Name: immunohistochemistry techniques to analyze cellular proliferation and neurogenesis in rats using the thymidine analog brdu
Uploaded: 2020-09-09T14:30:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemistry Techniques to Analyze Cellular Proliferation and Neurogenesis in Rats Using the Thymidine Analog BrdU at JoVE.com

Sayın Miguel Burgos'a ve Gustavo Lago'ya teknik yardım sağladıkları için teşekkür ederiz. Ayrıca Dr. Clorinda Arias, Dr. Karla Hernandez ve Dr. Oscar Galicia'ya reaktifler ve malzeme sağlamadaki nazik destekleri için teşekkür ederiz. Ayrıca, Universidad Iberoamericana Ciudad de México'dan División de Investigación y Postuvo'ya, bu çalışmanın performansı için finansman sağladığı ve video prodüksiyon masraflarını karşıladığı için teşekkür ederiz.

<ol>
	<li>Altman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+new+neurons+formed+in+the+brains+of+adult+mammals.">Are new neurons formed in the brains of adult mammals.</a> Science. 135 (3509), 1127-1128 (1962).</li><li>Altman, J., Das, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoradiographic+and+histological+evidence+of+postnatal+hippocampal+neurogenesis+in+rats.">Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats.</a> The Journal of Comparative Neurology. 124 (3), 319-335 (1965).</li><li>Miller, M. W., Nowakowski, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+bromodeoxyuridine-immunohistochemistry+to+examine+the+proliferation,+migration+and+time+of+origin+of+cells+in+the+central+nervous+system.">Use of bromodeoxyuridine-immunohistochemistry to examine the proliferation, migration and time of origin of cells in the central nervous system.</a> Brain Research. 457 (1), 44-52 (1988).</li><li>Eriksson, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurogenesis+in+the+adult+human+hippocampus.">Neurogenesis in the adult human hippocampus.</a> Nature Medicine. 4 (11), 1313-1317 (1998).</li><li>Filippov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpopulation+of+nestin-expressing+progenitor+cells+in+the+adult+murine+hippocampus+shows+electrophysiological+and+morphological+characteristics+of+astrocytes.">Subpopulation of nestin-expressing progenitor cells in the adult murine hippocampus shows electrophysiological and morphological characteristics of astrocytes.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 23 (3), 373-382 (2003).</li><li>Kempermann, G., Jessberger, S., Steiner, B., Kronenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milestones+of+neuronal+development+in+the+adult+hippocampus.">Milestones of neuronal development in the adult hippocampus.</a> Trends in Neurosciences. 27 (8), 447-452 (2004).</li><li>Matia&#353;ov&#225;, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+determination+of+5-bromo-2'-deoxyuridine+pharmacokinetics+in+blood+serum+after+intraperitoneal+administration+to+rats+and+mice.">Flow cytometric determination of 5-bromo-2'-deoxyuridine pharmacokinetics in blood serum after intraperitoneal administration to rats and mice.</a> Histochemistry and Cell Biology. 142 (6), 703-712 (2014).</li><li>Von Bohlen Und Halbach, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistological+markers+for+proliferative+events,+gliogenesis,+and+neurogenesis+within+the+adult+hippocampus.">Immunohistological markers for proliferative events, gliogenesis, and neurogenesis within the adult hippocampus.</a> Cell and Tissue Research. 345 (1), 1-19 (2011).</li><li>Sage, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DeconvolutionLab2:+An+open-source+software+for+deconvolution+microscopy.">DeconvolutionLab2: An open-source software for deconvolution microscopy.</a> Methods. 115, 28-41 (2017).</li><li>Manz, W., Arp, G., Schumann-Kindel, G., Szewzyk, U., Reitner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widefield+deconvolution+epifluorescence+microscopy+combined+with+fluorescence+in+situ+hybridization+reveals+the+spatial+arrangement+of+bacteria+in+sponge+tissue.">Widefield deconvolution epifluorescence microscopy combined with fluorescence in situ hybridization reveals the spatial arrangement of bacteria in sponge tissue.</a> Journal of Microbiological Methods. 40 (2), 125-134 (2000).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Abr&#224;moff, M. D., Magalh&#227;es, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+with+imageJ.">Image processing with imageJ.</a> Biophotonics International. 11 (7), 36-41 (2004).</li><li>. 2D and 3D Fluorescence Deconvolution Manual Available from: <a target="_blank" href="https://pages.stolaf.edu/wp-content/uploads/sites/803/2016/12/Giannini_Giannini_Deconvolution_Manual_20161215.p">https://pages.stolaf.edu/wp-content/uploads/sites/803/2016/12/Giannini_Giannini_Deconvolution_Manual_20161215.p</a> (2016)</li><li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrdU+immunohistochemistry+for+studying+adult+neurogenesis:+Paradigms,+pitfalls,+limitations,+and+validation.">BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation.</a> Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).</li><li>Revilla, V., Jones, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryostat+sectioning+of+brains.">Cryostat sectioning of brains.</a> International Review of Neurobiology. 47, 61-70 (2002).</li><li>Amaral, D. G., Scharfman, H. E., Lavenex, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dentate+gyrus:+fundamental+neuroanatomical+organization+(dentate+gyrus+for+dummies).">The dentate gyrus: fundamental neuroanatomical organization (dentate gyrus for dummies).</a> Progress in brain research. 163, 3-22 (2007).</li><li>Eadie, B. D., Redila, V. A., Christie, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voluntary+exercise+alters+the+cytoarchitecture+of+the+adult+dentate+gyrus+by+increasing+cellular+proliferation,+dendritic+complexity,+and+spine+density.">Voluntary exercise alters the cytoarchitecture of the adult dentate gyrus by increasing cellular proliferation, dendritic complexity, and spine density.</a> Journal of Comparative Neurology. 486 (1), 39-47 (2005).</li><li>Leal-Galicia, P., Romo-Parra, H., Rodr&#237;guez-Serrano, L. M., Buenrostro-J&#225;uregui, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+adult+hippocampal+neurogenesis+exerted+by+sexual,+cognitive+and+physical+activity:+An+update.">Regulation of adult hippocampal neurogenesis exerted by sexual, cognitive and physical activity: An update.</a> Journal of Chemical Neuroanatomy. 101, 101667 (2019).</li><li>Gould, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+widespread+is+adult+neurogenesis+in+mammals.">How widespread is adult neurogenesis in mammals.