr><td>Luz:</td>
			<td colspan="5">Lâmpada de arco de mercúrio de alta pressão de 130 W (U-HGLGPS)</td>
		</tr><tr><td>Software de Aquisição:</td>
			<td colspan="5">Padrão CellSens</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Conjuntos de filtros:</td>
			<td colspan="2">Número de catálogo</td>
			<td>Faixa de Excitação</td>
			<td>Espelho dicromática</td>
			<td>Intervalo de supressão</td>
		</tr><tr><td colspan="2">U-FUW</td>
			<td>340 - 490 nm</td>
			<td>410 nm</td>
			<td>420 nm</td>
		</tr><tr><td colspan="2">U-FBW</td>
			<td>460 - 495 nm</td>
			<td>505 nm</td>
			<td>510 nm</td>
		</tr><tr><td colspan="2">U-FGW</td>
			<td>530 - 550 nm</td>
			<td>570 nanômetro</td>
			<td>575 nanômetro</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Câmera:</td>
			<td colspan="2">Modelo:</td>
			<td colspan="3">CCD-câmera UC50</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Faixa espectral:</td>
			<td colspan="3">290 – 1000 nm</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Tamanho do chip CCD:</td>
			<td colspan="3">2/3 pol, 2588 (Largura *7) X 1960 (Altura *8) pixels</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Tamanho do pixel:</td>
			<td colspan="3">3,4 X 3,4 μm</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">Fluorochrome:</td>
			<td colspan="2">Nome</td>
			<td>Comprimento de onda de excitação (nm)</td>
			<td>Emissão *3 Comprimento de onda (nm)</td>
			<td>Cor da emissão</td>
		</tr><tr><td colspan="2">4, 6-diamidino-2-fenil-indol HCI (DAPI)</td>
			<td>345</td>
			<td>455</td>
			<td>Azul</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Tetrametilrodamina-isotiocianato (TRITC)</td>
			<td>541</td>
			<td>572</td>
			<td>Vermelho</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Fluoresceína-isotiocianato (FITC)</td>
			<td>494</td>
			<td>519</td>
			<td>Verde</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Cy3</td>
			<td>552</td>
			<td>565</td>
			<td>Vermelho</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">Montagem Média e óleo de imersão:</td>
			<td colspan="3">Nome</td>
			<td colspan="2">Índice de refração do meio *1</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Ar (nada entre a lâmina e a lente)</td>
			<td colspan="2">1.00029</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Meio de montagem antifade com DAPI</td>
			<td colspan="2">1.45</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Meio de montagem Permount</td>
			<td colspan="2">1.519</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Óleo de imersão de baixa autofluorescência (MOIL-30 Tipo F)</td>
			<td colspan="2">1.518</td>
		</tr><tr><td rowspan="6">Lente de Ampliação (Plano de Fluorita)</td>
			<td>Ampliação</td>
			<td>Abertura numérica (NA) *2</td>
			<td>Resolução (μm)</td>
			<td>Espaçamento de pixels de imagem (nm) *5</td>
			<td>Espaçamento entre fatias do eixo Z (nm) *6</td>
		</tr><tr><td>4X</td>
			<td>0.13</td>
			<td>2.12</td>
			<td>850</td>
			<td>3000</td>
		</tr><tr><td>10X</td>
			<td>0.3</td>
			<td>0.92</td>
			<td>340</td>
			<td>3000</td>
		</tr><tr><td>20X</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.55</td>
			<td>170</td>
			<td>2000</td>
		</tr><tr><td>40X</td>
			<td>0.75</td>
			<td>0.37</td>
			<td>85</td>
			<td>1000</td>
		</tr><tr><td>100X</td>
			<td>1.3</td>
			<td>0.21</td>
			<td>34</td>
			<td>1000</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 2: Especificações de configuração do microscópio e requisitos de criação de arquivos PSF (função de propagação pontual). Existem 11 slots na janela do plugin PSF 3D de difração para criar o arquivo PSF. Cada slot é descrito da seguinte forma: *1 - Índice de refração do meio: índice de refração para o meio entre a lâmina e a lente (por exemplo, ar = 1,00029). *2 - Abertura Numérica: NA da lente utilizada (deve ser corrigida quando uma mídia de imersão diferente é usada e a lente foi atribuída). *3 - Comprimento de onda: Comprimento de onda máximo de emissão de fluorocromo (nm). *4 - Aberração Esférica Longitudinal: 0,00. *5 - Espaçamento de pixels da imagem: tamanho do pixel CCD (nm)/Ampliação (por exemplo, lente de 3,4 μm e 100X, 3400/100 = 34 nm). *6 - Distância entre as imagens do eixo Z. *7 - Largura: Insira a largura da imagem a ser desconvolvida em pixels. *8 - Altura: Insira a altura da imagem a ser desconvolvida em pixels. *9 - Profundidade, fatias: o número de imagens na pilha z. *10 - Normalização: Soma dos valores de pixel = 1. *11 - Título: Nome desejado para o arquivo PSF. O arquivo deve corresponder à imagem z-stack exclusiva fornecida.

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