Name: immunohistochemistry techniques to analyze cellular proliferation and neurogenesis in rats using the thymidine analog brdu
Uploaded: 2020-09-09T14:30:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemistry Techniques to Analyze Cellular Proliferation and Neurogenesis in Rats Using the Thymidine Analog BrdU at JoVE.com

Vi vill tacka Miguel Burgos och Gustavo Lago för att de tillhandahåller tekniskt bistånd. Vi vill också tacka Dr. Clorinda Arias, Dr. Karla Hernandez och Dr. Oscar Galicia för deras vänliga stöd för att tillhandahålla reagenser och material. Vi tackar också División de Investigación y Posgrado vid Universidad Iberoamericana Ciudad de México för att ha tillhandahållit finansiering för utförandet av detta arbete och för att täcka videoproduktionskostnader.

<ol>
	<li>Altman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+new+neurons+formed+in+the+brains+of+adult+mammals.">Are new neurons formed in the brains of adult mammals.</a> Science. 135 (3509), 1127-1128 (1962).</li><li>Altman, J., Das, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoradiographic+and+histological+evidence+of+postnatal+hippocampal+neurogenesis+in+rats.">Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats.</a> The Journal of Comparative Neurology. 124 (3), 319-335 (1965).</li><li>Miller, M. W., Nowakowski, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bromodeoxyuridine-immunohistochemistry+to+examine+the+proliferation,+migration+and+time+of+origin+of+cells+in+the+central+nervous+system.">Use of bromodeoxyuridine-immunohistochemistry to examine the proliferation, migration and time of origin of cells in the central nervous system.</a> Brain Research. 457 (1), 44-52 (1988).</li><li>Eriksson, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+adult+human+hippocampus.">Neurogenesis in the adult human hippocampus.</a> Nature Medicine. 4 (11), 1313-1317 (1998).</li><li>Filippov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpopulation+of+nestin-expressing+progenitor+cells+in+the+adult+murine+hippocampus+shows+electrophysiological+and+morphological+characteristics+of+astrocytes.">Subpopulation of nestin-expressing progenitor cells in the adult murine hippocampus shows electrophysiological and morphological characteristics of astrocytes.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 23 (3), 373-382 (2003).</li><li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus.">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends in Neurosciences. 27 (8), 447-452 (2004).</li><li>Matia&#353;ov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+determination+of+5-bromo-2'-deoxyuridine+pharmacokinetics+in+blood+serum+after+intraperitoneal+administration+to+rats+and+mice.">Flow cytometric determination of 5-bromo-2'-deoxyuridine pharmacokinetics in blood serum after intraperitoneal administration to rats and mice.</a> Histochemistry and Cell Biology. 142 (6), 703-712 (2014).</li><li>Von Bohlen Und Halbach, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistological+markers+for+proliferative+events,+gliogenesis,+and+neurogenesis+within+the+adult+hippocampus.">Immunohistological markers for proliferative events, gliogenesis, and neurogenesis within the adult hippocampus.</a> Cell and Tissue Research. 345 (1), 1-19 (2011).</li><li>Sage, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DeconvolutionLab2:+An+open-source+software+for+deconvolution+microscopy.">DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy.</a> Methods. 115, 28-41 (2017).</li><li>Manz, W., Arp, G., Schumann-Kindel, G., Szewzyk, U., Reitner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widefield+deconvolution+epifluorescence+microscopy+combined+with+fluorescence+in+situ+hybridization+reveals+the+spatial+arrangement+of+bacteria+in+sponge+tissue.">Widefield deconvolution epifluorescence microscopy combined with fluorescence in situ hybridization reveals the spatial arrangement of bacteria in sponge tissue.</a> Journal of Microbiological Methods. 40 (2), 125-134 (2000).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Abr&#224;moff, M. D., Magalh&#227;es, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+with+imageJ.">Image processing with imageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 36-41 (2004).</li><li>. 2D and 3D Fluorescence Deconvolution Manual Available from: <a target="_blank" href="https://pages.stolaf.edu/wp-content/uploads/sites/803/2016/12/Giannini_Giannini_Deconvolution_Manual_20161215.p">https://pages.stolaf.edu/wp-content/uploads/sites/803/2016/12/Giannini_Giannini_Deconvolution_Manual_20161215.p</a> (2016)</li><li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrdU+immunohistochemistry+for+studying+adult+neurogenesis:+Paradigms,+pitfalls,+limitations,+and+validation.">BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation.</a> Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).</li><li>Revilla, V., Jones, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryostat+sectioning+of+brains.">Cryostat sectioning of brains.</a> International Review of Neurobiology. 47, 61-70 (2002).</li><li>Amaral, D. G., Scharfman, H. E., Lavenex, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dentate+gyrus:+fundamental+neuroanatomical+organization+(dentate+gyrus+for+dummies).">The dentate gyrus: fundamental neuroanatomical organization (dentate gyrus for dummies).</a> Progress in brain research. 163, 3-22 (2007).</li><li>Eadie, B. D., Redila, V. A., Christie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voluntary+exercise+alters+the+cytoarchitecture+of+the+adult+dentate+gyrus+by+increasing+cellular+proliferation,+dendritic+complexity,+and+spine+density.">Voluntary exercise alters the cytoarchitecture of the adult dentate gyrus by increasing cellular proliferation, dendritic complexity, and spine density.</a> Journal of Comparative Neurology. 486 (1), 39-47 (2005).</li><li>Leal-Galicia, P., Romo-Parra, H., Rodr&#237;guez-Serrano, L. M., Buenrostro-J&#225;uregui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+adult+hippocampal+neurogenesis+exerted+by+sexual,+cognitive+and+physical+activity:+An+update.">Regulation of adult hippocampal neurogenesis exerted by sexual, cognitive and physical activity: An update.</a> Journal of Chemical Neuroanatomy. 101, 101667 (2019).</li><li>Gould, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+widespread+is+adult+neurogenesis+in+mammals.">How widespread is adult neurogenesis in mammals.