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 481-488 (2007).</li><li>Ngwenya, L. B., Peters, A., Rosene, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+and+electron+microscopic+immunohistochemical+detection+of+bromodeoxyuridine-labeled+cells+in+the+brain:+Different+fixation+and+processing+protocols.">Light and electron microscopic immunohistochemical detection of bromodeoxyuridine-labeled cells in the brain: Different fixation and processing protocols.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (7), 821-832 (2005).</li><li>Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemistry+and+multiple+labeling+with+antibodies+from+the+same+host+species+to+study+adult+hippocampal+neurogenesis.">Immunohistochemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (98), e52551 (2015).</li><li>Tuttle, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunofluorescent+detection+of+two+thymidine+analogues+(CldU+and+IdU)+in+primary+tissue.">Immunofluorescent detection of two thymidine analogues (CldU and IdU) in primary tissue.</a> Journal of Visualized Experiments. (46), e2166 (2010).</li><li>Tischler, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triple+immunohistochemical+staining+for+bromodeoxyuridine+and+catecholamine+biosynthetic+enzymes+using+microwave+antigen+retrieval.">Triple immunohistochemical staining for bromodeoxyuridine and catecholamine biosynthetic enzymes using microwave antigen retrieval.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 43 (1), 1-4 (1995).</li><li>Taupin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocols+for+studying+adult+neurogenesis:+Insights+and+recent+developments.">Protocols for studying adult neurogenesis: Insights and recent developments.</a> Regenerative Medicine. 2 (1), 51-62 (2007).</li><li>Leuner, B., Glasper, E. R., Gould, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thymidine+analog+methods+for+studies+of+adult+neurogenesis+are+not+equally+sensitive.">Thymidine analog methods for studies of adult neurogenesis are not equally sensitive.</a> Biosystems. 517 (2), 123-133 (2010).</li><li>Magavi, S. S., MacKlis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+newborn+cells+by+BrdU+labeling+and+immunocytochemistry+in+vivo.">Identification of newborn cells by BrdU labeling and immunocytochemistry in vivo.</a> Methods in Molecular Biology. 438, 335-343 (2008).</li><li>Kempermann, G., Gast, D., Kronenberg, G., Yamaguchi, M., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+determination+and+long-term+persistence+of+adult-generated+new+neurons+in+the+hippocampus+of+mice.">Early determination and long-term persistence of adult-generated new neurons in the hippocampus of mice.</a> Development. , 391-399 (2003).</li><li>Ramos-Vara, J. A., Beissenherz, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+immunohistochemical+methods+using+two+different+antigen+retrieval+methods+on+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues:+Experience+with+63+markers.">Optimization of immunohistochemical methods using two different antigen retrieval methods on formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: Experience with 63 markers.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. 12 (4), 307-311 (2000).</li><li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+methods+of+immunohistochemistry.">Principles and methods of immunohistochemistry.</a> Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).</li><li>Wojtowicz, J. M., Kee, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BrdU+assay+for+neurogenesis+in+rodents.">BrdU assay for neurogenesis in rodents.</a> Nature Protocols. 1 (3), 1399-1405 (2006).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Yetişkin nörogenezi, yaşamları boyunca yeni nöronlar üretme potansiyeline sahip yetişkin nöral öncü hücrelerin nişlerinde en sık görülen bir süreçtir. Bromodeoksiüridin (BrdU) etiketlemesi, yetişkin bir beyinde yeni üretilen hücrelerin sayısını karakterize etmek için immünolojide yaygın olarak kullanılmaktadır. BrdU esas olarak ayrı beyin bölgelerinin (nörojenik bölgeler) hücrelerine dahil edilecektir. Bu hücreler, hipokampusun dentat girusu olan sub-ventriküler bölgede (SVZ) bulunur - hilus ve sub-granüler bölge (SGZ) olarak bilinen granüler hücreler arasında1,2,18. Dahası, yetişkinlikte hipotalamus, striatum, neokorteks ve amigdala19 dahil olmak üzere daha düşük proliferatif kapasite ile karakterize farklı beyin bölgeleri vardır. Daha önce de belirtildiği gibi, BrdU boyama, hücre proliferasyonunu tespit etmek için yetişkin nörogenez araştırmaları için yaygın olarak kullanılan yöntemdir. Bununla birlikte, BrdU'nun bir belirteç olarak kullanılmasının sınırlamaları ve tuzakları vardır. Birincisi, BrdU'nun bir hücre döngüsü belirteci olmasıdır. Bu nedenle, hücre kaderini tanımlamak için çift veya üçlü boyama yapılmalı ve etiketlenen hücrelerin spesifik gelişim aşamasını tespit etmek için hücre belirteçleri içermelidir. BrdU ile ilgili bir başka endişe, DNA stabilitesini değiştiren toksik ve mutajenik bir çözelti olmasının hücresel fonksiyonu ve hücre döngülerini değiştirebilmesidir. Bir uygulama protokolünü ve uygulama dozlarını (50 \ u2012600 mg / kg) izlemeye karar verirken önceki bilgilere dikkat edilmelidir. Bir diğer önemli özellik, BrdU'nun bir hücre çoğalma belirteci14 değil, bir DNA sentez belirteci olmasıdır. Bu nedenle, hücre proliferasyonunu DNA onarımı, abortif hücre döngüsü yeniden girişi ve gen duplikasyonu gibi diğer olaylardan ayırt etmek önemlidir. Araştırmacılar, BrdU'nun uygun kullanımını sağlamak için uygun kontrolleri takip etmelidir. Bu sorunlar ve sınırlamalar hakkında daha ayrıntılı bir tartışma için, Taupin'in14 numaralı çalışmasını gözden geçirmenizi öneririz. Bir immünohistokimya protokolünün standardizasyon süreci yavaş ve zorlu olabilir. Bu çalışmada, başarılı bir IHC protokolünü yönetmek için tüm genel adımları sunduk. Bununla birlikte, her araştırma grubunun doku, antikorlar ve koşulları önceden test etmesini ve değerlendirmesini öneririz. Test ve değerlendirmeler, test edilen her antikor ve doku için en az üç farklı inkübasyon seviyesi, yıkama adımları ve güçlü yönlerle yapılmalıdır. Ayrıca, araştırmacıların belirli ihtiyaçları ve gereksinimleri karşılayan en iyisini seçebilmeleri için ek protokolleri gözden geçirmelerini öneririz20,21,22,23,24,25.
