Name: an ex vivo assay to study candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal tract
Uploaded: 2020-07-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract at JoVE.com

الكتاب الاعتراف الموارد والدعم من جامعة الغرب الأوسط الخلوية والجزيئية مرفق البحوث الأساسية.

تمت الموافقة على جميع بروتوكولات الحيوان من قبل جامعة الغرب الأوسط لجنة الرعاية الحيوانية المؤسسية واستخدام (IACUC) كما هو موضح قبل57. وافقت اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوان واستخدامه في جامعة الغرب الأوسط على هذه الدراسة بموجب بروتوكول MWU IACUC #2894. وتتبع سياسات رعاية الحيوانات في و...

الطريقة الموصوفة هنا تقدم طريقة جديدة للتحقيق في تأثير المضادات الحيوية، والآثار الغذائية، وxenobiotic والعلاجية على C. albicans الهضاب المورفيجن في الجهاز الهضمي. منذ غالبية الالتهابات الجهازية تنشأ من الجهاز الهضمي21،22،23،2...

المبيضات albicans هو الانتهازية ، متعدد الأشكال المسببة للأمراض الفطرية التي عادة ما تكون commensal ، ولكن يمكن أن تخضع لتغيير مورفولوجية في شكل خبيث قادر على التسبب في التهابات تهدد الحياة في الأفراد المناعة1،2،3،4،5،6،8،9،11،12،13. C. albicans هو السبب الرئيسي للعدوى الانسومية الجهازية، مع معدل وفيات 40\u201260٪ حتى مع العلاج المضاد للفطريات2،14،15. على الرغم من أن C. albicans يقيم في مختلف المنافذ المضيفة بما في ذلك الجهاز التناسلي الإناث16,17, تجويف الفم من الأفراد الأصحاء18 والجهاز الهضمي (GI) المسالك19,20, الغالبية العظمى من الالتهابات الجهازية تنشأ من الجهاز الهضمي وعلاوة على ذلك, وكثيرا ما أكد مصدر العدوى الجهازية أن الجهاز الهضمي21،22،23،24،25،26،27،28،29،30،31،32،33،34. C. تتأثر الإمراضية albicans في الجهاز الهضمي بمجموعة واسعة من العوامل; ومع ذلك ، فإن السمة الرئيسية الضرورية للوعاء هي الانتقال من مورفولوجيا خلية الخميرة إلى مورفولوجيا الخلايا الواصلة35،36،37،38،39،40،41،42،43،44. C. albicans التعلق والنشر من الجهاز الهضمي أثناء العدوى يرتبط بشدة مع قدرته على الانتقال من خميرة commensal إلى hyphae ضراوة، مما يسمح للفطريات أن تسبب الأمراض الغازية44،45،46،47،48،49،50،51،52،53.
مجموعة متنوعة من العوامل في الأمعاء، بما في ذلك ن أسيتيلغلوسكامين، تنظيم تشكيل الواصلة من قبل C. albicans . ولذلك، فمن الأهمية بمكان لتضييق الفجوة في المعرفة فيما يتعلق بتشكل الغشاء الواصل لهذا الممرض الفطري في الجهاز الهضمي54،55،56. تشير الأدلة الحديثة إلى أن مختلف الأيضات الأمعاء السيطرة بشكل تفاضلي في morphogenesis الواصلة من C. albicans في المختبر57,58,59,60. ومع ذلك، تشكل القيود التقنية قضايا عند محاولة دراسة تكوّن الأمعاء في عينات الأمعاء الحية في العينات، خاصة تلطيخ الخميرة وخلايا الواصلة والتحليل الكمي لتطوير الواصلة. لفهم C. albicans الواصلة morphogenesis في الجهاز الهضمي، تم تطوير طريقة فيفو السابق باستخدام مقتطفات قابلة للذوبان من محتوى الأمعاء المتجانسة من الفئران لدراسة تأثير الأيض على تكوين الواصلات الفطرية. استخدام عينات الأمعاء من الفئران التي هي مقاومة وعرضة لعدوى ج. albicans GI، وهذه الطريقة سوف تساعد على تحديد ودراسة تأثير الأيض والمضادات الحيوية وxenobiotics على تكوين الحمى الفطرية في الجهاز الهضمي.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 - 10 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-454</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 - 1000 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-400</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 - 200 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-451</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutyric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>193070-25G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen (Fisher)</td>
			<td>A11008</td>
			<td>IF Staining secondary ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td>YPD agar component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Imaging Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZX700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Candida Albicans Antibody</td>
			<td>Invitrogen (Fisher)</td>
			<td>PA1-27158</td>
			<td>IF Staining primary ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cefoperazone</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>16113</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deoxycholic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30960</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-500</td>
			<td>hyphal-promoting compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lactic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAAL13242-06</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lithocholic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6250-10G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>palmitic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5585-10G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td>IF Staining fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS), 10x</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62692</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-tolylacetic acid</td>
			<td>SCBT</td>
			<td>sc-257959</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sebacic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>283258-250G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sharp ended scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>28301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile Milli-Q water</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD Broth</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>242810</td>
			<td>YPD agar component</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo assay to study candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal tract