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 481-488 (2007).</li><li>Ngwenya, L. B., Peters, A., Rosene, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+and+electron+microscopic+immunohistochemical+detection+of+bromodeoxyuridine-labeled+cells+in+the+brain:+Different+fixation+and+processing+protocols.">Light and electron microscopic immunohistochemical detection of bromodeoxyuridine-labeled cells in the brain: Different fixation and processing protocols.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (7), 821-832 (2005).</li><li>Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+and+multiple+labeling+with+antibodies+from+the+same+host+species+to+study+adult+hippocampal+neurogenesis.">Immunohistochemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52551 (2015).</li><li>Tuttle, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+detection+of+two+thymidine+analogues+(CldU+and+IdU)+in+primary+tissue.">Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (46), e2166 (2010).</li><li>Tischler, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple+immunohistochemical+staining+for+bromodeoxyuridine+and+catecholamine+biosynthetic+enzymes+using+microwave+antigen+retrieval.">Triple immunohistochemical staining for bromodeoxyuridine and catecholamine biosynthetic enzymes using microwave antigen retrieval.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 1-4 (1995).</li><li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+studying+adult+neurogenesis:+Insights+and+recent+developments.">Protocols for studying adult neurogenesis: Insights and recent developments.</a> Regenerative Medicine. 2 (1), 51-62 (2007).</li><li>Leuner, B., Glasper, E. R., Gould, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymidine+analog+methods+for+studies+of+adult+neurogenesis+are+not+equally+sensitive.">Thymidine analog methods for studies of adult neurogenesis are not equally sensitive.</a> Biosystems. 517 (2), 123-133 (2010).</li><li>Magavi, S. S., MacKlis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+newborn+cells+by+BrdU+labeling+and+immunocytochemistry+in+vivo.">Identification of newborn cells by BrdU labeling and immunocytochemistry in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 438, 335-343 (2008).</li><li>Kempermann, G., Gast, D., Kronenberg, G., Yamaguchi, M., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+determination+and+long-term+persistence+of+adult-generated+new+neurons+in+the+hippocampus+of+mice.">Early determination and long-term persistence of adult-generated new neurons in the hippocampus of mice.</a> Development. , 391-399 (2003).</li><li>Ramos-Vara, J. A., Beissenherz, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+immunohistochemical+methods+using+two+different+antigen+retrieval+methods+on+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues:+Experience+with+63+markers.">Optimization of immunohistochemical methods using two different antigen retrieval methods on formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: Experience with 63 markers.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 12 (4), 307-311 (2000).</li><li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+methods+of+immunohistochemistry.">Principles and methods of immunohistochemistry.</a> Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).</li><li>Wojtowicz, J. M., Kee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrdU+assay+for+neurogenesis+in+rodents.">BrdU assay for neurogenesis in rodents.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Vuxen neurogenes är en process som förekommer oftast i nischer av vuxna neurala prekursorceller som har potential att generera nya nervceller under hela deras livslängd. Bromodeoxyuridin (BrdU) märkning används ofta i immunologi för att karakterisera antalet nygenererade celler i en vuxen hjärna. BrdU kommer huvudsakligen att införlivas i celler i diskreta hjärnregioner (neurogena zoner). Dessa celler är belägna i den subventrikulära zonen (SVZ), hippocampus dentate gyrus - mellan hilus och granulära celler som kallas subgranulär zon (SGZ)1,2,18. Dessutom finns det olika hjärnregioner som kännetecknas av en lägre proliferativ kapacitet i vuxen ålder, inklusive hypotalamus, striatum, neocortex och amygdala19. Som nämnts tidigare är BrdU-färgning den vanliga metoden för forskning om vuxen neurogenes för att upptäcka cellproliferation. Användningen av BrdU som markör har dock begränsningar och fallgropar. Den första är att BrdU är en cellcykelmarkör. Därför måste dubbel eller trippelfärgning utföras för att identifiera cellens öde och inkludera cellmarkörer för att detektera det specifika utvecklingsstadiet hos de celler som är märkta. Ytterligare en oro för BrdU är att det är en giftig och mutagen lösning som modifierar DNA-stabilitet kan förändra cellulär funktion och cellcykler. Hänsyn bör tas till tidigare information när man beslutar att följa ett administreringsprotokoll och administreringsdoser (50\u2012600 mg/kg). En annan avgörande egenskap är att BrdU är en DNA-syntesmarkör, inte en cellproliferationsmarkör14. Därför är det relevant att skilja cellproliferation från andra händelser såsom en DNA-reparation, abortiv cellcykelåterinträde och genduplicering. Forskare måste följa lämpliga kontroller för att säkerställa lämplig användning av BrdU. För en mer detaljerad diskussion om dessa problem och begränsningar rekommenderar vi att du granskar Taupins arbete14. Standardiseringsprocessen för ett immunhistokemiprotokoll kan vara långsam och utmanande. I detta arbete har vi presenterat alla allmänna steg för att hantera ett framgångsrikt IHC-protokoll. Vi rekommenderar dock att varje forskargrupp testar och utvärderar vävnad, antikroppar och tillstånd i förväg. Tester och utvärderingar måste utföras med minst tre olika nivåer av inkubationer, tvättsteg och styrkor för varje testad antikropp och vävnad. Vi rekommenderar också att forskare granskar ytterligare protokoll för att kunna välja det bästa som uppfyller specifika behov och krav 20,21,22,23,24,25.