Daha önce de belirtildiği gibi, prosedür, daha sonra tartışılacak olan bilimsel makalelerde yaygın olarak kullanılan ve bahsedilen birkaç adım ve metodolojik hususları içerir. Araştırmacıların antikorları teknik, bütçe, ekipman, kurulum ve ana araştırma hedefi açısından dikkatli ve doğru seçmelerini öneririz. Antikorlar, daha sonra deneyde test edilecek olan aynı doku türüyle test edilmelidir. Ayrıca, fiksasyon tekniği ile uyumluluğunu test etmek için aynı amaç için test edilmiş bir antikorun (IHC) (yani, sadece batı lekesi veya akış sitometrisi tekniklerinde değil) kullanılmasını öneririz. BrdU boyamasını uygulamak için intraperitoneal enjeksiyon, intraperitoneal infüzyon, oral alım veya intraventriküler infüzyon gibi farklı yollar kullanılabilir (her tekniğin daha ayrıntılı bir açıklaması için bkz. referans26). İntraperitoneal enjeksiyon seçilirse, BrdU'nun bağırsak bölgesinden kaçınarak periton boşluğuna uygulandığından emin olun. Bağırsak, BrdU'yu beyne ulaşmadan önce tüketebilecek ve etiketlenmiş hücrelerin sayısını etkileyecek olan çoğaltmada birkaç hücreye sahip olduğundan. İnce kesitler elde etmek çok önemlidir, çünkü çözeltilerin daha iyi nüfuz etmesine izin verirler. 40 μm kalınlığındaki koronal dilimler rostro-kaudal olarak kesildi ve Kempermann ve ark.27 tarafından önerilen stereolojik prosedürü izleyerek 24 kuyucuklu bir hücre kültürü plakasına aktarıldı. İmmünohistokimya, slaytlara monte edilmiş doku ile veya serbest yüzen bölümler halinde gerçekleştirilebilir. BrdU, hücre çekirdeklerinin derinliklerinde bulunduğundan, çözeltilerin serbest yüzen bölümlere nüfuz etmesine izin verir, bu da daha iyi sonuçlar ve ilgi alanına daha iyi erişim sağlar. Birincil anti-BrdU antikoruna erişim sağlamak için DNA bağlarını (DNA denatürasyonu) açmak önemlidir. Bu çalışmada, HCI inkübasyonunu kullanarak bu özel prosedürleri gerçekleştirdik. Öte yandan, spesifik olmayan epitopları bloke etme işlemi, hücre sinyalinin daha doğru bir şekilde tanımlanmasını sağladı.
İyi membran geçirgenliği, antikorların ilgi alanına düzgün bir şekilde nüfuz etmesini sağlar. PBS++ ve PBS+ çözümlerine Triton X-100 gibi bir geçirgenleştirici eklenmesi, membran geçirgenliğini artırır. Bu protokolde hem PBS hem de Tris arabelleğe alınmış salin (TBS) reaktifleri kullanılabilir. Bütçe açısından, TBS, PBS'den daha ucuz görelilik olabilir. Bununla birlikte, PBS anti-fosfat antikorlarına müdahale edebilir ve alkali fosfataz konjuge antikorları inhibe edebilir, bu nedenle hedef fosforilasyon ile translasyonel olarak modifiye edilmişse (yani fosforile edilmiş) PBS kullanımından kaçının. Bu çalışma için PBS'yi kullandık ve doku yıkama adımlarının daha spesifik bir sinyal verdiğini öğrendik. Ayrıca araştırmacıların TBS o PBS kullanarak en az üç yıkama döngüsü gerçekleştirmelerini öneririz. Çözeltiler taze hazırlanmalıdır. Antijen geri kazanımı (AR), üçüncül ve kuaterner antijenlerin yapısını değiştiren fiksasyonun neden olduğu antijenite kaybını azaltmayı amaçlayan bir yöntemdir. Bu azalma antijenleri antikorlar tarafından saptanamaz hale getirir28,29. Bu protokolde kullanılan ısıya bağlı epitop geri kazanımı (HIER), formaldehit ve proteinler arasındaki kimyasal reaksiyonları yüksek sıcaklık veya güçlü alkali hidroliz yoluyla (EDTA pH 8.5 veya Tris pH 9.5 gibi diğer tampon çözeltileri ile) tersine çevirmeye çalıştı. Sonuçları karşılaştırmak ve protokol için en iyisini seçmek için yeni antikorları farklı AR protokolleriyle test etmek önemlidir. Bu son adım normal bir protokolde isteğe bağlı olabilir; ancak bu protokol için daha iyi sonuçlar sağlamak amacıyla dokuları antijen geri alma protokolü ile tedavi ettik.
Lekelenmeyen bir yapıyı görünür kılmak ve birincil boyama rengini bağışıklık reaksiyonundan maskelemekten kaçınmak için kullanılan birincil boyama rengi ve yöntemi göz önünde bulundurularak doğru nihai kontrast rengin ve karşı leke tekniğinin seçilmesi çok önemlidir. Floresan mikroskobu için, DAPI (4', 6-diamidino-2-fenilindol), DNA'nın AT bölgelerine bağlandıktan sonra mavi floresan (emilim: 360 nm, emisyon: 460 nm) yayan çok popüler bir nükleer ve kromozom karşı boyasıdır. DAPI içeren montaj ortamı mevcuttur ve kullanımı kolaydır; bu, görüntü alımı için mükemmel sinyal tutma sağlar. Peroksit reaksiyonu için IHC, cresyl violet, hematoxylin, nötr kırmızı veya metil yeşili boyama gibi farklı seçeneklerde mevcuttu. Çoklu immün boyama teknikleri için, çapraz reaktiviteyi önlemek için kullanılan fiksasyon tekniği ile uyumlu bir antikor seçmek çok önemlidir30. Tek boyama ile ilgili sorunlar ve komplikasyonlar çözüldüğünde, gerekli gördüğü şekilde başka bir renk boyama uygulayın. Sekonder antikorlar arasındaki spesifik olmayan bağlanmayı kontrol etmek çok önemlidir. Bu, birincil antikorların aynı konakçı türünde üretilen ikincil bir antikor kullanılmadan önce birincil antikorların doyurulmasıyla yapılabilir. Örneğin, tavşanda üretilen anti-fare ve keçi sekonder antikorlarında üretilen anti-tavşan kullanıldığında, keçi antikorunda üretilen anti-tavşan, tavşan antikorunda üretilen anti-fareden önce kullanılmalıdır. Sıralı yönteme tamamen hakim olunduğunda, eşzamanlı immün boyama işlemi başlatılabilir. Bu yöntemde sekonder antikorların uygun şekilde seçilmesi esastır. İdeal olarak, çapraz reaktiviteyi önlemek için tüm bu antikorlar aynı konakçı hayvandan gelmelidir. Boyama yönteminin doğum sonrası hipokampus dokusunda (bu yaşta bol miktarda nörogenez) doğru çalıştığını doğrulamak için pozitif bir kontrol yapmanızı öneririz. Pozitif kontrol dokusu boyama problemleri gösteriyorsa, prosedürü gözden geçirin ve gözden geçirin, düzeltmeler ve ayarlamalar yapın ve iyi bir boyama oluşana kadar tekrarlayın. Ardından, belirli bir birincil antikoru atlayarak veya normal serum (birincil antikor ile aynı tür) ile değiştirerek antikorun doğru çalıştığını test etmek için negatif bir kontrol çalıştırın. Girişte belirtildiği gibi, görüntü dekonvolüsyonu güçlü bir araçtır ve konfokal mikroskop mevcut olmadığında bir alternatif sunar. Görüntü dekonvolüsyonunu, iletilen ışık parlak alanı, geniş alan floresansı ve konfokal floresan mikroskobu kullanılarak elde edilen tüm görüntülere uygulayabilir. Görüntü dekonvolüsyonunun nihai amacı, edinme sisteminin bozulduğu orijinal sinyali yeniden yapılandırmaktır10.
Özetle, timidin analog BrdU'nun immünostepsiyonu ile görselleştirilen yeni üretilen hücrelerin tanımlanması karmaşık ama güçlü bir tekniktir. Bu çalışma, özellikle yetişkin hipokampal nörogenez alanındaki bilim adamlarının yeni hücreleri daha doğru bir şekilde ölçmelerine yardımcı olma girişimidir. Bu çabanın bilimsel topluluğa yardımcı olduğunu ve immünohistokimya tekniği ile hücre proliferasyonu çalışmasına ince ayar yapmayı kolaylaştırdığını umuyoruz.

