Name: an ex vivo assay to study candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal tract
Uploaded: 2020-07-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract at JoVE.com

De auteurs erkennen middelen en ondersteuning van Midwestern University Cellular and Molecular Core Research faciliteit.

Alle dierprotocollen werden goedgekeurd door midwestern University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) zoals beschreven vóór57. De Institutional Animal Care and Use Committee van de Midwestern University keurde deze studie onder MWU IACUC Protocol #2894. Het MWU-beleid voor dierverzorging volgt het Beleid van de Ggd voor humane zorg en gebruik van proefdieren en het beleid dat is vastgelegd in de Wet dierenwelzijn (AWA).
1. Muizen bestuderen standaardpro...

De hier beschreven methode presenteert een nieuwe manier om het effect van antibiotica, dieet, xenobiotische en therapeutische effecten op C. albicans hyphalmorphogenese in het GI-kanaal te onderzoeken. Aangezien de meeste systemische infecties afkomstig zijn van het GI-kanaal21,22,23,24,25,26,<sup class="...

Candida albicans is een opportunistische, polymorfe schimmelpathiek die normaal commensal is, maar een morfologische verandering kan ondergaan in een virulente vorm die levensbedreigende infecties kan veroorzaken bij immuungecompromitteerde personen1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. C. albicans is een belangrijke oorzaak van systemische nosocomiale infecties, met een sterftecijfer van 40\u201260% zelfs met schimmeldodende behandeling2,14,15. Hoewel C. albicans zich in verschillende gastheerniches bevindt, waaronder het vrouwelijke voortplantingssysteem16,17,de mondholte van gezonde individuen18 en het maag-darmkanaal19,20, is het merendeel van de systemische infecties afkomstig van het GI-darmkanaal en bovendien, de bron van systemische infectie wordt vaak bevestigd als het GI-kanaal21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. C. albicans pathogeniteit in het GI-darmkanaal wordt beïnvloed door een breed scala van factoren; een belangrijk kenmerk dat nodig is voor virulentie is echter de overgang van een gistcelmorfologie naar een virulente hyphaltecelmorfologie35,36,37,38,39,40,41,42,43,44. C. albicans gehechtheid en verspreiding van het GI-darmkanaal tijdens infectie wordt sterk geassocieerd met zijn vermogen om over te stappen van een commensale gist in virulente hyphae, waardoor de schimmels invasieve ziekte44,45,46,47,48,49,50,51,52,53kunnen veroorzaken .
Een verscheidenheid van factoren in de darm, met inbegrip van n-acetylglucosamine, reguleren hyphal vorming door C. albicans. Daarom is het van cruciaal belang om de kloof in kennis over de hyphalemorfose van deze schimmelpathogenese in het GI-kanaal54,55,56teverkleinen . Recent bewijs wijst erop dat verschillende darmmetabolieten de hyphalemorfogenese van C. albicans in vitro57,58,59,60differentieel controleren . Echter, technische beperkingen presenteren problemen bij een poging om C. albicans hyphae vorming studie in in vivo darmmonsters, met name kleuring gist en hyphae cellen en kwantitatieve analyse van hyphal ontwikkeling. Om C. albicans hyphale morfogenese in het GI-kanaal te begrijpen, werd een ex vivo-methode ontwikkeld met behulp van oplosbare extracten van gehomogeniseerd darmgehalte van muizen om het effect van metabolieten op schimmelhyphale morfogenese te bestuderen. Gebruikmakend van darmmonsters van muizen die resistent zijn en gevoelig zijn voor C. albicans GI-infectie, zal deze methode helpen om het effect van metabolieten, antibiotica en xenobiotica op schimmelhyphale morfogenese in het GI-darmkanaal te identificeren en te bestuderen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 - 10 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-454</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 - 1000 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-400</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 - 200 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-451</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutyric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>193070-25G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen (Fisher)</td>
			<td>A11008</td>
			<td>IF Staining secondary ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td>YPD agar component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Imaging Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZX700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Candida Albicans Antibody</td>
			<td>Invitrogen (Fisher)</td>
			<td>PA1-27158</td>
			<td>IF Staining primary ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cefoperazone</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>16113</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deoxycholic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30960</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-500</td>
			<td>hyphal-promoting compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lactic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAAL13242-06</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lithocholic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6250-10G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>palmitic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5585-10G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td>IF Staining fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS), 10x</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62692</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-tolylacetic acid</td>
			<td>SCBT</td>
			<td>sc-257959</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sebacic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>283258-250G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sharp ended scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>28301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile Milli-Q water</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD Broth</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>242810</td>
			<td>YPD agar component</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo assay to study candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal tract

