Name: an ex vivo assay to study candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal tract
Uploaded: 2020-07-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract at JoVE.com

Forfatterne anerkender ressourcer og støtte fra Midwestern University Cellular og Molecular Core Research facilitet.

Alle dyreprotokoller blev godkendt af Midwestern University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) som beskrevet før57. Den institutionelle Animal Care and Use Udvalget på Midwestern University godkendt denne undersøgelse under MWU IACUC protokol #2894. MWU dyrepleje politikker følger Public Health Service (PHS) Politik om human pleje og brug af laboratoriedyr og de politikker, der er fastsat i Animal Welfare Act (AWA).
1. Mus studerer standardprotokol</p...

Den metode, der er beskrevet her præsenterer en ny måde at undersøge effekten af antibiotika, kosten, xenobiotiske og terapeutiske virkninger på C. albicans hyphal morfogens i mave-tarmkanalen. Da størstedelen af systemiske infektioner stammer framave-tarmkanalen 21,22,23,24,25,26,27,<sup c...

Candida albicans er en opportunistisk, polymorfe svampepatogen, der normalt commensal, men kan gennemgå en morfologisk ændring i en virulent form i stand til at forårsage livstruende infektioner i immunkompromitterede personer1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. C. albicans er en førende årsag til systemiske nosokomielle infektioner, med en 40\u201260% dødelighed selv med svampedræbende behandling2,14,15. Selvom C. albicans bor i forskellige værtsnicher, herunder det kvindelige reproduktive system16,17, stammer mundhulen for raske personer18 og mave-tarmkanalen (GI)19,20, størstedelen af de systemiske infektioner stammer fra mave-tarmkanalen og desuden, kilden til systemisk infektion bekræftes ofte som mave-tarmkanalen21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. C. albicanspatogenicitet i mave-tarmkanalen påvirkes af en lang række faktorer; en vigtig egenskab, der er nødvendig for virulens, er imidlertid overgangen fra en gærcellemorfologi til en virulent hyphalcellemorfologi35,36,37,38,39,40,41,42,43,44. C. albicans vedhæftet fil og formidling fra mave-tarmkanalen under infektion er stærkt forbundet med sin evne til at skifte fra en commensal gær til virulent hyphae, så svampene kan forårsage invasiv sygdom44,45,46,47,48,49,50,51,52,53.
En række faktorer i tarmen, herunder n-acetylglucosamin, regulere hyphal dannelse af C. albicans. Det er derfor afgørende at mindske kløften i viden om hyphal morfogens af dette svampepatogen imave-tarmkanalen 54,55,56. De seneste beviser tyderpå,at forskellige gutmetabolitter forskelligt kontrollerer hyphal morfogenese af C. albicans in vitro57,58,59,60. Men, tekniske begrænsninger præsentere spørgsmål, når de forsøger at studere C. albicans hyphae dannelse i in vivo tarm prøver, især farvning gær og hyphae celler og kvantitativ analyse af hyphal udvikling. For at forstå C. albicans hyphal morfogens i mave-tarmkanalen, en ex vivo metode blev udviklet ved hjælp af opløselige ekstrakter af homogeniseret tarmindhold fra mus til at undersøge effekten af metabolitter på svampehyphal morfosse. Udnytte tarmprøver fra mus, der er resistente og modtagelige for C. albicans GI-infektion, denne metode vil bidrage til at identificere og studere effekten af metabolitter, antibiotika og xenobiotika på svampehyphal morfogenese i mave-tarmkanalen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 - 10 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-454</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 - 1000 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-400</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 - 200 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-451</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutyric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>193070-25G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen (Fisher)</td>
			<td>A11008</td>
			<td>IF Staining secondary ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td>YPD agar component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Imaging Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZX700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Candida Albicans Antibody</td>
			<td>Invitrogen (Fisher)</td>
			<td>PA1-27158</td>
			<td>IF Staining primary ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cefoperazone</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>16113</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deoxycholic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30960</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-500</td>
			<td>hyphal-promoting compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lactic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAAL13242-06</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lithocholic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6250-10G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>palmitic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5585-10G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td>IF Staining fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS), 10x</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62692</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-tolylacetic acid</td>
			<td>SCBT</td>
			<td>sc-257959</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sebacic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>283258-250G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sharp ended scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>28301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile Milli-Q water</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD Broth</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>242810</td>
			<td>YPD agar component</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo assay to study candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal tract