Som tidigare nämnts innefattar förfarandet flera steg och metodologiska överväganden som vanligtvis används och nämns i vetenskapliga artiklar, som senare kommer att diskuteras. Vi rekommenderar att forskare väljer antikropparna noggrant och korrekt när det gäller teknik, budget, utrustning, installation och huvudforskningsmål. Antikroppar måste testas med samma typ av vävnad som senare kommer att testas i experimentet. Vi rekommenderar också användning av en antikropp som testades för samma ändamål (IHC) (dvs. inte bara i western blot- eller flödescytometritekniker) för att testa dess kompatibilitet med fixeringstekniken. Olika vägar kan användas för att administrera BrdU-färgningen, såsom intraperitoneal injektion, intraperitoneal infusion, oralt intag eller intraventrikulär infusion (för en mer detaljerad beskrivning av varje teknik, se referens26). Om den intraperitoneala injektionen väljs, se till att BrdU administreras i bukhålan och undvik tarmområdet. Eftersom tarmen har flera celler i duplicering som kan uttömma BrdU innan den kommer till hjärnan vilket kommer att påverka antalet märkta celler. Det är viktigt att få tunna sektioner eftersom de möjliggör en bättre penetration av lösningar. Koronala skivor på 40 μm tjocka skars rostro-caudally och överfördes till en 24-brunns cellodlingsplatta, enligt det stereologiska förfarandet som föreslagits av Kempermann et al.27. Immunohistokemin kan utföras med vävnad monterad på glidbanor eller som fritt flytande sektioner. Eftersom BrdU ligger djupt i cellkärnor möjliggör det penetrering av lösningar i fritt flytande sektioner vilket ger bättre resultat och bättre tillgång till intresseområdet. Det är viktigt att öppna DNA-bindningar (DNA-denaturering) för att möjliggöra den primära anti-BrdU-antikroppsåtkomsten. I detta arbete utförde vi dessa specifika procedurer med användning av HCI-inkubation. Å andra sidan möjliggjorde processen att blockera ospecifika epitoper en mer exakt identifiering av cellsignalen.
Den goda membranpermeabiliseringen gör att antikropparna kan tränga in i intresseområdet ordentligt. Att lägga till en permeabilizer som Triton X-100 till PBS ++ och PBS + -lösningar förbättrar membranpermeabiliseringen. Både PBS- och Tris-buffrade saltlösningsreagenser (TBS) kan användas i detta protokoll. När det gäller budget kan TBS vara relativitet billigare än PBS. PBS kan dock störa antifosfatantikroppar och hämma alkaliska fosfataskonjugerade antikroppar, så undvik användning av PBS om målet är posttranslationellt modifierat genom fosforylering (dvs. fosforylerat). Vi använde PBS för detta arbete, och vi fick reda på att vävnadstvättsteg gav en mer specifik signal. Vi rekommenderar också forskare att utföra minst tre tvättcykler med antingen TBS o PBS. Lösningarna måste vara nyberedda. Antigenhämtning (AR) är en metod som är avsedd att minska förlusten av antigenicitet orsakad av fixeringen som modifierar strukturen hos tertiära och kvartära antigener. Denna reduktion gör antigener omöjliga att upptäcka med antikroppar28,29. Den värmeinducerade epitophämtningen (HIER) som används i detta protokoll försökte vända de kemiska reaktionerna mellan formaldehyd och proteiner genom hög temperatur eller stark alkalisk hydrolys (med andra buffertlösningar som EDTA pH 8,5 eller Tris pH 9,5). Det är viktigt att testa nya antikroppar med olika AR-protokoll för att jämföra resultat och välja det bästa för protokollet. Det sista steget kan vara valfritt i ett vanligt protokoll. Vi behandlade dock vävnader med ett antigenhämtningsprotokoll för att ge bättre resultat för detta protokoll.
Det är viktigt att välja rätt slutlig kontrastfärg och motfärgningstekniken med hänsyn till den primära färgningsfärgen och metoden som används för att synliggöra en icke-färgningsstruktur och undvika att maskera den primära färgningsfärgen från immunreaktionen. För fluorescensmikroskopin är DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenylindol) en mycket populär kärn- och kromosommotstatning som avger blå fluorescens (absorption: 360 nm, utsläpp: 460 nm) vid bindning till AT-regioner av DNA. DAPI-innehållande monteringsmedium finns tillgängligt och är lätt att använda; Detta ger utmärkt signalretention för bildförvärv. För peroxidreaktionen var IHC tillgängligt i olika alternativ såsom cresylviolett, hematoxylin, neutralröd eller metylgrön färgning. För flera immunfärgningstekniker är det viktigt att välja en kompatibel antikropp med den fixeringsteknik som används för att undvika korsreaktivitet30. När problem och komplikationer med enstaka färgning löses, administrera en annan färgfärgning som anses nödvändig. Det är viktigt att kontrollera den ospecifika bindningen mellan de sekundära antikropparna. Detta kan göras genom att mätta de primära antikropparna innan man använder en sekundär antikropp som produceras i samma värdart av de primära antikropparna. Till exempel, när man använder antimus som produceras i kanin och anti-kanin som produceras i get-sekundära antikroppar, måste antikaninen som produceras i getantikropp användas före antimusen som produceras i kaninantikropp. När den sekventiella metoden domineras helt, kan den samtidiga immunfärgningsprocessen initieras. I denna metod är det viktigt att välja sekundära antikroppar på lämpligt sätt. Helst måste alla dessa antikroppar komma från samma värddjur för att undvika korsreaktivitet. Vi rekommenderar att du kör en positiv kontroll för att bekräfta att färgningsmetoden fungerar korrekt i postnatal hippocampusvävnad (riklig neurogenes runt denna ålder). Om den positiva kontrollvävnaden visar färgningsproblem, granska och gå igenom proceduren, gör korrigeringar och justeringar och upprepa tills en bra färgning produceras. Kör sedan en negativ kontroll för att testa att antikroppen fungerar korrekt genom att utelämna eller ersätta en viss primär antikropp med normalt serum (samma art som den primära antikroppen). Som nämnts i inledningen är bilddekonvolution ett kraftfullt verktyg och ger ett alternativ när ett konfokalmikroskop inte är tillgängligt. Den kan tillämpa bilddekonvolutionen på alla bilder som erhållits med hjälp av överfört ljusfält, bredfältfluorescens och konfokal fluorescensmikroskopi. Det yttersta syftet med bilddekonvolution är att rekonstruera den ursprungliga signalen att förvärvssystemet försämras10.
Sammanfattningsvis är identifieringen av de nygenererade cellerna visualiserade genom immunodetektion av tymidinanalog BrdU en komplicerad men kraftfull teknik. Detta arbete är ett försök att hjälpa forskare, särskilt inom området vuxen hippocampus neurogenes, att kvantifiera nya celler mer exakt. Vi hoppas att denna insats har varit till hjälp för det vetenskapliga samfundet och gör det lättare att finjustera studien av cellproliferation med immunhistokemitekniken.

