Name: an ex vivo assay to study candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal tract
Uploaded: 2020-07-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract at JoVE.com

Die Autoren würdigen Ressourcen und Unterstützung von Midwestern University Cellular and Molecular Core Research Facility.

Alle Tierprotokolle wurden vom Midwestern University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) wie vor57beschrieben genehmigt. Der Institutional Animal Care and Use Committee der Midwestern University genehmigte diese Studie im Rahmen des MWU IACUC Protocol #2894. Die MWU-Tierpflegerichtlinien folgen der Politik des öffentlichen Gesundheitsdienstes (PHS) zur humanen Pflege und Verwendung von Labortieren und den Richtlinien des Tierschutzgesetzes (AWA).
1. Mäus...

Die hier beschriebene Methode stellt eine neue Methode dar, um die Wirkung von antibiotika-, diätetischen, xenobiotischen und therapeutischen Auswirkungen auf die Hypahypomorphese von C. albicans im GI-Trakt zu untersuchen. Da die Mehrheit der systemischen Infektionen aus dem GI-Traktstammen 21,22,23,24,25,26,<...

Candida albicans ist ein opportunistischer, polymorpher Pilzerreger, der normalerweise commensal ist, aber eine morphologische Veränderung in eine virulente Form durchmachen kann, die lebensbedrohliche Infektionen bei immungeschwächten Individuen1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13verursachen kann. C. albicans ist eine der Hauptursachen für systemische nosokomiale Infektionen, mit einer Sterblichkeitsrate von 40-u201260% auch bei antimykogaler Behandlung2,14,15. Obwohl C. albicans in verschiedenen Wirtsnischen einschließlich des weiblichen Fortpflanzungssystems16,17, die Mundhöhle von gesunden Personen18 und der Magen-Darm-Trakt19,20, die Mehrheit der systemischen Infektionen stammen aus dem GI-Trakt und darüber hinaus, die Quelle der systemischen Infektion wird oft bestätigt, um die GI-Trakt21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. C. Albicans Pathogenität im GI-Trakt wird durch eine Vielzahl von Faktoren beeinflusst; Ein wesentliches Merkmal, das für die Virulenz notwendig ist, ist jedoch der Übergang von einer Hefezellmorphologie zu einer virulenten Hypothekzellmorphologie35,36,37,38,39,40,41,42,43,44. C. Albicans Anhaftung und Verbreitung aus dem GI-Trakt während der Infektion ist stark mit seiner Fähigkeit verbunden, von einer kommensalen Hefe in virulenten Hyphen zu übergehen, so dass die Pilze invasive Krankheitverursachen 44,45,46,47,48,49,50,51,52,53.
Eine Vielzahl von Faktoren im Darm, einschließlich n-Acetylglucosamin, regulieren Hyphalbildung durch C. albicans. Daher ist es entscheidend, die Wissenslücke über die Hyphalmorphogenese dieses Pilzerregers im GI-Trakt54,55,56zu verringern. Jüngste Hinweise deuten darauf hin, dass verschiedene Darmmetaboliten die Hyphalmorphogenese von C. albicans in vitro57,58,59,60differenziell steuern. Jedoch, technische Zwänge stellen Probleme bei dem Versuch, C. albicans Hyphen Bildung in in vivo Darmproben zu studieren, insbesondere Färbung Hefe und Hyphenzellen und quantitative Analyse der Hyphal-Entwicklung. Um die Hyphalmorphogenese von C. albicans im GI-Trakt zu verstehen, wurde eine Ex-vivo-Methode entwickelt, bei der lösliche Extrakte mit homogenisiertem Darmgehalt von Mäusen verwendet wurden, um die Wirkung von Metaboliten auf die Pilzhyptohypomorphogenese zu untersuchen. Mit Hilfe von Darmproben von Mäusen, die resistent und anfällig für C. albicans GI-Infektion sind, wird diese Methode helfen, die Wirkung von Metaboliten, Antibiotika und Xenobiotika auf Pilzhyptohypomorphogenese im GI-Trakt zu identifizieren und zu studieren.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 - 10 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-454</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 - 1000 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-400</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 - 200 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-451</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutyric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>193070-25G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen (Fisher)</td>
			<td>A11008</td>
			<td>IF Staining secondary ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td>YPD agar component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Imaging Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZX700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Candida Albicans Antibody</td>
			<td>Invitrogen (Fisher)</td>
			<td>PA1-27158</td>
			<td>IF Staining primary ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cefoperazone</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>16113</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deoxycholic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30960</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-500</td>
			<td>hyphal-promoting compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lactic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAAL13242-06</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lithocholic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6250-10G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>palmitic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5585-10G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td>IF Staining fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS), 10x</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62692</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-tolylacetic acid</td>
			<td>SCBT</td>
			<td>sc-257959</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sebacic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>283258-250G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sharp ended scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>28301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile Milli-Q water</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD Broth</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>242810</td>
			<td>YPD agar component</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo assay to study candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal tract