Yaşam süresi boyunca yetişkin insan beyninde yeni nöronların üretildiği fikri, bilim camiasını on yıllardır büyülemiştir. Beynin ömrü boyunca yeni nöronlar ürettiği bilgisi,bölüm 1,2 altındaki hücrelerin tespiti ile elde edildi. Yetişkin beyninde yeni üretilen nöronların tespiti ilk olarak sıçanlarda intrakraniyal olarak tritiye timidin (timidin-H3) enjekte edilmesi ve hücre döngüsündeki hücrelerin otoradyogramlar 1,2 ile tespit edilmesi ile tanımlanmıştır. Glia'nın hücre bölünmesi ve nöroblastların varlığı bildirilmiştir, bu da doğum sonrası nörogenez1 ile ilgili ilk umut verici verilerdir. Bununla birlikte, timidin-H3'ün kullanımı ve tespiti, onu yöneten insanlara zararlı olabilecek radyoaktivite kullanımını ima etmiştir. BrdU immünohistokimyasının sinir sistemlerindeki hücrelerin proliferasyon, migrasyon ve kökeni çalışmalarındaki uygunluğunu inceleyen ilk çaba 1988'de Miller ve Nowakowski3 tarafından ortaya çıktı. 1998 yılında, Eriksson ve meslektaşları tarafından yayınlanan bir makale, 5-Bromo-2′-deoksiüridin (BrdU)4 enjekte edilen hastaların insan yetişkin beyninde yeni nöronların ölüm sonrası görselleştirildiğini gösterdi. Bu hastalara tümörlerin büyümesini etiketlemek için BrdU enjeksiyonu (250 mg intravenöz)4 verildi. Bu teknik hayvan modellerine uyarlandı. Bu yöntemlerin tanıtılması, alan için bir kilometre taşını işaret etti, çünkü bu, radyoaktif bileşikler kullanılmadan yeni üretilen hücrelerin tespit edilmesine izin verdi. Bu prosedür, bu alanda daha fazla araştırmayı teşvik etmek için yetişkin beyin nişlerinde hücre proliferasyonunu ölçmek için altın standart haline geldi.
Timidin analog tekniğinin sınırlılığı, yeni üretilen hücreler için hücresel kimliğin belirlenmesine izin vermemesidir. Bununla birlikte, immünohistokimya, aynı hücrenin çift veya üçlü etiketleme tekniğini gerçekleştirmemize izin verir, bu da yeni üretilen hücrelerin hücresel kaderini ve hatta olgunlaşma aşamalarını doğrular ve alanın daha da gelişmesine yol açar. Bu yöntem, yeni üretilen hücreleri glia, farklılaşmamış nöronlar veya tamamen olgun granüler bir hücreye ayırt etmek ve hatta devreye aktif olarak katılıp katılmadıklarını belirlemek için karakterize edildi. Bu alandaki bir diğer atılım, nestin alanı altındaki farklılaşmamış hücreleri tanımlamak için transgenik modellerin kullanılmasıydı. Nestin-GFP transgenik fareler, nestin promotörünün kontrolü altında olan gelişmiş bir yeşil floresan proteini (GFP) ifade eder. Nestin, progenitör hücreler5 ile karakterize bir ara filamenttir. Nestin-GFP transgenik fareler, nörogenez6'da yer alan erken gelişimsel adımları belirlemeye izin verdi. Bununla birlikte, önemli bir sınırlama, bir nestin-GFP transgenik fare kolonisini, bazı bilimsel gruplar, özellikle de gelişmekte olan ülkelerden gelenler için uygun maliyetli hale gelen bir laboratuvar tesisinde özel koşullar altında sürdürebilmektir.
Yukarıda belirtilen tekniklerin avantajları ve dezavantajları vardır. Bununla birlikte, proliferasyon yapan hücrelerin immünohistokimya (IHC) ile tanımlanması ve hücre olgunlaşma aşamasını veya hücre kaderini tanımlamak için immünofloresan ile çift veya üçlü etiketleme tekniği uygulama olasılığı, yetişkin nörogenezini ölçmenin şimdiye kadarki en uygun yolunu temsil etmektedir. İmmünohistokimyayı kullanan tanımlama işlemi, proteinlerin, protein alanının veya nükleotidlerin, birincil antikor olarak bilinen tanınmalarını sağlayan spesifik bir antikor ile etiketlenmesinden oluşur. İkincisi, ikincil antikor ile birlikte bir kromojen (örneğin, yaban turpu peroksidaz) veya bir florokrom (örneğin, FITC) ile işaretlenmiş ikincil antikor tarafından tanınır. Mikroskoplar hem kromojenler hem de florokrom sinyallerini algılayabilir. IHC kullanarak, membran proteinlerini, sitoiskelet proteinlerini veya BrdU gibi nükleer bileşenleri tanımlamak mümkündür. Öte yandan, BrdU, hücresel çekirdekte bulunabilir, çünkü S-fazı sırasında DNA'ya rekabet yoluyla dahil edilir. Bu nedenle, çok önemli bir adım, BrdU antikorunun DNA içindeki BrdU'ya erişmesine izin vermek için DNA bağlarını açan HCl ile DNA denatürasyonudur. BrdU'nun, intraperitoneal uygulamadan sonra sırasıyla 15 ve 60 dakika boyunca farelerde ve sıçan serumunda doymuş bir konsantrasyonda mevcut olduğunu bilmek önemlidir, daha sonra sırasıyla 60 ve 120 dakikada tespit edilemeyen seviyelere hızla düşer7.
Burada, dört farklı fakat yakından ilişkili IHC tekniğini tanımlamaktayız: yaban turpu peroksidaz (HRP) reaksiyonu kullanılarak kromojenik dolaylı tespit, DAB (3,3'-diaminobenzidin) sans sinyal amplifikasyonu (adım 4.1), avidin-biyotin kompleksi (ABC) amplifikasyonu (adım 4.1), sinyal amplifikasyonu olmadan dolaylı immünofloresan tespiti (adım 4.4) ve etiketli streptavidin-biyotin (LSAB) amplifikasyonu (adım 4.3). Her yöntemin avantajları ve dezavantajları vardır ve spesifik doku gereksinimleri için yararlı olabilir (bkz. Tablo 1). Konjuge olmayan primer antikorları kullanırken kromojenik tespit yöntemlerinden floresan tespit yöntemlerine geçiş yapmak için uygun fiyatlı olmaları ve basitlikleri nedeniyle dolaylı ICH yöntemlerini izlemeye karar verdik. HRP yaklaşımı, satın alınabilirliği, yüksek istikrarı, yüksek devir hızı ve alt tabakaların tam kullanılabilirliği nedeniyle yaygın olarak kullanılan bir IHC yöntemidir. Bununla birlikte, boyama yönteminin doğru çalıştığını doğrulamak için pozitif bir kontrol kullanılmasını ve antikor fonksiyonunu etkili bir şekilde test etmek için negatif kontrolün kullanılmasını öneririz. Çoklu immünoboyamalar veya multipleks IHC yöntemleri (bkz. adım 6), tek bir deneyde doku bölümünden büyük miktarda veri elde etmek için güçlü araçlardır. Bu teknik, numunelerin mevcudiyeti sınırlı olduğunda özellikle önemlidir. Diğer bir avantaj, doku bütünlüğünü korurken aynı hücresel alanda birlikte eksprese edilen spesifik proteinleri aynı anda tanımlama olasılığıdır. Multipleks, spesifik proliferatif aşamalarda (örneğin, nestin, GFAP, DCX, Ki-67) ifade edilen farklı belirteçlerin boyanmasına izin vererek daha ayrıntılı bir proliferasyon ve farklılaşma araştırmasına ulaşmamızı sağlar8. Çapraz reaktiviteyi önlemek için kullanılan fiksasyon tekniği ile uyumlu antikorların seçilmesi çok önemlidir. Yöntemi ayarlamak ve hassaslaştırmak için her yeni antikorun (BrdU dahil) ayrı ayrı test edilmesini öneririz. Daha sonra, çift sıralı boyamayı uygulayın ve son olarak, sıralı yönteme tamamen hakim olduğunda eşzamanlı immün boyama işlemine başlayın. Bu yöntem için uygun sekonder antikorların seçilmesi çok önemlidir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Yöntem</td>
			<td>Özel Yöntem</td>
			<td>Avantaj -ları</td>
			<td>Dezavantaj -ları</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">Dolaylı Algılama Yöntemi</td>
			<td>DAB ile peroksidaz reaksiyonu</td>
			<td>1. Doğrudan algılama ve dolaylı floresan yönteminden daha yüksek hassasiyet. 2. Fotobeyazlatmaya karşı florokromlardan daha yüksek direnç. 3. Floresan algılama yönteminden daha düşük maliyet</td>
			<td>1. Daha az renk boyasıyla Çoklama için zor. 2. Aynı hücresel uzaydaki Birlikte eksprese edilen hedefler için karmaşıktır. 3. Aynı doku üzerinde eşzamanlı kıt ve yüksek bol hedefler için Azaltılmış Dinamik Aralık.</td>
		</tr><tr><td>Flore -san</td>
			<td>1. Daha fazla renk boyasıyla Çoklama için en iyi ve en kolay. 2. Aynı hücresel uzaydaki Birlikte ifade edilen hedefler için en iyisidir. 3. Aynı doku üzerinde eşzamanlı kıt ve yüksek bol hedefler için Daha İyi Dinamik Aralık. 4. Ek Adım Yok.</td>
			<td>1. DAB yöntemi ile dolaylı peroksidaz reaksiyonundan daha düşük hassasiyet. 2. Zamanla Fotobeyazlatmaya karşı zayıf direnç. 3. Daha pahalı.</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">Sinyal Amplifikasyon Yöntemi</td>
			<td>Avidin-Biotin Kompleksi (ABC)</td>
			<td>1. Doğrudan ve dolaylı algılama yönteminden daha yüksek hassasiyet. 2. Arka planı azaltın</td>
			<td>1. Ek Adımlar. 2. Amplifikasyondan daha pahalı.</td>
		</tr><tr><td>Etiketli Streptavidin-Biotin (LSAB)</td>
			<td>1. Doğrudan ve dolaylı algılama yönteminden daha yüksek hassasiyet. 2. ABC yönteminden daha önemli doku penetrasyonu. 3. Arka planı azaltın</td>
			<td>1. Ek Adımlar. 2. ABC yönteminden daha pahalı.</td>
		</tr><tr><td>Ek amplifikasyon yöntemi değil</td>
			<td>1. Daha düşük maliyet. 2. Ek adım yok. 3. Yüksek bol hedefler için idealdir.</td>
			<td>1. Düşük hassasiyet: bol miktarda hedef olmadan sorunlu.</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: İHH tekniklerinin avantajları/dezavantajları. Bu tablo dolaylı tespit yöntemlerinin avantajlarını/dezavantajlarını göstermektedir: (3,3'-diaminobenzidin) DAB ve floresan ile peroksidaz reaksiyonu; ve sinyal amplifikasyon yöntemleri: avidin-biyotin kompleksi (ABC), streptavidin-biotin (LSAB) etiketli ve ek amplifikasyon yöntemi değil.