Candida albicans hyphal morfogenese i mave (GI) tarmkanalen er stramt kontrolleret af forskellige miljømæssige signaler, og spiller en vigtig rolle i formidling og patogenese af denne opportunistiske svampepatogen. Men metoder til at visualisere svampehyfa i mave-tarmkanalen in vivo er udfordrende, hvilket begrænser forståelsen af miljøsignaler i at kontrollere denne morfogenese proces. Den protokol, der er beskrevet her, viser en ny ex vivo-metode til visualisering af hyphal morfosese i guthomogene ekstrakter. Ved hjælp af en ex vivo assay, denne undersøgelse viser, at cecal indhold fra antibiotika behandlede mus, men ikke fra ubehandlede kontrol mus, fremme C. albicans hyphal morfogens i tarmen indhold. Endvidere, tilføje tilbage specifikke grupper af tarm metabolitter til cecal indholdet fra antibiotika-behandlede mus differentieret regulerer hyphal morfogenese ex vivo. Samlet set repræsenterer denne protokol en ny metode til at identificere og undersøge de miljøsignaler, der styrer C. albicans hyphal morfogens i mave-tarmkanalen.

Disse resultater sammen med tidligere resultater fra Thangamani laboratoriet60 viser, at når C. albicans dyrkes ex vivo i tarmhomogenatekstrakter taget fra maven, tyndtarmen og tyktarmen af ubehandlet kontrol og antibiotikabehandlede mus, udvikler C. albicans generelt med en gærmorfologi (Figur 1B). Når C. albicans dyrkes i cecalekstraktet af antibiotikabehandlede mus, gennemgår de dog let morfogenese, hvilket resulterer i prøver indeho...

Watch this Scientific Journal Video about An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract at JoVE.com

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Ex vivo-analysen, der er beskrevet i denne undersøgelse ved hjælp af guthomogenatekstrakter og immunofluorescensfarvning, repræsenterer en ny metode til at undersøge hyphal morfogensen af Candida albicans i mave-tarmkanalen. Denne metode kan anvendes til at undersøge de miljømæssige signaler, der regulerer morfogenetiske overgang i tarmen.

En Ex vivo Assay at studere Candida albicans Hyphal Morphogenese i mave-tarmkanalen