Tanken att nya neuroner genereras i den vuxna mänskliga hjärnan under hela livslängden har fascinerat det vetenskapliga samfundet i årtionden. Kunskapen om att hjärnan genererar nya nervceller under hela sin livslängd uppnåddes genom detektion av celler under division 1,2. Detektion av nygenererade nervceller i den vuxna hjärnan identifierades först genom intrakraniellt injicering av tritierat tymidin (tymidin-H3) hos råttor och detektion av celler i cellcykeln med autoradiogram 1,2. Celldelning av glia och närvaron av neuroblaster rapporterades, vilket var de första lovande uppgifterna om postnatal neurogenes1. Ändå innebar användningen och detekteringen av tymidin-H3 användningen av radioaktivitet, vilket kan vara skadligt för de människor som hanterar det. Den första ansträngningen som undersökte lämpligheten av BrdU-immunhistokemi i studien av spridning, migration och ursprung för celler i nervsystemet uppträdde 1988 av Miller och Nowakowski3. År 1998 visade en artikel publicerad av Eriksson och kollegor att nya neuroner visualiserades postmortem i den mänskliga vuxna hjärnan hos patienter injicerade med 5-Bromo-2′-deoxiuridin (BrdU)4. Dessa patienter fick BrdU-injektionen (250 mg intravenöst) för att märka tillväxten av tumörer4. Denna teknik antogs i djurmodeller. Införandet av dessa metoder markerade en milstolpe för fältet eftersom detta möjliggjorde detektion av nygenererade celler utan användning av radioaktiva föreningar. Denna procedur blev guldstandarden för att mäta cellproliferation i vuxna hjärnnischer för att främja ytterligare forskning inom området.
Begränsningen av tymidinanalogtekniken är att den inte tillåter bestämning av cellulär identitet för de nygenererade cellerna. Immunohistokemi tillåter oss emellertid att utföra dubbel- eller trippelmärkningsteknik för samma cell, vilket validerar de nygenererade cellernas cellulära öde och till och med deras mognadsstadier, vilket leder till ytterligare utveckling av fältet. Denna metod karakteriserades för att differentiera nygenererade celler till glia, odifferentierade neuroner eller en helt mogen granulär cell, och till och med för att avgöra om de deltar aktivt i kretsarna. Ett annat genombrott inom området var användningen av transgena modeller för att identifiera odifferentierade celler under domänen nestin. De nestin-GFP-transgena mössen uttrycker ett förbättrat grönt fluorescerande protein (GFP), som är under kontroll av nestinpromotorn. Nestin är ett mellanliggande filament som kännetecknas av stamceller5. De nestin-GFP-transgena mössen fick etablera tidiga utvecklingssteg involverade i neurogenes6. En betydande begränsning är dock att kunna upprätthålla en nestin-GFP-transgen mösskoloni under speciella förhållanden i en laboratorieanläggning som blir kostnadseffektiv för vissa vetenskapliga grupper, särskilt de från utvecklingsländer.
De tekniker som nämns ovan har fördelar och nackdelar. Identifiering av prolifererande celler genom immunohistokemi (IHC) och möjligheten att utföra dubbel- eller trippelmärkningsteknik genom immunofluorescens för att identifiera cellmognadsstadium eller cellöde representerar dock det mest genomförbara sättet att mäta vuxen neurogenes, hittills. Identifieringsprocessen med immunhistokemi består av märkning av proteiner, proteindomän eller nukleotider med en specifik antikropp som möjliggör deras erkännande som kallas primär antikropp. Den senare känns igen av den sekundära antikroppen, som är märkt med en kromogen (t.ex. pepparrotsperoxidas) eller en fluorokrom (t.ex. FITC) i kombination med den sekundära antikroppen. Mikroskop kan detektera både kromogener och fluorokromsignaler. Med hjälp av IHC är det möjligt att identifiera membranproteiner, cytoskelettproteiner eller kärnkomponenter såsom BrdU. Å andra sidan kan BrdU hittas i cellkärnan eftersom den införlivas i DNA under S-fas genom konkurrens. Därför är ett avgörande steg DNA-denatureringen med HCl, som öppnar DNA-bindningar för att ge BrdU-antikroppen tillgång till BrdU i DNA. Det är viktigt att veta att BrdU finns i en mättad koncentration i möss och råttserum i 15 respektive 60 minuter, efter intraperitoneal administrering, och sjunker sedan snabbt till omätbara nivåer vid 60 respektive 120 min7.
Här beskriver vi fyra olika men närbesläktade IHC-tekniker: kromogen indirekt detektion med pepparrotsperoxidas (HRP) reaktion med DAB (3,3'-diaminobenzidin) sans signalförstärkning (steg 4.1), avidin-biotinkomplex (ABC) förstärkning (steg 4.1), indirekt immunofluorescensdetektering utan signalförstärkning (steg 4.4) och märkt streptavidin-biotin (LSAB) förstärkning (steg 4.3). Varje metod har för- och nackdelar och kan vara användbar för specifika vävnadskrav (se tabell 1). Vi bestämde oss för att följa indirekta ICH-metoder på grund av deras överkomliga priser och enkelhet att göra förändringar från kromogena till fluorescerande detektionsmetoder vid användning av okonjugerade primära antikroppar. HRP-metoden är en vanligt förekommande IHC-metod på grund av dess överkomliga priser, höga stabilitet, höga omsättningshastighet och substratens fulla tillgänglighet. Ändå rekommenderar vi att du använder en positiv kontroll för att bekräfta att färgningsmetoden fungerar korrekt och användningen av negativ kontroll för att testa antikroppsfunktionen effektivt. Flera immunfärgningar eller multiplex IHC-metoder (se steg 6) är potenta verktyg för att förvärva stora mängder data från vävnadssektionen i ett enda experiment. Denna teknik är särskilt viktig när tillgången på prover är begränsad. En annan fördel är möjligheten att samtidigt identifiera specifika proteiner som uttrycks i samma cellulära utrymme samtidigt som vävnadens integritet bevaras. Multiplex gör det möjligt att färga olika markörer uttryckta under specifika proliferativa stadier (t.ex. nestin, GFAP, DCX, Ki-67), vilket gör att vi kan nå en mer detaljerad spridnings- och differentieringsforskning8. Det är viktigt att välja antikroppar som är kompatibla med den fixeringsteknik som används för att undvika korsreaktivitet. Vi rekommenderar att du testar varje ny antikropp (inklusive BrdU) individuellt för att justera och förfina metoden. Introducera sedan den dubbla sekventiella färgningen och slutligen starta den samtidiga immunfärgningsprocessen när den sekventiella metoden är helt dominerad. Det är viktigt att välja lämpliga sekundära antikroppar för denna metod.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Metod</td>
			<td>Specifik metod</td>
			<td>Fördelar</td>
			<td>Nackdelar</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Indirekt detektionsmetod</td>
			<td>Peroxidasreaktion med DAB</td>
			<td>1. Högre känslighet än metoden för direkt detektion och indirekt fluorescens. 2. Högre motståndskraft mot fotoblekning än fluorokromer. 3. Lägre kostnad än fluorescensdetekteringsmetod</td>
			<td>1. Svårt för multiplexering med färre färgfärger. 2. Komplicerat för samuttryckta mål i samma cellulära utrymme. 3. Reducerat dynamiskt omfång för samtidiga knappa och höga rikliga mål på samma vävnad.</td>
		</tr><tr><td>Fluorescens</td>
			<td>1. Bäst och enklast för multiplexering med fler färgfärger. 2. Bäst för samuttryckta mål i samma cellulära utrymme. 3. Bättre dynamiskt omfång för samtidiga knappa och höga rikliga mål på samma vävnad. 4. Inga ytterligare steg.</td>
			<td>1. Lägre känslighet än den indirekta peroxidasreaktionen med DAB-metoden. 2. Svagt motstånd mot fotoblekning över tid. 3. Dyrare.</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Metod för signalförstärkning</td>
			<td>Avidin-Biotin-komplexet (ABC)</td>
			<td>1. Högre känslighet än den direkta och indirekta detektionsmetoden. 2. Minska bakgrunden</td>
			<td>1. Ytterligare steg. 2. Dyrare än inte förstärkning.</td>
		</tr><tr><td>Märkt Streptavidin-Biotin (LSAB)</td>
			<td>1. Högre känslighet än den direkta och indirekta detektionsmetoden. 2. Mer omfattande vävnadspenetration än ABC-metoden. 3. Minska bakgrunden</td>
			<td>1. Ytterligare steg. 2. Dyrare än ABC-metoden.</td>
		</tr><tr><td>Inte ytterligare förstärkningsmetod</td>
			<td>1. Lägre kostnad. 2. Inga ytterligare steg. 3. Perfekt för höga rikliga mål.</td>
			<td>1. Lägre känslighet: problematisk utan rikliga mål.</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 1: För- och nackdelar med IHC-tekniker. Denna tabell visar fördelarna/nackdelarna med indirekta detektionsmetoder: Peroxidasreaktion med (3,3'-diaminobenzidin) DAB och fluorescens; och signalförstärkningsmetoder: avidin-biotinkomplex (ABC), märkt streptavidin-biotin (LSAB), och inte ytterligare förstärkningsmetod.