Yüksek çözünürlüklü bir görüntü, doğru analiz yapmak ve sonuçları sunmak için esastır. Çözünürlüğü artırmak için iki yaklaşım vardır: 1) daha iyi bir mikroskop tasarımının kullanılması (örneğin, konfokal, multifoton) veya 2) dekonvolüsyon kullanarak görüntüleri geliştirmek için bulanıklaştırma işlemini sayısal olarak tersine çevirmek9. Ne yazık ki, konfokal mikroskopi, ekipmanın yüksek maliyetleri ve servis10 nedeniyle uygun değildir. Geniş alan epifloresan mikroskobu ve ardından z-yığını görüntülerinin dekonvolüsyonu, konfokal mikroskopi 8,9'a uygun, düşük maliyetli bir alternatif sağlar. Yukarıda belirtildiği gibi, dekonvolüsyon amacı, matematiksel kaldırma algoritmalarını kullanarak bir epifloresan veya konfokal mikroskop tarafından elde edilen görüntüde gösterilen bulanıklığı, odak dışı bulanıklığı ve bozulmayı azaltarak edinme sistemi9 tarafından bozulan orijinal sinyali geri yüklemektir10. Elde edilen bulanık görüntü, gözlemlenen nesnelerin bir 3B nokta yayılma fonksiyonu (PSF) ile birleştirilmesinin sonucu olarak matematiksel olarak modellenebilir. PSF, doku örneği tarafından yayılan ve mikroskop tarafından toplanan ışık noktalarının teorik bir kırınım paternidir. PSF dosyası, kameranın CCD hücre aralığı, kullanılan ortamın kırılma indisi, objektif lensin sayısal açıklığı, floroforun emisyon dalga boyu, görüntü boyutları, z-yığını işleme yöntemindeki görüntü sayısı ve aralarındaki boşluk gibi her görüntünün özel koşullarıyla oluşturulur (bkz. Tablo 2'deki teknik özellikler). Başka bir deyişle, PSF dosyası görüntüleme kurulumunun mikroskop gözlemleri üzerindeki etkilerini özetlemektedir9. Ancak, her z-stack görüntüsü için kendi özel PSF dosyamızı oluşturmak üzere kırınım PSF 3D Eklentisini (https://imagej.net/Diffraction_PSF_3D) kullanıyoruz. Z-yığını görüntüleri, slaytın aynı XY konumundaki tanımlanmış derinliklerden (z ekseni) bir dizi sayısallaştırılmış optik bölümdür. Bir bilgisayar, diğer odak düzlemlerinde bulunan nesnelerden kaynaklanan sinyalleri yeniden atayarak odak düzleminden elde edilen bilgileri derler. Z-stack görüntüleri oluşturmak için, slaytların farklı odaklanmış katmanlarından görüntüler çekmek gerekir (örneğin, her 1 μm derinlikte aynı XY alanının on farklı görüntüsü). Ardından, bir z-yığını veya 3D görüntü oluşturmak için üretici veya Fiji tarafından sağlanan mikroskopi yazılımını kullanıyoruz. Sonuç tek bir yığın görüntü dosyası olacaktır (örneğin, farklı odaklara sahip on görüntü). Dekonvolüsyon mikroskobu için açık kaynaklı yazılım gibi müşteriye özel birkaç araç ve yazılım çözümü vardır. Bir Fiji 2 eklentisi olan DeconvolutionLab29'u (ImageJ12'nin dağıtımı) kullanarak dekonvolüsyon işleminin çıktılarını göstereceğiz. Dekonvolüsyon, nihai mikrografların çözünürlüğünü artırmaya yardımcı olacaktır (bkz. Şekil 1B, C). Daha fazla bilgi ve talimat için, referans13'ü okumanızı şiddetle tavsiye ederiz.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig01.jpg"> Şekil 1: Birden fazla renk kanalı için 3B dekonvolüsyonun temsili görüntüsü. (A) Düşük büyütmede DG. (B) Her kanal ve birleştirilmiş görüntü için orijinal z-stack görüntüleri. (C) Her kanal ve birleştirilmiş görüntü için 3B dekonvolüsyonlu z-stack görüntüleri. Bu beyin, fiziksel aktivite grubunun bir parçası olan sıçandandı. Etiketli streptavidin-biotin (LSAB) amplifikasyon yöntemi kullanıldı. BrdU'yu (kırmızı), karşı boyama (mavi) olarak DAPI'yi ve astroglial belirteç (yeşil) olarak glial fibriler asidik proteini (GFAP) belirtmek için Cy3 streptavidin konjuge antikoru gösterdi. ML = moleküler tabaka; GCL = granüler hücre tabakası; SGZ = alt granüler bölge. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Bu çalışmanın amacı, immünoboyama ile olumlu ve başarılı sonuçlar elde etmek için atılan adımların ayrıntılı bir tanımını sağlamak ve konfokal mikroskop kullanmadan BrdU tabanlı çalışmalarda yaygın olarak kullanılan adımları listelemektir. BrdU boyama, başarılı bir leke elde etmek için dikkatle izlenmesi gereken birkaç adım gerektiren bir tekniktir. Bu boyama tekniklerinin standartlaştırılması tipik olarak aylar sürer ve zaman ve kaynak yoğundur. Bu makalenin, zamanı ve hataları azaltarak bu alanda başlayan gruplara bilgi sağlayabileceğini öngördük.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>REAGENT PREPARATION AND SETUP</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donor Horse Serum</td>
			<td>BioWest</td>
			<td>S0900</td>
			<td>Blocking and incubation solutions in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde reagent grade, crystalline (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td>toxic, flammable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>746436-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, monobasic</td>
			<td>J.T Bker</td>
			<td>3246-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sacarose</td>
			<td>J.T Baker</td>
			<td>4072-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Meyer</td>
			<td>2365-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5881-500G</td>
			<td>Corrisive, to calibrate pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Phophate Dibasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9763-5KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-x 100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THYMIDINE ANALOGUE BRDU ADMINISTRATION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5-Bromo-2&#8242;-deoxyuridine, BrdU</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B9285</td>
			<td>toxic (mutagenic, teratogenic)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23&#8211;27G hypodermic needle</td>
			<td>BD PrecisionGlide</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Saline solution</td>
			<td>PiSA</td>
			<td>30130032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes 1 mL</td>
			<td>NIPRO</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TISSUE PREPARATION</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15-ml polypropylene conical tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50-ml polypropylene conical tube</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>339652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Guillotine</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome Cryostat</td>
			<td>MICROM</td>
			<td>HM525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netwell 15 mm polyester mesh membrane inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3477</td>
			<td>pre-loaded in 12-well culture plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netwell plastic 12-well carrier kit</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3520</td>
			<td>for 15 mm polyester mesh membrane inserts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Netwell plastic 6-well carrier kit</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion pump</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>7553-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaker</td>
			<td>IKA</td>
			<td>ROKCER 3D Digital</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMMUNOSTAINING</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cresyl violet</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5042</td>
			<td>1%, Light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAB Peroxidase (HRP) Substrate Kit (with Nickel), 3,3&#8217;-diaminobenzidine</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SK-4100</td>
			<td>carcinogenic, light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydochloric Acid</td>
			<td>J.T.Baker</td>
			<td>9535-05</td>
			<td>Corrosive, to calibrate pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide, 50%</td>
			<td>Meyer</td>
			<td>5375-1L</td>
			<td>Toxic, oxidative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permount Mounting Medium</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>SP15-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1200</td>
			<td>Light sensitive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VECTASTAIN&#174; Elite&#174; ABC Kit Peroxidase (HRP)</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td>enzymatic, avidin/biotin based amplification system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFAP antibody produced in rabbit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>HPA056030</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-BrdU antibody produced in Mouse</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B2531</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biotin-SP (long spacer) AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>715-065-151</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Mouse IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, HRP</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>G-21040</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG (whole molecule), TRITC</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T5393</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed, FITC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>F-2765</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptavidin, Cy3</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>SA-1300</td>
			<td>1:250</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAGING AND ANALYSIS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer</td>
			<td>Dell Computer Company</td>
			<td>T8P8T-7G8MR-4YPQV-96C2F-7THHB</td>
			<td>For controlling and monitoring protocols&#8217; processes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CCD-camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UC50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellSens Standard software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>cellSens Standard Edition</td>
			<td>Acquisition Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Epifluorescent microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-pressure 130 W mercury arc lamp</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-HGLGPS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low autofluorescence immersion oil</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>MOIL-30 Type F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro cover-glasses (VWR, cat no 48404 454; 24&#160; 60 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides (VWR, cat no 48323-185; 76&#160; 26 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-FBW filter cube</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-FBW</td>
			<td>excitation 460 - 495 nm, dichroic mirror 505 nm, suppression 510 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-FGW filter cube</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-FGW</td>
			<td>excitation 530 - 550 nm, dichroic mirror 570 nm, suppression 575 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-FUW filter cube</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>U-FUW</td>
			<td>excitation 340 - 490 nm, dichroic mirror 410 nm, suppression 420 nm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