Candida albicans hyphalemorfogenese in het maag-darmkanaal (GI) wordt strak gecontroleerd door verschillende milieusignalen, en speelt een belangrijke rol in de verspreiding en pathogenese van deze opportunistische schimmelpathover. Echter, methoden om schimmelhyphae visualiseren in de GI tract in vivo zijn uitdagend die het begrip van milieusignalen beperkt bij het beheersen van dit morfogenese proces. Het hier beschreven protocol toont een nieuwe ex vivo methode voor visualisatie van hyphal morfogenese in darmhomogenaat extracten. Met behulp van een ex vivo test, deze studie toont aan dat cecal inhoud van antibiotica behandelde muizen, maar niet van onbehandelde controle muizen, bevorderen C. albicans hyphal morfogenese in de darminhoud. Verder, het toevoegen van terug specifieke groepen van darmmetabolieten aan de cecal inhoud van met antibiotica behandelde muizen differentieel reguleert hyphalfogenese ex vivo. Samen vertegenwoordigt dit protocol een nieuwe methode om de milieusignalen te identificeren en te onderzoeken die C. albicans hyphal morfogenese in het GI-kanaal controleren.

Deze resultaten samen met eerdere bevindingen uit het Thangamani laboratorium60 geven aan dat wanneer C. albicans wordt geteeld ex vivo in gut homogenaat extracten uit de maag, dunne darmen en dikke darmen van onbehandelde controle en antibiotica behandelde muizen, C. albicans ontwikkelt zich over het algemeen met een gist morfologie (Figuur 1B). Echter, wanneer geteeld in het cecal extract van met antibiotica behandelde muizen, C. albicans ...

Watch this Scientific Journal Video about An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract at JoVE.com

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

De ex vivo test beschreven in deze studie met behulp van gut homogenaat extracten en immunofluorescentie kleuring vertegenwoordigt een nieuwe methode om de hyphal morfogenese van Candida albicans in de GI-darmkanaal te onderzoeken. Deze methode kan worden gebruikt om de milieusignalen te onderzoeken die morfogenetische overgang in de darm regelen.

