Name: an ex vivo assay to study candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal tract
Uploaded: 2020-07-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract at JoVE.com

作者承认中西部大学细胞和分子核心研究机构的资源和支持。

所有动物协议都经过中西部大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，如57之前所述。中西部大学机构动物护理和使用委员会根据MWU IACUC协议批准了这项研究#2894。MWU 动物护理政策遵循公共卫生服务 （PHS） 关于实验室动物的人道护理和使用政策以及《动物福利法》中制定的政策。
1. 小鼠学习标准协议
<ol><li>使用雄性和雌性C57BL/6J小鼠至少六周大。补?...

本文描述的方法提出了一种新方法，用于研究抗生素、饮食、异种生物和治疗对胃肠道中C.albicans催眠膜形成的影响。由于大部分全身感染来自胃肠道21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34，<sup c...

念珠菌是一种机会主义的多态性真菌病原体，通常是共生性的，但可以经历形态变化，形成一种致命的形式，能够引起免疫功能低下的个体1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13等危及生命的感染。C. albicans是全身性耳部感染的主要原因，即使抗真菌治疗 2、14、15，死亡率也是40~u201260%。虽然C.albicans居住在不同的宿主利基，包括女性生殖系统16，17，口腔健康个体18和胃肠道（GI）19，20，大多数全身感染来自胃肠道，此外， 全身感染的来源通常被证实为胃肠道21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34。GI道区中的二比二丹致病性受多种因素的影响;然而，毒性所需的一个主要特征是，从酵母细胞形态过渡到毒性催眠细胞形态35，36，37，38，39，40，41，42，43，44。感染期间从胃肠道附着和传播的C.albicans与它从共生酵母转化为毒催眠剂的能力高度相关，使真菌能够引起侵入性疾病44，45，46，47，48，49，50，51，52，53。
肠道中的各种因素，包括n-乙酰葡萄糖胺，调节由C.albicans形成催眠。因此，缩小有关这种真菌病原体在胃肠道54、55、56中催眠形态的知识差距至关重要。最近的证据表明，各种肠道代谢物在体外57、58、59、60中对C.albicans的催眠形态进行差分控制。然而，技术约束在尝试研究体内肠道样本中的C.albicans催眠形成时存在问题，特别是染色酵母和催眠细胞以及催眠细胞的定量分析。为了了解胃肠道中C.albicans催眠病的形态，利用小鼠同质化肠道含量的可溶性提取物，开发出一种外生殖方法，以研究代谢物对真菌催眠形态生成的影响。利用来自具有抗药性且易感染C.albicans GI感染的小鼠的肠道样本，此方法将有助于识别和研究代谢物、抗生素和异体生物对胃肠道真菌性脂肪形态生成的影响。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 - 10 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-454</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 - 1000 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-400</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 - 200 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-451</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutyric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>193070-25G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen (Fisher)</td>
			<td>A11008</td>
			<td>IF Staining secondary ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td>YPD agar component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Imaging Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZX700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Candida Albicans Antibody</td>
			<td>Invitrogen (Fisher)</td>
			<td>PA1-27158</td>
			<td>IF Staining primary ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cefoperazone</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>16113</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deoxycholic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30960</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-500</td>
			<td>hyphal-promoting compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lactic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAAL13242-06</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lithocholic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6250-10G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>palmitic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5585-10G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td>IF Staining fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS), 10x</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62692</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-tolylacetic acid</td>
			<td>SCBT</td>
			<td>sc-257959</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sebacic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>283258-250G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sharp ended scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>28301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile Milli-Q water</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD Broth</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>242810</td>
			<td>YPD agar component</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo assay to study candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal tract

胃肠道（GI） 的白种病膜形成受到各种环境信号的严格控制，在这种机会性真菌病原体的传播和发病机制中起着重要作用。然而，在体内的GI道道中可视化真菌催眠的方法具有挑战性，这限制了对控制这种形态过程的环境信号的理解。此处描述的协议演示了一种新颖的外生体方法，用于在肠道同质性提取物中可视化催眠形态。使用体外测定，这项研究证明，来自抗生素治疗小鼠的切克萨尔含量，但不是来自未经治疗的对照小鼠，促进肠道内 C.albicans 催眠膜形成。此外，从抗生素治疗的小鼠中加入特定组肠道代谢物，可不同地调节生外膜形成。综合起来，该协议代表了一种识别和研究控制胃肠道中 C.albicans 催眠形态形成的环境信号的新方法。

这些结果以及丹加马尼实验室60 的先前发现表明， 当C.albicans 在未经治疗的对照组和抗生素治疗小鼠的胃、小肠和大肠的肠道同质提取物中生长时 ，C.albicans 通常与酵母形态一起发展（图1B）。然而，当从抗生素处理的小鼠的cesal提取物中生长时 ，C.albicans 很容易经历形态生成，导致含有酵母和催眠素形式的样本（图1B）;...