immunohistochemistry techniques to analyze cellular proliferation and neurogenesis in rats using the thymidine analog brdu

Yetişkin hipokampal nörogenez (AHN) alanındaki en önemli şeylerden biri, yeni üretilen hücrelerin tanımlanmasıdır. Timidin analoglarının (5-Bromo-2'-deoksiüridin (BrdU) gibi) immün tespiti, bu yeni üretilen hücreleri görselleştirmek için kullanılan standart bir tekniktir. Bu nedenle, BrdU genellikle küçük hayvanlara intraperitoneal olarak enjekte edilir, bu nedenle timidin analoğu DNA sentezi sırasında bölünen hücrelere dahil edilir. Tespit, beyin dilimlerinin immünohistokimyasal analizi ile gerçekleştirilir. Bu tekniği kullanan her araştırma grubu, başarılı bir leke elde etmek için küçük ayrıntılara özel dikkat gösterilmesi gerektiğini takdir edebilir. Örneğin, önemli bir adım, HCl ile DNA denatürasyonudur ve bu da onu boyamak için hücre çekirdeğine ulaşmasını sağlar. Bununla birlikte, mevcut bilimsel raporlar bu tür adımların çok azını ayrıntılı olarak açıklamaktadır. Bu nedenle, tekniğin standartlaştırılması yeni laboratuvarlar için zordur, çünkü olumlu ve başarılı sonuçlar elde etmek birkaç ay sürebilir. Bu çalışmanın amacı, timidin analog BrdU ile çalışırken immün boyama tekniğinin olumlu ve başarılı sonuçlarını elde etmek için atılan adımları ayrıntılı olarak tanımlamak ve detaylandırmaktır. Protokol, reaktif hazırlama ve kurulumu, bir kemirgende timidin analoğunun uygulanması, transkardiyal perfüzyon, doku preparasyonu, peroksidaz immünohistokimyasal reaksiyonu, avidin-biyotin kompleksinin kullanımı, immünofloresans, karşı boyama, mikroskopi görüntüleme ve hücre analizini içerir.