Candida albicans Hyphal Morphogenese im Magen-Darm-Trakt (GI) wird durch verschiedene Umweltsignale streng kontrolliert und spielt eine wichtige Rolle bei der Verbreitung und Pathogenese dieses opportunistischen Pilzerregers. Allerdings sind Methoden zur Visualisierung von Pilzhyphen im GI-Trakt in vivo eine Herausforderung, die das Verständnis von Umweltsignalen bei der Steuerung dieses Morphogenese-Prozesses einschränkt. Das hier beschriebene Protokoll zeigt eine neuartige ex vivo Methode zur Visualisierung der Hyphalmorphogenese in Darmhomogenatextrakten. Anhand eines Ex-vivo-Assays zeigt diese Studie, dass cecal-Gehalte von antibiotikabehandelten Mäusen, aber nicht von unbehandelten Kontrollmäusen, C. albicans Hyphalmorphogenese im Darmgehalt fördern. Darüber hinaus reguliert das Hinzufügen spezifischer Gruppen von Darmmetaboliten zu den Cecal-Inhalten von antibiotikabehandelten Mäusen die Hyphenmorphogenese ex vivo. Zusammengenommen stellt dieses Protokoll eine neuartige Methode dar, um die Umweltsignale zu identifizieren und zu untersuchen, die die Hyphalmorphogenese von C. albicans im GI-Trakt steuern.

Diese Ergebnisse zusammen mit früheren Erkenntnissen aus dem Thangamani-Labor60 deuten darauf hin, dass, wenn C. albicans ex vivo in Darmhomogenat-Extrakten aus dem Magen, Dünndarm und Dickdarm von unbehandelten Kontroll- und antibiotikabehandelten Mäusen angebaut wird, C. albicans in der Regel mit einer Hefemorphologie entwickelt (Abbildung 1B). Wenn jedoch im Cecal-Extrakt von antibiotikabehandelten Mäusen angebaut, erfährt C. albicans</em...

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An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Der in dieser Studie beschriebene Ex-vivo-Assay mit Darmhomogenat-Extrakten und Immunfluoreszenzfärbung stellt eine neuartige Methode dar, um die Hypahypomorphogenese von Candida albicans im GI-Trakt zu untersuchen. Diese Methode kann verwendet werden, um die Umweltsignale zu untersuchen, die den morphogenetischen Übergang im Darm regulieren.

Ein Ex-vivo-Assay zur Untersuchung von Candida albicans Hyphal Morphogenese im Magen-Darm-Trakt