المبيضات albicans الواصلة morphogenesi في الجهاز الهضمي (GI) يتم التحكم بإحكام من قبل مختلف الإشارات البيئية، ويلعب دورا هاما في نشر والعوامل المسببة للأمراض الفطرية الانتهازية. ومع ذلك، طرق لتصور هيفا الفطرية في الجهاز الهضمي في الجسم الحي هي التحدي الذي يحد من فهم الإشارات البيئية في السيطرة على عملية تكوين هذه المورفون. البروتوكول الموصوف هنا يوضح طريقة رواية ex vivo للتصور من المورفينجينيات الواصلة في مقتطفات متجانسة الأمعاء. باستخدام مقايسة الجسم الحي السابق ، توضح هذه الدراسة أن محتويات cecal من الفئران المعالجة بالمضادات الحيوية ، ولكن ليس من فئران التحكم غير المعالجة ، تعزز تولد الواصلة C. alphcans في محتوى الأمعاء. وعلاوة على ذلك، إضافة مجموعات محددة من الأيض الأمعاء مرة أخرى إلى محتويات cecal من الفئران المعالجة بالمضادات الحيوية ينظم بشكل تفاضلي الفرتال morphogenesis السابقين. يمثل هذا البروتوكول، الذي يُؤخذ معًا، طريقة جديدة لتحديد الإشارات البيئية التي تتحكم في التشكل الواصلي C. albicans في الجهاز الهضمي والتحقيق فيها.

هذه النتائج جنبا إلى جنب مع النتائج السابقة من مختبر ثانغاماني60 تشير إلى أنه عندما يتم زراعة C. albicans السابقين في مستخلصات تجانس الأمعاء مأخوذة من المعدة والأمعاء الدقيقة والأمعاء الغليظة من السيطرة غير المعالجة والفئران المعالجة بالمضادات الحيوية، C. albicans يتطور عمو...

Watch this Scientific Journal Video about An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract at JoVE.com

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

مقايسة الجسم الحي السابق المذكورة في هذه الدراسة باستخدام مستخلصات التجانس الأمعاء وتلطيخ المناعة الفلوريس يمثل طريقة جديدة لدراسة التشكل الواصل من المبيضات albicans في الجهاز الهضمي. ويمكن استخدام هذه الطريقة للتحقيق في الإشارات البيئية التي تنظم التحول المورفوجينيك في القناة الهضمية.