Yukarıda tarif edilen yöntemler, herhangi bir ekstra fiziksel aktivite olmadan bir kontrol grubunun aksine, gönüllü fiziksel aktiviteden sonra yetişkin sıçan hipokampüsündeki yenidoğan hücreleri ölçmek için uygulanmıştır. Doğum sonrası sıçan hipokampusunu pozitif kontrol olarak kullandık. 3 aylık erkek sıçanlar, yedi gün boyunca gönüllü bir fiziksel aktivite protokolü (sonsuz tekerlek) altındaydı. 6. günde, sıçanlara BrdU (bölüm 2) enjekte edildi ve üç tam enjeksiyona kadar her 12 saatte bir enjekte edildi. Üç hücre döngüsü bölünmesini tamamlamak için, hayvanlar son BrdU enjeksiyonundan 8 saat sonra transkardiyal olarak perfüze edildi (bölüm 3). Aynı prosedür, karşılaştırmalı bir kontrol olarak kullanılmak üzere fiziksel aktiviteye maruz kalmayan üç aylık sıçanlarda da kullanılmıştır. Pozitif bir kontrol olarak, bir günlük sıçan yavruları (doğum sonrası gün 1), yukarıdaki bölüm 2'de açıklandığı gibi bir kez BrdU ile enjekte edildi. Enjeksiyondan bir gün sonra (doğum sonrası 2. gün), yavrular ötenazi yapıldı ve kafaları adım 3.4'te açıklandığı gibi PFA çözeltisine daldırıldı. Yetişkin sıçanlar, adım 3.2'de tanımlandığı gibi, transkardiyal olarak perfüze edilmiş derin anestezi altına alındı (adım 3.1). Beyinler diseke edildi ve sonradan sabitlendi (adım 3.4). Beyinler 40 μm koronal bölümlere ayrıldı (adım 3.5). Kesitler, adım 4'te açıklandığı gibi BrdU immünohistokimyası için işlendi.
DG'de boyama (adım 4.1) ve BrdU-pozitif hücreleri sayma için DAB IHC ile yaban turpu peroksidaz reaksiyonu kullandık. Şekil 5 , BrdU etiketli hücrelere sahip bir DG bölümünü göstermektedir. Şekil 5C,D, DG bölümünün temsili bir bölümünü daha yüksek büyütmede göstermektedir. Etiketli hücreler, oklarla işaretlenmiş yoğun koyu lekelenme gösterdi. İç kısım, deney ve kontrol gruplarındaki etiketli hücrelerin ortalama sayısını gösterir (sayılan pozitif hücreler, adım 8.1'de açıklandığı gibi altı ile çarpılır). Bir öğrencinin t-testi, BrdU-pozitif hücrelerin sayıları arasında anlamlılık farklılıkları ortaya koymuştur (t(10) = 2.704, p = 0.0222). Fiziksel aktiviteye maruz kalmayan kontrol grubu 2.040 ± 314 hücre (n = 6 sıçan) gösterdi. Buna karşılık, fiziksel aktivite grubu, ortalama olarak, 3.606 ± 486 (n = 6 sıçan) BrdU pozitif hücre göstermiştir. Gözlemlendiği gibi, fiziksel aktiviteye maruz kalma BrdU-pozitif hücreleri arttırır. Bu nedenle, bu sonuçlar, fiziksel aktivitenin yetişkin dentat girus17'de hücresel proliferasyonu arttırdığını gösteren diğer bildirilen sonuçlarla tutarlıdır.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig03.jpg"> Şekil 3: BrdU etiketli hücre çekirdeğinin farklı morfolojisine örnekler. BrdU, çekirdeği etiketleyen bir DNA sentez belirtecidir. Hipokampus bölgesinde, BrdU-pozitif çekirdekler, dentat girus alt granüler bölgesinde bulunan yarı oval bir şekle sahipti. BrdU rekabet yoluyla dahil edildiğinden, her hücre için dahil edilen miktar, daha sonra çekirdeğin nasıl görselleştirileceğine yansıyacak bir varyasyona sahip olacaktır. (A) İmmünofloresan görüntü. (B) Ek bir amplifikasyon yöntemi olmadan peroksidaz reaksiyonu kullanan bir görüntü sunulur. Sarı oklar yapıları ve spesifik olmayan sinyalleri gösterir. Siyah veya beyaz oklar BrdU+ hücrelerini gösterir. 1 – Tamamen dosyalanmış çekirdek, yarı oval çekirdekler çok renklidir. 2 – Noktaları olan çekirdekler, çekirdeklerin sınırı işaretlenir ve içinde birkaç nokta vardır. 3 – Birkaç noktalı çekirdekler, çekirdeklerin sınırları işaretlenir ve içinde az sayıda nokta bulunur. 4 – Küçük çekirdek, farklı bir farklılaşma aşamasındaki ancak yine de nişin bir parçası olan olası hücrelerdir. 5 – Kümeler bölünme altındaki öncü hücrelerdir, bu nedenle yoğunlaşmış gruplarda birlikte birkaç hücre gözlenebilir. Bu gruplar içinde, pozitif hücrelerin yanlış etiketlenmesini önlemek için sayım özellikle dikkatli yapılmalıdır. Kırmızı oklar, tek bir hücre olarak karıştırılabilecek bölünme altındaki çekirdeği gösterir. Her hücre bir kutu içine alınır ve gerçek zamanlı olarak bir Z ekseni düzleminde ayırt edilebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig04.jpg"> Şekil 4: Tek ve birleştirilmiş kanallar için temsili RGB görüntüsü. Üst resim orijinal z-stack görüntüsünü, alt resim ise 3B dekonvolüted z-stack görüntüsünü gösterir. (A) DG'nin düşük büyütmesi. (B) her kanal için RGB görüntü ve (C) RGB birleştirilmiş görüntü. Bu, kontrol grubundan bir beyindi. İmmünofloresan ek bir amplifikasyon yöntemi olmadan kullanıldı. BrdU (kırmızı), karşı boyama olarak DAPI (mavi) ve astroglial belirteç olarak GFAP (glial fibriler asidik protein) (yeşil). ML = moleküler tabaka; GCL = granüler hücre tabakası; SGZ = alt granüler bölge. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61483/61483fig05.jpg"> Şekil 5: Her deney grubu için BrdU etiketli hücrelere (yoğun karanlık) sahip temsili DG bölümü. Peroksidaz reaksiyonu avidin-biotin-peroksidaz kompleks amplifikasyon yöntemi ile kullanıldı. (A, B) DG'nin düşük büyütmesini gösterin ve (C, D) kutu alanını daha yüksek büyütmede gösterin. A ve C panelleri fiziksel aktivite grubundan, B ve D panelleri kontrol grubundan dokulardır. Girinti, fiziksel aktivite ve kontrol gruplarındaki etiketli hücrelerin ortalama sayısını gösterir (adım 8.1'de açıklandığı gibi altı ile çarpılan pozitif hücreler sayılır). ML = moleküler tabaka; GCL = granüler hücre tabakası; SGZ = alt granüler bölge; oklar BrdU+ hücrelerini gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61483/61483fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Video 1: Farklı katmanlara dağılmış z ekseni boyunca pozitif hücrelerin farklı bir odağını gösteren video. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61483/VIDEO_1.avi" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
Video 2: Farklı katmanlara dağılmış z ekseni boyunca pozitif hücre kümelerinin farklı bir odağını gösteren video. Bir kümeyi bütünleştiren birkaç çekirdeğin tümünü ölçmek için z ekseni üzerinde yavaşça hareket edin. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61483/VIDEO_2.mp4" target="_blank">Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Mikroskop Tipi:</td>
			<td colspan="5">Epifloresan Mikroskop Olympus BX53</td>
		</tr><tr><td>Işık kaynağı:</td>
			<td colspan="5">Yüksek basınçlı 130 W cıvalı ark lambası (U-HGLGPS)</td>
		</tr><tr><td>Satın Alma Yazılımı:</td>
			<td colspan="5">CellSens Standart</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Filtre Kümeleri:</td>
			<td colspan="2">Katalog Numarası</td>
			<td>Uyarma Aralığı</td>
			<td>Dikromatik ayna</td>
			<td>Bastırma Aralığı</td>
		</tr><tr><td colspan="2">U-FUW</td>
			<td>340 - 490 mil</td>
			<td>410 nm</td>
			<td>420 nm</td>
		</tr><tr><td colspan="2">U-FBW</td>
			<td>460 - 495 mil</td>
			<td>505 nm</td>
			<td>510 nm</td>
		</tr><tr><td colspan="2">U-FGW</td>
			<td>530 - 550 mil</td>
			<td>570 mil</td>
			<td>575 mil</td>
		</tr><tr><td rowspan="4">Kamera:</td>
			<td colspan="2">Model:</td>
			<td colspan="3">UC50 CCD kamera</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Spektral aralık:</td>
			<td colspan="3">290 – 1000 mil</td>
		</tr><tr><td colspan="2">CCD çip boyutu:</td>
			<td colspan="3">2/3 in, 2588 (Genişlik *7) X 1960 (Yükseklik *8) piksel</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Piksel Boyutu:</td>
			<td colspan="3">3,4 X 3,4 μm</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">Florokrom:</td>
			<td colspan="2">Ad</td>
			<td>Uyarma Dalga Boyu (nm)</td>
			<td>Emisyon *3 Dalga Boyu (nm)</td>
			<td>Emisyon Rengi</td>
		</tr><tr><td colspan="2">4, 6-diamidino-2-fenil-indol HCI (DAPI)</td>
			<td>345</td>
			<td>455</td>
			<td>Mavi</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Tetrametilrodamin-izotiyosiyanat (TRITC)</td>
			<td>541</td>
			<td>572</td>
			<td>Kırmızı</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Floresein-izotiyosiyanat (FITC)</td>
			<td>494</td>
			<td>519</td>
			<td>Yeşil</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Cy3 (Cy3)</td>
			<td>552</td>
			<td>565</td>
			<td>Kırmızı</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">Montaj Orta ve daldırma yağı:</td>
			<td colspan="3">Ad</td>
			<td colspan="2">Ortamın kırılma indeksi *1</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Hava (slayt ve lens arasında hiçbir şey yok)</td>
			<td colspan="2">1.00029</td>
		</tr><tr><td colspan="3">DAPI'li Antifade Montaj Ortamı</td>
			<td colspan="2">1.45</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Permount Montaj Ortamı</td>
			<td colspan="2">1.519</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Düşük otofloresan daldırma yağı (MOIL-30 Tip F)</td>
			<td colspan="2">1.518</td>
		</tr><tr><td rowspan="6">Büyütme Lensi (Plan Florit)</td>
			<td>Büyütme</td>
			<td>Sayısal Diyafram Açıklığı (NA) *2</td>
			<td>Çözünürlük (μm)</td>
			<td>Görüntü piksel aralığı (nm) *5</td>
			<td>Dilim aralığı Z ekseni (nm) *6</td>
		</tr><tr><td>4X</td>
			<td>0.13</td>
			<td>2.12</td>
			<td>850</td>
			<td>3000</td>
		</tr><tr><td>10X</td>
			<td>0.3</td>
			<td>0.92</td>
			<td>340</td>
			<td>3000</td>
		</tr><tr><td>20X</td>
			<td>0.5</td>
			<td>0.55</td>
			<td>170</td>
			<td>2000</td>
		</tr><tr><td>40X</td>
			<td>0.75</td>
			<td>0.37</td>
			<td>85</td>
			<td>1000</td>
		</tr><tr><td>100X</td>
			<td>1.3</td>
			<td>0.21</td>
			<td>34</td>
			<td>1000</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 2: Mikroskop kurulum özellikleri ve nokta yayılma fonksiyonu (PSF) dosyası oluşturma gereksinimleri. PSF dosyasını oluşturmak için kırınım PSF 3D eklenti penceresinde 11 yuva vardır. Her yuva aşağıdaki gibi tanımlanır: *1 - Ortamın kırılma indeksi: slayt ve lens arasındaki ortam için kırılma indeksi (örneğin, hava = 1.00029). *2 - Sayısal Diyafram: Kullanılan lensin NA değeri (farklı bir daldırma ortamı kullanıldığında ve lense atandığında düzeltilmelidir). *3 - Dalga boyu: Florokrom maksimum emisyon dalga boyu (nm). *4 - Uzunlamasına Küresel Sapma: 0,00. *5 - Görüntü piksel aralığı: CCD piksel boyutu (nm)/Büyütme (ör. 3,4 μm ve 100X lens, 3400/100 = 34 nm). *6 - Görüntüler arasındaki mesafe Z ekseni. *7 - Genişlik: Ayrıştırılacak görüntünün genişliğini piksel cinsinden girin. *8 - Yükseklik: Ayrıştırılacak görüntünün yüksekliğini piksel cinsinden girin. *9 - Derinlik, dilimler: z yığınındaki görüntü sayısı. *10 - Normalleştirme: Piksel değerlerinin toplamı = 1. *11 - Başlık: PSF dosyası için istenen ad. Dosya, verilen benzersiz z-stack görüntüsüyle eşleşmelidir.