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Das in diesem Video gezeigte Protokoll ermöglicht es uns, die Rolle von Darmmetaboliten bei der Pilzhyphypomorphogenese zu verstehen. Diese ex vivo Technik mehr oder weniger die nächste Annäherung des Darms für die Untersuchung der Pilzhyphypomorphogenese in einer Weise, die keine In-vitro-Studie replizieren kann. Diese Methode kann angewendet werden, um die Rolle von Darmmetaboliten auf andere enterische Krankheitserreger zu untersuchen.Sezieren Sie Mäuse mit autoklavierten sterilisierten scharfsinder Schere und Zange. Nach der Euthanasie, sichern Sie das Tier an einer Sezierfläche, indem Sie alle Gliedmaßen anheften, um den Bauch zu entblößen. Sprühen Sie den Bauchbereich mit 70% Ethanol, um zu verhindern, dass Fell an Zangen, Scheren oder Darmabschnitten klebt.Verwenden Sie Zangen, um einen Teil der Haut an der Basis des Bauches zu kneifen und zu heben und einen kleinen Schnitt durch die Haut und die zugrunde liegende Faszie zu erstellen, wobei darauf geachtet wird, dass das Cecum oder die Darmwand nicht durchbrochen wird. Erweitern Sie diesen Schnitt auf den Rippenkorb, der die Peritonealhöhle teilweise freilegt, und machen Sie dann einen Schnitt, der an der Stelle des anfänglichen Schnitts auf beiden Seiten beginnt und sich nach oben und seitlich erstreckt. Ziehen Sie diese Klappen seitlich und heften Sie sie an die Sezierender Oberfläche, um die Peritonealhöhle vollständig freizulegen.Extrahieren Sie den GI-Trakt mit Zange, während Sie eine Schere verwenden, um Schnitte zu machen, die dem Magen und der distalen Region des Dickdarms überlegen sind, um die Sammlung der größten Menge an Darmgehalt zu gewährleisten. Achten Sie beim Entfernen des GI-Trakts darauf, dass die einzelnen Komponenten nicht zerbrechen. Trennen Sie den Magen, Dünndarm, Cecum, und Dickdarm an ihren proximalen und distalen Enden.Für die Sammlung von Darminhalten aus jedem Abschnitt, machen Sie einen einzigen Schnitt am distalen Ende, dann manuell den Darminhalt in einem 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr mit Zangen zu vertreiben. Bewahren Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius für Ex-vivo-Assays auf. Streifen Sie eine frische Kultur von C.albicans SC5314 auf eine YPD AgarPlatte und bebrüten sie über Nacht bei 30 Grad Celsius.Am nächsten Tag zwei oder drei mittelgroße Einzelkolonien pflücken und in einem Milliliter PBS wieder aussetzen. Holen Sie gefrorenen Darminhalt aus dem Gefrierschrank und tauen Sie sie bei 25 Grad Celsius auf. Etwa 150 Milligramm Darminhalt in ein neues 1,5-Milliliter-Rohr geben und mit 150 Mikroliter PBS wieder aufhängen.Wirbeln Sie die Probe 30 Sekunden lang mit hoher Geschwindigkeit an, um den Darminhalt zu homogenisieren und sie etwa eine Minute bei Raumtemperatur sitzen zu lassen. Zentrifugieren Sie die Homogenate bei 1.000 mal G für drei Minuten, dann übertragen Sie den Überstand auf ein neues 1,5-Milliliter-Rohr, wobei darauf geachtet wird, keine Trümmer zu übertragen. Nach der Wiederholung der Zentrifugation 10 Mikroliter des C.albicans inoculum inoculum zum Überstand geben, gut mischen und die Probe vier bis fünf Stunden bei 37 Grad Celsius bebrüten.Um die Wirkung von exogenen Metaboliten auf C.albicans zu testen, fügen Sie die gewünschte Konzentration von Metaboliten in den Darmgehalt und das PBS-Gemisch ein, wirbeln Sie die Probe dann 30 Sekunden lang mit hoher Geschwindigkeit aus, lassen Sie sie 10 Minuten bei Raumtemperatur sitzen und zentrifugieren und impfen, wie zuvor beschrieben. Zentrifugieren Sie die Pilzzellkultur bei 1.000 mal G für zwei Minuten und entsorgen Sie den Überstand. Fixieren Sie die Proben in 100 Mikroliter von 2%PFA für 15 Minuten, dann wiederholen Sie die Zentrifugation und entsorgen Sie den Überstand.Waschen Sie die Proben zweimal mit einem Milliliter PBS nach Manuskriptanweisungen, dann inkubieren Sie die Proben bei Raumtemperatur in 100 Mikroliter PBS mit polyklonenem C.albicans Antikörper für 30 Minuten. Nach der Inkubation, waschen Sie die Probe drei weitere Male mit PBS, arbeiten in dim Licht, um Photobleicharbeiten zu vermeiden. In einem dunklen Raum die Proben bei Raumtemperatur für 15 Minuten in 100 Mikroliter PBS mit Anti-Kaninchen IgG Alexa Fluor 488 Antikörper bei einer verdünnungsgemäßen ein bis 500.Nachdem Sie die Probe dreimal mit einem Milliliter PBS gewaschen haben, setzen Sie sie in 100 Mikroliter PBS wieder auf und übertragen Sie sie zur Bildgebung auf eine 96-Well-Platte. Stellen Sie die Pilzzellen mit einem Fluoreszenz-Bildgebungsmikroskop mit 20X- und 40X-Objektivlinsen und einem grünen Fluoreszenzproteinfilter ab. Wenn C.albicans ex vivo in Darmhomogenat-Extrakten aus dem Magen, Dünndarm und Dickdarm von unbehandelten Kontroll- und antibiotikabehandelten Mäusen angebaut wird, entwickelt es sich in der Regel mit einer Hefemorphologie.Wenn C.albicans jedoch im Cecal-Extrakt von antibiotikabehandelten Mäusen angebaut wird, erfährt es leicht einer Morphogenese, die zu Hefe- und Hyphenformen führt. Dies deutet darauf hin, dass die Behandlung von Antibiotika Veränderungen in der zekalen Umgebung verursacht, die eine Hyphalmorphogenese von C.Albicans induzieren. Die exogene Zugabe von Glukose zum Cecal-Homogenat von antibiotikabehandelten Mäusen zeigte eine massive Hyphalentwicklung ex vivo.Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Zugabe von Darmmetaboliten zurück zum Cecal-Homogenat der antibiotikabehandelten Mäuse die Morphogenese von C.albicans differenziell reguliert. Beachten Sie beim Versuch dieses Protokolls, dass die Optimierung der Verdünnung des Darmgehalts eine ausreichende Sammlung von Darmmetaboliten ohne Sammlung von Schmutz sicherstellt. Überschreiten Sie nicht eine Verdünnung des Medien-zu-Darm-Inhalts von zwei zu eins und zielen Sie nach Möglichkeit auf eine geringere Verdünnung ab.Diese Technik wird jetzt verwendet, um zu erforschen, wie spezifische Metaboliten in der Darm-Wirkung Hyphal-Entwicklung, so dass Forscher besser verstehen, die Rolle der Darmmetaboliten auf Pilz pathogenese.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Competitive Homing-Assays auf Gut-trope T-Zell-Migration Study