Een Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in het maag-darmkanaal

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Het protocol aangetoond in deze video stelt ons in staat om de rol van darmmetabolieten op schimmelhyphal hyphal morfogenese te begrijpen. Deze ex vivo techniek min of meer de dichtstbijzijnde benadering van de darm voor het bestuderen van schimmel hyphal morfogenese op een manier die geen in vitro studie kan repliceren. Deze methode kan worden toegepast om de rol van darmmetabolieten op andere enterische pathogenen te bestuderen.Ontleden muizen met behulp van autoclaved gesteriliseerde scherp-ended schaar en tangen. Na euthanasie, zet het dier vast aan een dissectieoppervlak door alle ledematen vast te pinnen om de buik bloot te stellen. Spray de buikstreek met 70% ethanol om te voorkomen dat bont vastkleeft aan tangen, scharen of darmsecties.Gebruik tangen te knijpen en til een deel van de huid aan de basis van de buik en maak een kleine incisie door de huid en de onderliggende fascia verzorgen om te voorkomen dat puncturing de cecum of darmwand. Breid deze snede uit tot de ribbenkast en stel de buikholte gedeeltelijk bloot en maak vervolgens een snede vanaf het punt van de initiële incisie aan weerszijden en strekt zich uit naar boven en zijdelings. Trek deze flappen zijdelings en pin ze aan het ontledende oppervlak om de buikholte volledig bloot te leggen.Haal het GI-darmkanaal met tangen eruit terwijl je een schaar gebruikt om snijwonden superieur te maken aan de maag en in het distale gebied van de dikke darm om de grootste hoeveelheid darminhoud te verzamelen. Let er bij het verwijderen van het GI-kanaal op dat de afzonderlijke componenten niet meer worden gescheurd. Scheid de maag, dunne darm, cecum, en dikke darm op hun proximale en distale uiteinden.Voor het verzamelen van darminhoud van elke sectie, maak een enkele incisie aan het distale uiteinde, dan handmatig verdrijven de darminhoud in een 1,5 milliliter microcentrifuge buis met tangen. Bewaar de monsters op min 80 graden Celsius voor ex vivo tests. Streep een frisse cultuur van C.albicans SC5314 op een YPD agar plaat en broed het 's nachts op 30 graden Celsius.Op de volgende dag, kies twee of drie middelgrote individuele kolonies en resuspend ze in een milliliter pbs. Haal bevroren darminhoud uit de vriezer en ontdooi ze op 25 graden Celsius. Breng ongeveer 150 milligram darminhoud over in een nieuwe buis van 1,5 milliliter en zet ze opnieuw op met 150 microliter PBS.Vortex het monster op hoge snelheid gedurende 30 seconden om de darminhoud te homogeniseren en laat het zitten op kamertemperatuur voor ongeveer een minuut. Centrifugeer de homogenaten op 1.000 keer G gedurende drie minuten, dan de overdracht van de supernatant naar een nieuwe 1,5 milliliter buis die ervoor zorgt dat geen puin over te dragen. Voeg na het herhalen van de centrifugatie 10 microliter van het C.albicans-inoculum toe aan het supernatant, meng goed en broed het monster vier tot vijf uur in op 37 graden Celsius.Om het effect van exogene metabolieten op C.albicans te testen, voeg de gewenste concentratie metabolieten toe aan het darmgehalte en het PBS-mengsel, draai je het monster vervolgens 30 seconden op hoge snelheid, laat het 10 minuten op kamertemperatuur zitten en voer centrifugatie en inenting uit zoals eerder beschreven. Centrifuge de schimmelcelcultuur op 1.000 keer G gedurende twee minuten en gooi de supernatant weg. Bevestig de monsters in 100 microliter van 2%PFA gedurende 15 minuten, herhaal de centrifugatie en gooi de supernatant weg.Was de monsters twee maal met een milliliter PBS volgens de handschriftaanwijzing en broed de monsters vervolgens bij kamertemperatuur in 100 microliter pbs met polyklonal c.albicans antilichaam gedurende 30 minuten. Na de incubatie was je het monster nog drie keer met PBS, werkend bij weinig licht om fotobleaching te voorkomen. In een donkere kamer, incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten in 100 microliter van PBS met anti-konijn IgG Alexa Fluor 488 antilichaam bij een een tot 500 verdunning.Na het wassen van het monster drie keer met een milliliter PBS, resuspend het in 100 microliter van PBS en breng het naar een 96-well plaat voor beeldvorming. Beeld de schimmelcellen met een fluorescentie beeldmicroscoop met behulp van 20X en 40X objectieve lenzen en een groene fluorescerende eiwitfilter. Wanneer C.albicans wordt geteeld ex vivo in gut homogenaat extracten uit de maag, dunne darmen en dikke darmen van onbehandelde controle en antibiotica behandelde muizen, het ontwikkelt zich over het algemeen met een gist morfologie.Echter, wanneer geteeld in de cecal extract van met antibiotica behandelde muizen, C.albicans gemakkelijk ondergaat morfogenese wat resulteert in gist en hyphae vormen. Dit geeft aan dat behandeling met antibiotica veranderingen in de cecal omgeving veroorzaakt, die hyphal morfogenese van C.Albicans induceren. Exogene toevoeging van glucose aan het cecal homogenaat van met antibiotica behandelde muizen toonde een enorme hyphal ontwikkeling ex vivo.Deze resultaten suggereren dat toevoeging van darmmetabolieten terug naar het cecal homogenaat van de met antibiotica behandelde muizen de morfogenese van C.albicans differentieel reguleert. Houd er bij een poging dit protocol rekening mee dat optimalisatie van de verdunning van het darmgehalte zorgt voor voldoende inzameling van darmmetabolieten zonder inzameling van puin. Niet meer dan een twee-op-een media-tot-darmgehalte verdunning en streven naar een lagere verdunning indien mogelijk.Deze techniek wordt nu gebruikt om te onderzoeken hoe specifieke metabolieten in de darm impact hyphal ontwikkeling, waardoor onderzoekers beter te begrijpen van de rol van darmmetabolieten op schimmel pathogenese.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Concurrerende Homing Testen om de Gut-tropische T-cel-migratie Study

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Isolatie van RNA Pseudomonas aeruginosa Kolonisatie van de muizen Maagdarmkanaal

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Oprichting van een<em&gt; In vitro</em&gt; Systeem om Intracellular Gedrag van Studie<em&gt; Candida glabrata</em&gt; In Human THP-1 macrofagen

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Bestuderen van microbiële gemeenschappen<em&gt; In Vivo</em&gt;: Een model van de Host-gemedieerde interactie tussen<em&gt; Candida albicans</em&gt; En<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In het Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualisatie van Biofilm vorming in Candida albicans met behulp van een geautomatiseerd Microfluidic-apparaat

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Een Ex Vivo kip primaire Bursal-celkweek Model studie Bursal infectieziekte Virus pathogenese

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Dagelijkse fototherapie met rood licht te reguleren Candida albicans Biofilm groei

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualisatie van Candida albicans in de Murine gastro-intestinale tractus met behulp van fluorescerende in situ hybridisatie

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Verduidelijken en beeldvorming Candida albicans Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

Rose Bengal-Gemedieerde fotodynamische therapie om Candida albicans te remmen

Invasive Candida albicans infection is a significant opportunistic fungal infection in humans because it is one of the most common colonizers of the gut, ...