مُسَاَنّة مُعَدِيّة سابقة لدراسة المبيضات المبيضات البَيكانسِيّة الواصلة Morphogenesi في الجهاز الهضمي

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

البروتوكول الذي أظهر في هذا الفيديو يسمح لنا لفهم دور الأيضات الأمعاء على تكوين الأمعاء الواصلة. هذه التقنية السابقة vivo أكثر أو أقل التقريب الأقرب من القناة الهضمية لدراسة التشوهات الفطرية الواصلة بطريقة لا يمكن تكرارها في المختبر الدراسة. يمكن تطبيق هذه الطريقة لدراسة دور الأيضات الأمعاء على مسببات الأمراض المعوية الأخرى.تشريح الفئران باستخدام الأوتكفا المعقمة مقص حاد النهاية والملقط. بعد القتل الرحيم ، قم بتأمين الحيوان على سطح تشريح عن طريق تثبيت جميع الأطراف لفضح البطن. رش منطقة البطن مع 70٪ الإيثانول لمنع الفراء من التمسك ملقط, مقص, أو أقسام الأمعاء.استخدام ملقط لقرصة ورفع قسم من الجلد في قاعدة البطن وخلق شق صغير من خلال الجلد والزفافة الكامنة مع الحرص على تجنب ثقب الأعوس أو جدار الأمعاء. تمديد هذا القطع إلى القفص الصدري جزئيا تعريض تجويف البريتوني، ثم جعل قطع بدءا من نقطة الشق الأولي على جانبي وتمتد صعودا وشقيا. سحب هذه اللوحات بشكلٍ ثُمّيًا، وثبّتها على سطح التشريح لفضح التجويف البريتوني بشكل كامل.استخراج الجهاز الهضمي مع ملقط أثناء استخدام مقص لجعل تخفيضات متفوقة على المعدة وفي منطقة القاصي من الأمعاء الغليظة لضمان جمع أكبر قدر من محتوى الأمعاء. عند إزالة الجهاز الهضمي، يجب الحرص على تجنب تمزق المكونات الفردية. فصل المعدة والأمعاء الدقيقة وال cecum والأمعاء الغليظة في نهاياتها القريبة وفص.لجمع محتويات الأمعاء من كل قسم، وجعل شق واحد في نهاية القاصي، ثم طرد محتوى الأمعاء يدويا في أنبوب microcentuge 1.5 ملليلتر مع ملقط. تخزين العينات في ناقص 80 درجة مئوية لتذوق الجسم الحي السابقين. المتتالية ثقافة جديدة من C.albicans SC5314 على لوحة YPD أجار واحتضانه بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية.في اليوم التالي، اختر مستعمرتين أو ثلاث مستعمرات فردية متوسطة الحجم وأعيد تعليقها في ملليلتر واحد من PBS. استرداد محتويات الأمعاء المجمدة من الثلاجة وذوبانها في 25 درجة مئوية. نقل ما يقرب من 150 ملليغرام من محتويات الأمعاء إلى أنبوب جديد 1.5 ملليلتر و resuspend لهم مع 150 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني.دوامة العينة بسرعة عالية لمدة 30 ثانية لتجانس محتويات الأمعاء والسماح لها بالجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقة تقريبا. الطرد المركزي المتجانس في 1،000 مرات G لمدة ثلاث دقائق، ثم نقل فائقة إلى أنبوب 1.5 ملليلتر جديدة مع الحرص على عدم نقل أي حطام. بعد تكرار الطرد المركزي، إضافة 10 ميكرولترات من inoculum C.albicans إلى supernatant، اخلط جيدا، واحتضان العينة في 37 درجة مئوية لمدة أربع إلى خمس ساعات.لاختبار تأثير الأيضات الخارجية على C.albicans، إضافة التركيز المطلوب من الأيض إلى محتوى الأمعاء وخليط PBS، ثم دوامة العينة بسرعة عالية لمدة 30 ثانية، والسماح لها الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق، وتنفيذ الطرد المركزي والتطعيم كما هو موضح سابقا. الطرد المركزي في ثقافة الخلية الفطرية في 1،000 مرات G لمدة دقيقتين وتجاهل افرا. إصلاح العينات في 100 ميكرولترات من 2٪ PFA لمدة 15 دقيقة، ثم كرر الطرد المركزي وتجاهل السوبر.غسل العينات مرتين مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني وفقا لاتجاهات المخطوطات، ثم احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة في 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني مع الأجسام المضادة C.albicans بوليكلونال لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة ، وغسل العينة ثلاث مرات أخرى مع برنامج تلفزيوني ، والعمل في ضوء خافت لتجنب photobleaching. في غرفة مظلمة، احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة في 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني تحتوي على المضادة للأرانب IgG اليكسا فلور 488 في تخفيف واحد إلى 500.بعد غسل العينة ثلاث مرات مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني، resuspend في 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني ونقلها إلى لوحة 96-جيدا للتصوير. صور الخلايا الفطرية مع مجهر التصوير الفلوري باستخدام العدسات 20X و 40X الهدف ومرشح البروتين الفلورسنت الأخضر. عندما يتم زراعة C.albicans السابقين في مستخلصات متجانسة الأمعاء مأخوذة من المعدة والأمعاء الدقيقة والأمعاء الغليظة من السيطرة غير المعالجة والفئران المعالجة بالمضادات الحيوية ، فإنه يتطور بشكل عام مع مورفولوجيا الخميرة.ومع ذلك ، عندما تزرع في مستخلص cecal من الفئران المعالجة بالمضادات الحيوية ، يخضع C.albicans بسهولة إلى تكوين المورفين مما يؤدي إلى أشكال الخميرة والهيبا. وهذا يشير إلى أن العلاج بالمضادات الحيوية يسبب تغييرات في بيئة cecal، مما يؤدي إلى morphogenesi الواصلة من C.Albicans. إضافة خارجية للجلوكوز إلى تجانس cecal من الفئران المعالجة بالمضادات الحيوية أظهرت تطور الواصلة الضخمة السابقين.هذه النتائج تشير إلى أن إضافة الأيض الأمعاء العودة إلى تجانس cecal من الفئران المعالجة بالمضادات الحيوية ينظم بشكل تفاضلي morphogenesis من C.albicans. عند محاولة هذا البروتوكول، ضع في اعتبارك أن تحسين تخفيف محتوى الأمعاء يضمن مجموعة كافية من المستقلبات الأمعاء دون جمع الحطام. لا تتجاوز تخفيف محتوى من اثنين إلى واحد من الوسائط إلى الأمعاء، وتهدف إلى تخفيف أقل إذا كان ذلك ممكناً.يتم استخدام هذه التقنية الآن لاستكشاف كيفية المستقلبات المحددة في تطور الواصلة تأثير الأمعاء، مما يسمح للباحثين لفهم أفضل لدور المستقلبات الأمعاء على التسبب الفطري.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