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Forschung

Immunologie und Infektion

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolierung von Pseudomonas aeruginosa Kolonisierung der Murine Gastrointestinaltrakt

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Einrichtung einer<em&gt; In-vitro-</em&gt; System zur intrazelluläre Verhalten der Studie<em&gt; Candida glabrata</em&gt; Menschen THP-1-Makrophagen

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studieren Mikrobielle Gemeinschaften<em&gt; In-vivo-</em&gt;: Ein Modell von Host-vermittelte Interaktion zwischen<em&gt; Candida albicans</em&gt; Und<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In den Atemwegen

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualisierung der Biofilmbildung in Candida Albicans ein automatisiertes mikrofluidischen Gerät

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Ein Ex-Vivo Huhn Primärkultur Bursitis-Zelle Modell zur Bursitis Infektionskrankheit Virus Pathogenese

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Tägliche Phototherapie mit rotem Licht zu regulieren Candida Albicans Biofilm Wachstum

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualisierung von Candida albicans im Murine Gastrointestinal Tract mit fluoreszierender In-Situ-Hybridisierung

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Klärende und Bildgebung Candida albicans Biofilme

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

Rosenbengalen-vermittelte photodynamische Therapie zur Hemmung von Candida albicans

Invasive Candida albicans infection is a significant opportunistic fungal infection in humans because it is one of the most common colonizers of the gut, ...