En högupplöst bild är grundläggande för att utföra korrekt analys och presentera resultaten. Det finns två metoder för att förbättra upplösningen: 1) användning av en bättre mikroskopdesign (t.ex. konfokal, multifoton) eller 2) numeriskt invertera suddighetsprocessen för att förbättra bilder med dekonvolution9. Tyvärr är konfokalmikroskopi inte överkomligt på grund av de höga kostnaderna för utrustning och dess service10. Ett bredfältsepifluorescensmikroskop och den efterföljande dekonvolutionen av z-stackbilderna ger ett lämpligt, billigt alternativ till konfokalmikroskopi 8,9. Som nämnts ovan är dekonvolutionsmålet att återställa den ursprungliga signalen som försämrades av förvärvssystemet9, genom att minska oskärpa, out-of-focus dis och distorsion som visas i bilden erhållen av ett epifluorescens eller konfokalmikroskop med hjälp av matematiska borttagningsalgoritmer10. Den förvärvade suddiga bilden kan matematiskt modelleras som ett resultat av att de observerade objekten konvolveras med en 3D-punktspridningsfunktion (PSF). PSF är ett teoretiskt diffraktionsmönster av de ljuspunkter som avges av vävnadsprovet och samlas in av mikroskopet. PSF-filen skapas med de specifika förhållandena för varje bild, såsom kamerans CCD-cellavstånd, brytningsindex för det använda mediet, objektivlinsens numeriska bländare, fluoroforens emissionsvåglängd, bildstorlekar, antal bilder i z-stack-bearbetningsmetoden och utrymmet mellan dem (se teknisk specifikation i tabell 2). Med andra ord sammanfattar PSF-filen effekterna av bildinställningen på mikroskopobservationerna9. Vi använder dock diffraktionen PSF 3D Plugin (https://imagej.net/Diffraction_PSF_3D) för att skapa vår egen specifika PSF-fil för varje z-stack-bild. Z-stack-bilder är en serie digitaliserade optiska sektioner från definierade djup (z-axel) på samma XY-plats för bilden. En dator sammanställer den information som erhålls från fokusplanet genom att omtilldela signaler som har sitt ursprung från objekt som befinner sig i andra fokalplan. För att skapa z-stack-bilder är det nödvändigt att ta bilder från olika fokuserade lager av bilderna (t.ex. tio olika bilder av samma XY-område var 1 μm djup). Sedan använder vi mikroskopiprogramvara som tillhandahålls av tillverkaren eller Fiji för att skapa en z-stack eller 3D-bild. Resultatet blir en enda stapelbildfil (t.ex. tio bilder med olika fokus). Det finns flera kundspecifika verktyg och mjukvarulösningar, till exempel programvara med öppen källkod för dekonvolutionsmikroskopi. Vi kommer att visa utgångarna från dekonvolutionsprocessen med DeconvolutionLab29 som är ett Fiji11-plugin (distribution av ImageJ12). Dekonvolution hjälper till att förbättra upplösningen av slutliga mikrografer (se figur 1B, C ). För ytterligare information och instruktioner rekommenderar vi starkt att du läser referens13.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig01.jpg"> Bild 1: Representativ bild av 3D-dekonvolution för flera färgkanaler. A) GD med låg förstoring. (B) De ursprungliga z-stackbilderna för varje kanal och den sammanslagna bilden. (C) 3D-dekonvoluterade z-stack-bilder för varje kanal och den sammanslagna bilden. Denna hjärna var från råttan som var en del av fysisk aktivitetsgrupp. Märkt streptavidin-biotin (LSAB) förstärkningsmetod användes. Den visade Cy3 streptavidinkonjugerad antikropp för att indikera BrdU (röd), DAPI som en motfärgning (blå) och glialfibrillärt surt protein (GFAP) som en astroglial markör (grön). ML = molekylärt skikt; GCL = granulärt cellskikt; SGZ = subgranulär zon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Syftet med detta arbete är att ge en detaljerad beskrivning av stegen för att uppnå positiva och framgångsrika resultat med immunfärgning och att lista vanliga steg i BrdU-baserade studier, utan användning av ett konfokalmikroskop. BrdU-färgning är en teknik som kräver flera steg som måste följas noggrant för att uppnå en framgångsrik fläck. Att standardisera dessa färgningstekniker tar vanligtvis månader och är tids- och resurskrävande. Vi förväntade oss att den här artikeln skulle kunna ge information till de grupper som börjar inom detta område genom att minska tid och fel.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENT PREPARATION AND SETUP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donor Horse Serum</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>S0900</td>
			<td>Blocking and incubation solutions in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde reagent grade, crystalline (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>toxic, flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746436-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, monobasic</td>
			<td>J.T Bker</td>
			<td>3246-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sacarose</td>
			<td>J.T Baker</td>
			<td>4072-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Meyer</td>
			<td>2365-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td>Corrisive, to calibrate pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phophate Dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9763-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-x 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THYMIDINE ANALOGUE BRDU ADMINISTRATION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Bromo-2&#8242;-deoxyuridine, BrdU</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9285</td>
			<td>toxic (mutagenic, teratogenic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23&#8211;27G hypodermic needle</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution</td>
			<td>PiSA</td>
			<td>30130032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 1 mL</td>
			<td>NIPRO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TISSUE PREPARATION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-ml polypropylene conical tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-ml polypropylene conical tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guillotine</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome Cryostat</td>
			<td>MICROM</td>
			<td>HM525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netwell 15 mm polyester mesh membrane inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3477</td>
			<td>pre-loaded in 12-well culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netwell plastic 12-well carrier kit</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3520</td>
			<td>for 15 mm polyester mesh membrane inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netwell plastic 6-well carrier kit</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>7553-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>IKA</td>
			<td>ROKCER 3D Digital</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMMUNOSTAINING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td>1%, Light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit (with Nickel), 3,3&#8217;-diaminobenzidine</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>carcinogenic, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydochloric Acid</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>9535-05</td>
			<td>Corrosive, to calibrate pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide, 50%</td>
			<td>Meyer</td>
			<td>5375-1L</td>
			<td>Toxic, oxidative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASTAIN&#174; Elite&#174; ABC Kit Peroxidase (HRP)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td>enzymatic, avidin/biotin based amplification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HPA056030</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-BrdU antibody produced in Mouse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2531</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-065-151</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, HRP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>G-21040</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG (whole molecule), TRITC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5393</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed, FITC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F-2765</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Cy3</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SA-1300</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAGING AND ANALYSIS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell Computer Company</td>
			<td>T8P8T-7G8MR-4YPQV-96C2F-7THHB</td>
			<td>For controlling and monitoring protocols&#8217; processes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD-camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UC50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSens Standard software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>cellSens Standard Edition</td>
			<td>Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-pressure 130 W mercury arc lamp</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-HGLGPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low autofluorescence immersion oil</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MOIL-30 Type F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover-glasses (VWR, cat no 48404 454; 24&#160; 60 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (VWR, cat no 48323-185; 76&#160; 26 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-FBW filter cube</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-FBW</td>
			<td>excitation 460 - 495 nm, dichroic mirror 505 nm, suppression 510 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-FGW filter cube</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-FGW</td>
			<td>excitation 530 - 550 nm, dichroic mirror 570 nm, suppression 575 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-FUW filter cube</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-FUW</td>
			<td>excitation 340 - 490 nm, dichroic mirror 410 nm, suppression 420 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemistry techniques to analyze cellular proliferation and neurogenesis in rats using the thymidine analog brdu