Watch this Scientific Journal Video about Immunohistochemistry Techniques to Analyze Cellular Proliferation and Neurogenesis in Rats Using the Thymidine Analog BrdU at JoVE.com

Immunohistochemistry Techniques to Analyze Cellular Proliferation and Neurogenesis in Rats Using the Thymidine Analog BrdU

Bu makale, sıçanlarda yetişkin nörogenezini ölçmek için BrdU pozitif hücrelerini görselleştirmek için en yaygın tekniklerden dördünü sunmaktadır. Bu çalışma, reaktif hazırlama, timidin analog uygulaması, transkardiyal perfüzyon, doku hazırlığı, peroksidaz immünohistokimyasal reaksiyonu, immünofloresan, sinyal amplifikasyonu, karşı boyama, mikroskopi görüntüleme ve hücre analizi için talimatları içerir.

Thymidine Analog BrdU Kullanarak Sıçanlarda Hücresel Proliferasyon ve Nörogenezi Analiz Etmek için İmmünohistokimya Teknikleri

One of the most important things in the field of adult hippocampal neurogenesis (AHN) is the identification of the newly generated cells. The ...

Research

JoVE Journal

Biology

Cortical Neurogenesis: Transitioning from Advances in the Laboratory to Cell-Based Therapies

Kortikal nöron: Hücre Tabanlı Tedaviler Laboratuvar gelişmeler geçiş

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

İmmünohistokimya: Parafin Bölüm Vektör Labs Vectastain ABC Seti

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

Floresan Antikorlar Fare Epidermis Parafin Bölüm İmmünohistokimya

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

Drosophila Larvaların NMJ İmmünohistokimya

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Microinjection Techniques for Studying Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo

Mitoz incelenmesi için Mikroenjeksiyon Teknikleri Drosophila melanogaster Sinsityal Embriyo

This protocol describes the use of the Drosophila melanogaster syncytial embryo  for studying mitosis1.  Drosophila has useful genetics with a sequenced ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

İyon Kanalları incelenmesi için yama Kelepçe ve Perfüzyon Teknikleri cinsinden ifade edilir Xenopus Oosit

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

Memeli Hücrelerde Nascent DNA Bound Proteinlerin incelenmesi BrdU ChIP-Slot-Batı Tekniği

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

Using Microfluidic Devices to Measure Lifespan and Cellular Phenotypes in Single Budding Yeast Cells

Mikroakışkan Aygıtlar Kullanma Tek Budding Maya Hücreleri ömrü ve Hücresel fenotipleri Ölçmek için

Budding yeast Saccharomyces cerevisiae is an important model organism in aging research. Genetic studies have revealed many genes with conserved effects ...

Techniques to Induce and Quantify Cellular Senescence

Teknikler İndüklemek ve Ölçmek Hücresel Yaşlılık etmek

In response to cellular stress or damage, proliferating cells can induce a specific program that initiates a state of long-term cell-cycle arrest, termed ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

Basit ve etkili yönetim ve küçük balıklar böbrek enjeksiyon kullanarak dolaşım sistemi içinde Microparticles görselleştirme

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...