الزاجل فحوصات تنافسية لدراسة غوت - مدار هجرة الخلايا التائية

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

عزل الحمض النووي الريبي الزائفة الزنجارية استعمار الهضمي المسالك الفئران

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

دراسة المجتمعات الميكروبية<em&gt; في فيفو</em&gt;: نموذج من التفاعل بوساطة بين المضيف<em&gt; المبيضات البيض</em&gt; و<em&gt; الزائفة الزنجارية</em&gt; في الخطوط الجوية

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

التصور "تشكيل بيوفيلم" في المبيضات البيض باستخدام جهاز موائع جزيئية الآلي

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

نموذج السابقين فيفو الابتدائي بورسال خلية ثقافة دجاج لدراسة الأمراض المعدية بورسال الفيروسات المرضية

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

المعالجة الضوئية اليومية مع الضوء الأحمر لتنظيم "النمو بيوفيلم" المبيضات البيض

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

التصور من المبيضات الbicans في الجهاز الهضمي Murine باستخدام التهجين في الموقع الفلورسنت

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

توضيح والتصوير المبيضات ألبيكانس بيوفيم

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

روز البنغال العلاج الضوئي الديناميكي بوساطة لمنع المبيضات البيضاء

Invasive Candida albicans infection is a significant opportunistic fungal infection in humans because it is one of the most common colonizers of the gut, ...