En av de viktigaste sakerna inom vuxen hippocampus neurogenes (AHN) är identifieringen av de nygenererade cellerna. Immunodetektion av tymidinanaloger (såsom 5-Bromo-2'-deoxiuridin (BrdU)) är en standardteknik som används för att visualisera dessa nygenererade celler. Därför injiceras BrdU vanligtvis i små djur intraperitonealt, så tymidinanalogen införlivas i delande celler under DNA-syntesen. Detektion utförs genom immunohistokemisk analys av hjärnskivor. Varje forskargrupp som har använt denna teknik kan uppskatta att den kräver särskild uppmärksamhet på små detaljer för att uppnå en framgångsrik fläck. Till exempel är ett viktigt steg DNA-denaturering med HCl, vilket gör att den kan nå cellkärnan för att fläcka den. De befintliga vetenskapliga rapporterna beskriver dock mycket få av sådana steg i detalj. Därför är det utmanande för nya laboratorier att standardisera tekniken eftersom det kan ta flera månader att ge positiva och framgångsrika resultat. Syftet med detta arbete är att beskriva och utarbeta stegen för att få positiva och framgångsrika resultat av immunfärgningstekniken i detalj när man arbetar med tymidinanalogen BrdU. Protokollet innefattar reagensberedning och installation, administrering av tymidinanalog i en gnagare, transkardiell perfusion, vävnadsberedning, peroxidasimmunohistokemisk reaktion, användning av avidin-biotinkomplex, immunofluorescens, motfärgning, mikroskopiavbildning och cellanalys.