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An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

本研究中描述的利用肠道同质化提取物和免疫荧光染色的外体检测是一种研究胃肠道中念珠菌的催眠形态的新方法。 该方法可用于研究调节肠道形态遗传过渡的环境信号。

前体内分析研究胃 肠道的 念珠菌血脂磷

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

本视频中演示的协议使我们能够了解肠道代谢物在真菌催眠形态生成中的作用。这种外体技术或多或少是肠道研究真菌催眠形态的最接近近似值，无法进行体外研究。该方法可用于研究肠道代谢物在其他肠道病原体中的作用。使用解洗消毒的尖端剪刀和钳子解剖小鼠。安乐死后，通过固定所有四肢露出腹部，将动物固定在解剖表面。用70%乙醇喷洒腹部区域，防止毛皮粘在钳子、剪刀或肠道部分。使用钳子捏合和抬起腹部底部的一段皮肤，并通过皮肤和基础筋膜创建一个小切口，注意避免刺穿 cecum 或肠壁。将此切口扩展到肋骨部分露出腹腔，然后从两侧初始切口点开始切割，向上和横向延伸。横向拉动这些活门，将其固定在解剖表面，以完全暴露腹腔。用钳子提取胃肠道，同时用剪刀使切口优于胃和大肠的腹外区域，以确保收集最大的肠道含量。取出胃肠道时，注意避免损坏各个部件。分离胃，小肠，切库姆和大肠在他们的近端和近端。要收集每个部分的肠道内容物，在远端进行单个切口，然后手动将肠道内容物排出 1.5 毫升微离心管中。将样品储存在零下80摄氏度，进行外体测定。将 C. albicans SC5314 的新鲜文化带到 Ypd 阿加盘上， 在 30 摄氏度下孵育过夜。第二天，选择两到三个中等大小的个体菌落，并在一毫升PBS中重新暂停。从冰柜中取出冷冻的肠道内装物，并在25摄氏度下解冻。将大约150毫克的肠道内装物转移到新的1.5毫升管中，然后用150微升PBS重新发送。高速旋转样品30秒，使肠道内物均匀化，并允许其在室温下坐约一分钟。将同质物在1000次G下离心3分钟，然后将上分液转移到新的1.5毫升管中，注意不转移任何碎屑。重复离心后，在上经剂中加入10微升的C.albicans inculum，混合良好，并在37摄氏度下孵育样品4至5小时。要测试外源代谢物对C.albicans的影响，将所需的代谢物浓度添加到肠道含量和PBS混合物中，然后高速旋转样品30秒，让它在室温下坐10分钟，并如前所述进行离心和接种。将真菌细胞培养在1000倍G下离心两分钟，然后丢弃上经剂。将样品在 2%PFA 的 100 微升中固定 15 分钟，然后重复离心并丢弃上经剂。根据手稿方向用一毫升 PBS 清洗样品两次，然后在室温下用聚克隆 C.albicans 抗体在 100 微升 PBS 中孵育样品 30 分钟。孵育后，用PBS将样品清洗三次，在昏暗的灯光下工作，避免光漂白。在黑暗的房间里，在室温下孵育样品15分钟，在含有抗兔IgG Alexa Fluor 488抗体的100微升PBS中孵育15分钟，稀释1至500。用一毫升 PBS 洗涤样品三次后，将其重新用 100 微升 PBS 中重新暂停，并转移到 96 井板进行成像。使用荧光成像显微镜使用 20X 和 40 倍物镜以及绿色荧光蛋白过滤器对真菌细胞进行成像。当C.albicans在从胃、小肠和大肠中提取的肠道同质物中提取的外体中生长时，它通常与酵母形态形成。然而，当从抗生素治疗的小鼠的cesal提取物中生长时，C.albicans很容易经历形态形成，导致酵母和催眠形式。这表明抗生素治疗导致细胞环境的变化，从而诱发C.Albicans的催眠形态。抗生素治疗小鼠的 cecal 均质的外源性添加葡萄糖，在体内表现出巨大的催眠发育。这些结果表明，将肠道代谢物加入抗生素治疗小鼠的切脂均质中，对C.albicans的形态形成有不同作用。尝试此协议时，请记住，肠道含量的稀释优化可确保在不收集碎屑的情况下充分收集肠道代谢物。不要超过二对一介质对肠道含量稀释，并尽可能降低稀释。这项技术现在正被用来探索肠道中特定的代谢物如何影响催眠剂的发展，使研究人员能够更好地了解肠道代谢物在真菌发病机制中的作用。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

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竞争的原点实验研究肠嗜T细胞迁移

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

科研

免疫与感染

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建立一个<em&gt;在体外</em&gt;系统来研究细胞内的行为<em&gt;光滑念珠菌</em&gt;在人THP-1巨噬细胞

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前体内分析研究胃 肠道的 念珠菌血脂磷

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