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Protokollen demonstreret i denne video giver os mulighed for at forstå den rolle, gut metabolitter på svampehyphal morfogenese. Denne ex vivo teknik mere eller mindre den nærmeste tilnærmelse af tarmen til at studere svampehyphal morfogenese på en måde, at ingen in vitro undersøgelse kan replikere. Denne metode kan anvendes til at undersøge tarmmetabolitters rolle på andre enteriske patogener.Dissekere mus ved hjælp af autoklaveret steriliseret skarp-ended saks og skrænt. Efter dødshjælp, sikre dyret til en dissektion overflade ved at fastgøre alle lemmer til at udsætte maven. Spray maveregionen med 70% ethanol for at forhindre pels i at holde sig til spinces, saks, eller tarm sektioner.Brug viceiner til at knibe og løfte en del af huden i bunden af maven og skabe et lille snit gennem huden og underliggende fascia passe på at undgå at punktere cecum eller tarmvæg. Udvid dette snit til brystkassen delvist udsætter bughulen, derefter foretage et snit starter ved det punkt af det oprindelige snit på begge sider og strækker sig opad og side om side. Træk disse flapper side om side og pin dem til dissekering overfladen til fuldt ud at udsætte bughulen.Uddrag mave-tarmkanalen med spint, mens du bruger en saks til at foretage nedskæringer overlegen i forhold til maven og i den distale region af tyktarmen for at sikre indsamling af den største mængde af tarmindhold. Når du fjerner mave-tarmkanalen, skal du passe på at undgå brud de enkelte komponenter. Adskiv maven, tyndtarmen, cecum, og tyktarmen på deres proksimale og distale ender.For indsamling af tarmindhold fra hver sektion, foretage et enkelt snit i den distale ende, derefter manuelt udvise tarmindholdet i en 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør med kraftvæcener. Prøverne opbevares ved minus 80 grader Celsius for ex vivo-analyser. Streak en frisk kultur af C.albicans SC5314 på en YPD agar plade og inkubere det natten over ved 30 grader Celsius.På den næste dag, vælge to eller tre mellemstore individuelle kolonier og resuspend dem i en milliliter PBS. Hent frossen tarmindhold fra fryseren og tø dem ved 25 grader Celsius. Overfør ca. 150 milligram tarmindhold i et nyt 1,5 milliliterrør og opslæmmet dem med 150 mikroliter PBS.Vortex prøven ved høj hastighed i 30 sekunder for at homogenisere tarmindholdet og lad den sidde ved stuetemperatur i ca. et minut. Centrifuge homogenates ved 1, 000 gange G i tre minutter, derefter overføre supernatant til en ny 1,5 milliliter rør passe på ikke at overføre snavs. Efter at centrifugering, tilsæt 10 mikroliter af C.albicans inoculum til supernatant, bland godt, og inkubere prøven ved 37 grader Celsius i fire til fem timer.For at teste effekten af udefrakommende metabolitter på C.albicans, tilsæt den ønskede koncentration af metabolitter til tarmindholdet og PBS-blandingen, derefter vortex prøven ved høj hastighed i 30 sekunder, lad den sidde ved stuetemperatur i 10 minutter og udføre centrifugering og inokulering som tidligere beskrevet. Centrifuge svampecellekulturen ved 1.000 gange G i to minutter og kassér supernatanten. Prøverne fastgør prøverne i 100 mikroliter på 2% PFA i 15 minutter, og gentag derefter centrifugering og kassér supernatanten.Prøverne vaskes to gange med en milliliter PBS i overensstemmelse med manuskriptretningerne, hvor prøven inkuberes ved stuetemperatur i 100 mikroliter PBS med polyklonal c.albicansantistof i 30 minutter. Efter inkubationen vaskes prøven tre gange mere med PBS, der arbejder i svagt lys for at undgå fotobleaching. I et mørkt rum inkuberes prøverne ved stuetemperatur i 15 minutter i 100 mikroliter PBS indeholdende anti-kanin IgG Alexa Fluor 488 antistof ved en til 500 fortynding.Efter vask af prøven tre gange med en milliliter PBS, opslænes den i 100 mikroliter AF PBS og overføres til en 96-brøndplade til billedbehandling. Billede svampecellerne med et fluorescens-billedmikroskop ved hjælp af 20X- og 40X objektive linser og et grønt fluorescerende proteinfilter. Når C.albicans dyrkes ex vivo i tarmhomogene ekstrakter taget fra maven, tyndtarmen og tyktarmen af ubehandlet kontrol og antibiotikabehandlede mus, udvikler det generelt med en gærmorfologi.Men når dyrket i cecal ekstrakt fra antibiotika-behandlede mus, C.albicans let gennemgår morfogenese resulterer i gær og hyphae former. Dette indikerer, at antibiotisk behandling forårsager ændringer i cecal miljøet, som inducerer hyphal morfogens af C.Albicans. Eksogen tilsætning af glukose til cecal homogenat af antibiotikabehandlede mus viste en massiv hyphal udvikling ex vivo.Disse resultater tyder på, at tilsætning af gut metabolitter tilbage til cecal homogenat af antibiotika-behandlede mus differentieret regulerer morfogenese af C.albicans. Når du forsøger denne protokol, huske på, at optimering af fortynding af tarmen indhold sikrer tilstrækkelig indsamling af gut metabolitter uden indsamling af snavs. Må ikke overstige en to-til-en media-to-gut indhold fortynding og sigte mod en lavere fortynding, hvis det er muligt.Denne teknik bliver brugt nu til at undersøge, hvordan specifikke metabolitter i tarmen indvirkning hyphal udvikling, så forskerne bedre kan forstå den rolle, gut metabolitter på svampepatogenese.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

At studere mikrobielle samfund<em&gt; In vivo</em&gt;: En model af Host-medieret samspil mellem<em&gt; Candida albicans</em&gt; Og<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I luftvejene

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualisering af Biofilmdannelse i Candida albicans ved hjælp af en automatiseret mikrofluid enhed

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

En Ex Vivo kylling primære Bursal-cellekultur Model til at studere smitsomme Bursal Disease Virus patogenese

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Daglige lysbehandling med rødt lys til Regulate Candida albicans Biofilm vækst

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualisering af Candida albicans i murine mave-tarmkanalen ved hjælp fluorescerende in situ hybridisering

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Afklaring og Imaging Candida albicans Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

Rose Bengal-medieret fotodynamisk terapi til at hæmme Candida albicans

Invasive Candida albicans infection is a significant opportunistic fungal infection in humans because it is one of the most common colonizers of the gut, ...