Metoderna som beskrivs ovan tillämpades för att kvantifiera nyfödda celler i vuxen råtta hippocampus efter frivillig fysisk aktivitet, i motsats till en kontrollgrupp utan någon extra fysisk aktivitet. Vi använde postnatal råtta hippocampus som en positiv kontroll. Hanråttor 3 månaders ålder var under ett frivilligt fysiskt aktivitetsprotokoll (oändligt hjul) i sju dagar. På dag 6 injicerades råttor med BrdU (avsnitt 2) och var 12:e timme efter tre fullständiga injektioner. För att slutföra tre cellcykeldelningar perfuserades djuren transkardiellt (avsnitt 3) 8 timmar efter den sista BrdU-injektionen. Samma förfarande användes på tre månader gamla råttor som inte genomgick fysisk aktivitet för att användas som en jämförande kontroll. Som en positiv kontroll injicerades en dag gamla råttungar (postnatal dag 1) med BrdU en gång, enligt beskrivningen i avsnitt 2 ovan. En dag efter injektionen (postnatal dag 2) avlivades ungarna och deras huvuden nedsänktes i PFA-lösning, enligt beskrivningen i steg 3.4. Vuxna råttor var djupt sövda (steg 3.1), transkardiellt perfuserade, enligt beskrivningen i steg 3.2. Hjärnor dissekerades och postfixerades (steg 3.4). Hjärnorna skars i 40 μm koronasektioner (steg 3.5). Avsnitt behandlades för BrdU-immunhistokemi, enligt beskrivningen i steg 4.
Vi använde pepparrotsperoxidasreaktion med DAB IHC för färgning (steg 4.1) och räkning av BrdU-positiva celler i DG. Figur 5 visar ett GD-avsnitt med BrdU-märkta celler. Figur 5C,D visar en representativ del av generaldirektoratets sektion med högre förstoring. Märkta celler visade intensiv mörk färgning, som var markerade med pilar. Insatsen visar det genomsnittliga antalet märkta celler i experiment- och kontrollgrupperna (räknade positiva celler multiplicerade med sex enligt beskrivningen i steg 8.1). En students t-test avslöjade signifikansskillnader mellan antalet BrdU-positiva celler (t (10) = 2,704, p = 0,0222). Kontrollgruppen som inte genomgick fysisk aktivitet visade 2 040 ± 314 celler (n = 6 råttor). Som jämförelse visade gruppen fysisk aktivitet i genomsnitt 3 606 ± 486 (n = 6 råttor) BrdU-positiva celler. Som observerats ökar exponeringen för fysisk aktivitet BrdU-positiva celler. Därför överensstämmer dessa resultat med andra rapporterade resultat som visar att fysisk aktivitet ökade cellproliferationen hos den vuxna dentate gyrus17.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig03.jpg"> Figur 3: Exempel på olika morfologi hos BrdU-märkt cellkärna. BrdU är en DNA-syntesmarkör som märker kärnan. I hippocampusregionen hade de BrdU-positiva kärnorna en halv oval form belägen i dentate gyrus sub-granulär zon. Eftersom BrdU införlivas av konkurrens kommer mängden som införlivas för varje cell att ha en variation som senare kommer att återspeglas i hur kärnan kommer att visualiseras. (A) Immunofluorescensbild. (B) En bild med peroxidasreaktion utan ytterligare förstärkningsmetod presenteras. Gula pilar visar artefakter och icke-specifika signaler. Svarta eller vita pilar visar BrdU+-celler. 1 - Helt arkiverad kärna, halvovala kärnor mycket färgade. 2 - Kärnor med prickar, kärnans kant är markerad och har inuti flera prickar. 3 - Kärnor med få prickar, kärnans kant är markerad och har ett litet antal prickar inuti. 4 - Liten kärna är möjliga celler i ett annat differentieringsstadium men fortfarande en del av nischen. 5 - Kluster är prekursorceller under delning, därför kan flera celler tillsammans i kondenserade grupper observeras. Inom dessa grupper måste räkningen göras särskilt noggrant för att undvika felmärkning av positiva celler. Röda pilar visar kärnan under delning som kan förväxlas för att vara en enda cell. Varje cell är innesluten i en låda och kan särskiljas i ett Z-axelplan i realtid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig04.jpg"> Bild 4: Representativ RGB-bild för enskilda och sammanslagna kanaler. Den övre bilden visar den ursprungliga z-stackbilden och den nedre bilden visar den 3D-dekonvoluterade z-stackbilden. A) Låg förstoring av generaldirektoratet. (B) RGB-bild för varje kanal och (C) sammanfogad RGB-bild. Detta var en hjärna från kontrollgruppen. Immunofluorescens användes utan en ytterligare förstärkningsmetod. BrdU (röd), DAPI som motfärgning (blå) och GFAP (glialfibrillär surt protein) som en astroglial markör (grön). ML = molekylärt skikt; GCL = granulärt cellskikt; SGZ = subgranulär zon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig05.jpg"> Figur 5: Representativt GD-avsnitt med BrdU-märkta celler (intensivt mörkt) för varje experimentgrupp. Peroxidasreaktionen användes med avidin-biotin-peroxidaskomplexförstärkningsmetoden. (A, B) Visa en låg förstoring av GD och (C, D) visa rutområdet med högre förstoring. Panelerna A och C är vävnader från gruppen fysisk aktivitet, panelerna B och D är från kontrollgruppen. Insatsen visar det genomsnittliga antalet märkta celler i grupperna för fysisk aktivitet och kontroll (räknade positiva celler multiplicerade med sex enligt beskrivningen i steg 8.1). ML = molekylärt skikt; GCL = granulärt cellskikt; SGZ = subgranulär zon; pilar indikerar BrdU+-celler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>
Video 1: Video som visar ett annat fokus för positiva celler längs z-axeln fördelade i olika lager. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61483/VIDEO_1.avi" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här videon.</a>
Video 2: Video som visar ett annat fokus för positiva cellkluster längs z-axeln fördelade i olika lager. Rör dig långsamt över z-axeln för att kvantifiera alla flera kärnor som integrerar ett kluster. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61483/VIDEO_2.mp4" target="_blank">Klicka här för att ladda ner den här videon.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Typ av mikroskop:</td>
			<td colspan="5">Epifluorescens mikroskop Olympus BX53</td>
		</tr><tr><td>Ljuskälla:</td>
			<td colspan="5">Högtrycks 130 W kvicksilverbågslampa (U-HGLGPS)</td>
		</tr><tr><td>Programvara för förvärv:</td>
			<td colspan="5">CellSens Standard</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Filteruppsättningar:</td>
			<td colspan="2">Katalognummer</td>
			<td>Excitation intervall</td>
			<td>Dikromatisk spegel</td>
			<td>Undertryckande intervall</td>
		</tr><tr><td colspan="2">U-FUW</td>
			<td>340 - 490 nm</td>
			<td>410 nm</td>
			<td>420 nm</td>
		</tr><tr><td colspan="2">U-FBW</td>
			<td>460 - 495 nm</td>
			<td>505 nm</td>
			<td>510 nm</td>
		</tr><tr><td colspan="2">U-FGW</td>
			<td>530 - 550 nm</td>
			<td>570 nm</td>
			<td>575 nm</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Kamera:</td>
			<td colspan="2">Modell:</td>
			<td colspan="3">CCD-kamera UC50</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Spektralområde:</td>
			<td colspan="3">290 – 1000 nm</td>
		</tr><tr><td colspan="2">CCD-chip storlek:</td>
			<td colspan="3">2/3 tum, 2588 (bredd *7) x 1960 (höjd *8) pixlar</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Pixelstorlek:</td>
			<td colspan="3">3,4 x 3,4 μm</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">Fluorokrom:</td>
			<td colspan="2">Namn</td>
			<td>Excitation våglängd (nm)</td>
			<td>Emission *3 Våglängd (nm)</td>
			<td>Utsläpp Färg</td>
		</tr><tr><td colspan="2">4, 6-diamidino-2-fenyl-indol HCI (DAPI)</td>
			<td>345</td>
			<td>455</td>
			<td>Blå</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Tetrametylrhodamin-isotyocyanat (TRITC)</td>
			<td>541</td>
			<td>572</td>
			<td>Röd</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Fluorescein-isotiocyanat (FITC)</td>
			<td>494</td>
			<td>519</td>
			<td>Grön</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Cy3</td>
			<td>552</td>
			<td>565</td>
			<td>Röd</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">Montering Medium och nedsänkningsolja:</td>
			<td colspan="3">Namn</td>
			<td colspan="2">Index för medias brytning *1</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Luft (inget mellan bilden och linsen)</td>
			<td colspan="2">1.00029</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Antifade monteringsmedium med DAPI</td>
			<td colspan="2">1.45</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Permount monteringsmedium</td>
			<td colspan="2">1.519</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Olja med låg autofluorescens nedsänkning (MOIL-30 typ F)</td>
			<td colspan="2">1.518</td>
		</tr><tr><td rowspan="6">Förstoringslins (Plan fluorit)</td>
			<td>Förstoring</td>
			<td>Numerisk bländare (NA) *2</td>
			<td>Upplösning (μm)</td>
			<td>Bildpixelavstånd (nm) *5</td>
			<td>Segmentavstånd Z-axel (nm) *6</td>
		</tr><tr><td>4X</td>
			<td>0.13</td>
			<td>2.12</td>
			<td>850</td>
			<td>3000</td>
		</tr><tr><td>10X</td>
			<td>0.3</td>
			<td>0.92</td>
			<td>340</td>
			<td>3000</td>
		</tr><tr><td>20X</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.55</td>
			<td>27S</td>
			<td>2000</td>
		</tr><tr><td>40X</td>
			<td>0.75</td>
			<td>0.37</td>
			<td>85</td>
			<td>1000</td>
		</tr><tr><td>100X</td>
			<td>1.3</td>
			<td>0.21</td>
			<td>34</td>
			<td>1000</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 2: Specifikationer för mikroskopinställning och krav på att skapa punktspridningsfunktioner (PSF). Det finns 11 platser i diffraktionsfönstret PSF 3D-plugin för att skapa PSF-filen. Varje kortplats beskrivs enligt följande: *1 - Brytningsindex för mediet: brytningsindex för mediet mellan bilden och linsen (t.ex. luft = 1,00029). *2 - Numerisk bländare: NA för lins som används (det måste korrigeras när ett annat nedsänkningsmedium används och linsen tilldelades). *3 - Våglängd: Fluorokrom maximal emissionsvåglängd (nm). *4 - Längsgående sfärisk avvikelse: 0,00. *5 - Bildpixelavstånd: CCD-pixelstorlek (nm)/Förstoring (t.ex. 3,4 μm och 100X-objektiv, 3400/100 = 34 nm). *6 - Avstånd mellan bilder Z-axel. *7 - Bredd: Ange bredden på bilden som ska avbildas i pixlar. *8 - Höjd: Ange höjden på bilden som ska avbildas i pixlar. *9 - Djup, segment: antalet bilder i z-stacken. *10 - Normalisering: Summan av pixelvärden = 1. *11 - Titel: Önskat namn för PSF-filen. Filen ska matcha den unika givna z-stack-bilden.

Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemistry Techniques to Analyze Cellular Proliferation and Neurogenesis in Rats Using the Thymidine Analog BrdU at JoVE.com

Immunohistochemistry Techniques to Analyze Cellular Proliferation and Neurogenesis in Rats Using the Thymidine Analog BrdU

Denna artikel presenterar fyra av de vanligaste teknikerna för att visualisera BrdU-positiva celler för att mäta vuxen neurogenes hos råttor. Detta arbete inkluderar instruktioner för reagensberedning, tymidinanalog administrering, transkardiell perfusion, vävnadsberedning, peroxidasimmunhistokemisk reaktion, immunofluorescens, signalförstärkning, motfärgning, mikroskopiavbildning och cellanalys.

Immunohistokemi tekniker för att analysera cellulär proliferation och neurogenes hos råttor med hjälp av tymidinanalogen BrdU

One of the most important things in the field of adult hippocampal neurogenesis (AHN) is the identification of the newly generated cells. The ...

Research

JoVE Journal

Biology

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

Kortikala Neurogenesis: Övergång från Förskott i laboratoriet för att cellbaserade terapier

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Immunohistokemi: Paraffinsnitt Använda Vectastain ABC Kit från Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

Immunohistokemi på Paraffinsnitt av Mouse Epidermis med fluorescerande antikroppar

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

Drosophila Larvernas NMJ Immunohistokemi

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Mikroinjektion Tekniker för att studera Mitos i Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp och tekniker perfusion för att studera jonkanaler Uttryckt i Xenopus Oocyter

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Granskning av proteiner bundna till Nascent DNA i däggdjursceller med användning BrdU-Chip-Slot-Western Teknik

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Använda mikroflödessystem enheter för att mäta livslängd och Cellular fenotyper i Single Budding jästceller

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

Tekniker för att inducera och kvantifiera cellulärt åldrande

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

Enkel och effektiv Administration och visualisering av mikropartiklar i cirkulationssystemet av små fiskar använder njure injektion

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...