Name: an ex vivo assay to study candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal tract
Uploaded: 2020-07-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract at JoVE.com

लेखक मिडवेस्टर्न यूनिवर्सिटी सेलुलर और मॉलिक्यूलर कोर रिसर्च फैसिलिटी से संसाधनों और समर्थन को स्वीकार करते हैं ।

सभी पशु प्रोटोकॉल मिडवेस्टर्न विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित के रूप में५७से पहले वर्णित थे । मिडवेस्टर्न विश्वविद्यालय में संस्थागत पशु देखभाल और उप?...

यहां वर्णित विधि जीआई पथ में सी एल्बिकान हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस पर एंटीबायोटिक, आहार, ज़ेनोबायोटिक और चिकित्सीय प्रभावों के प्रभाव की जांच करने का एक उपन्यास तरीका प्रस्तुत करती है। चूंकि अधिकांश ?...

कैंडिडा एल्बिकान एक अवसरवादी, बहुरूपी फंगल रोगजनक है जो सामान्य रूप से अनुकूल होता है, लेकिन इम्यूनोसमझित व्यक्तियों1, 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13में जीवन-धमकी भरे संक्रमण पैदा करने में सक्षम एक उग्र रूप में एक रूपात्मक परिवर्तन से गुजरना पड़ सकता है। सी एल्बिकैन प्रणालीगत नोसोकोमियल संक्रमणों का एक प्रमुख कारण है, जिसमें एंटीफंगल उपचार 2, 14,15के साथभी 40\u201260%मृत्यु दर है। हालांकि सी एल्बिकन महिला प्रजनन प्रणाली16, 17सहित विभिन्न मेजबान निकस में रहता है, स्वस्थ व्यक्तियों की मौखिक गुहा18 और गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल (जीआई) पथ19,20,अधिकांश प्रणालीगत संक्रमण जीआई पथ से उत्पन्न होते हैं और इसके अलावा, प्रणालीगत संक्रमण के स्रोत की पुष्टि अक्सर जीआई ट्रैक्ट21, 22,23,24, 25,26,27,28,29,30, 31,33,33,34से की जाती है । जीआई पथ में सी एल्बिकान रोगजनकता कारकों की एक विस्तृत श्रृंखला से प्रभावित होती है; हालांकि, उग्रता के लिए आवश्यक एक प्रमुख विशेषता खमीर कोशिका आकृति विज्ञान से उग्र हाइथल सेल आकृति विज्ञान 35,36,37,38,39,40,41,42,43,44में संक्रमण है । संक्रमण के दौरान जीआई पथ सेसी एल्बिकान अटैचमेंट और प्रसार अत्यधिक एक अनुकूल खमीर से उग्र हाइफा में संक्रमण करने की क्षमता से जुड़ा हुआ है, जिससे कवक को आक्रामक रोग44,45, 46, 47,48,49,50, 50,52,53होता है।
आंत में कई कारक, जिनमें एन-एसिटिलग्लूकोसामाइन शामिल हैं, सी एल्बिकानद्वारा हाइफाल गठन को विनियमित करते हैं। इसलिए , जीआई पथ54 , 55,56में इस फंगल रोगजनक के हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस के बारे में ज्ञान में अंतर को कम करना महत्वपूर्ण है । हाल के साक्ष्य ों से पता चलता है कि विभिन्न आंत मेटाबॉलिज् म विट्रो57 , 58,59,60में सी एल्बिकान के हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस को अलग तरह सेनियंत्रितकरते हैं। हालांकि, तकनीकी बाधाओं के मुद्दों को मौजूद है जब वीवो आंत के नमूनों में सी एल्बिकन हाइफाई गठन का अध्ययन करने का प्रयास, विशेष रूप से खमीर और हाइफाई कोशिकाओं और हाइफल विकास के मात्रात्मक विश्लेषण को धुंधला करना। जीआई पथ में सी एल्बिकैन हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस को समझने के लिए, फंगल हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस पर मेटाबोलाइट्स के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए चूहों से समरूप आंत सामग्री के घुलनशील अर्क का उपयोग करके एक पूर्व वीवो विधि विकसित की गई थी। चूहों से आंत के नमूनों का उपयोग करना जो प्रतिरोधी हैं और सी एल्बिकन जीआई संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील हैं, यह विधि जीआई ट्रैक्ट में फंगल हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस पर मेटाबोलाइट्स, एंटीबायोटिक्स और ज़ेनोबायोटिक्स के प्रभाव की पहचान करने और अध्ययन करने में मदद करेगी।

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 - 10 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-454</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 - 1000 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-400</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 - 200 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-451</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutyric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>193070-25G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen (Fisher)</td>
			<td>A11008</td>
			<td>IF Staining secondary ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td>YPD agar component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Imaging Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZX700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Candida Albicans Antibody</td>
			<td>Invitrogen (Fisher)</td>
			<td>PA1-27158</td>
			<td>IF Staining primary ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cefoperazone</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>16113</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deoxycholic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30960</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-500</td>
			<td>hyphal-promoting compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lactic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAAL13242-06</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lithocholic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6250-10G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>palmitic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5585-10G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td>IF Staining fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS), 10x</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62692</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-tolylacetic acid</td>
			<td>SCBT</td>
			<td>sc-257959</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sebacic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>283258-250G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sharp ended scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>28301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile Milli-Q water</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD Broth</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>242810</td>
			<td>YPD agar component</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo assay to study candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal tract

गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल (जीआई) पथ में कैंडिडा एल्बिकान हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस को विभिन्न पर्यावरणीय संकेतों द्वारा कसकर नियंत्रित किया जाता है, और इस अवसरवादी कवक रोगजनक के प्रसार और रोगजनकता में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। हालांकि, वीवो में जीआई ट्रैक्ट में फंगल हाइफा की कल्पना करने के तरीके चुनौतीपूर्ण हैं जो इस मॉर्फोजेनेसिस प्रक्रिया को नियंत्रित करने में पर्यावरणीय संकेतों की समझ को सीमित करते हैं। यहां वर्णित प्रोटोकॉल आंत समरूप अर्क में हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस के दृश्य के लिए एक उपन्यास पूर्व वीवो विधि को दर्शाता है। एक पूर्व वीवो परख का उपयोग करना, इस अध्ययन से पता चलता है कि एंटीबायोटिक इलाज चूहों से cecal सामग्री, लेकिन अनुपचारित नियंत्रण चूहों से नहीं, आंत सामग्री में सी एल्बिकान हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस को बढ़ावा देने । इसके अलावा, एंटीबायोटिक-इलाज चूहों से सीकल सामग्री के लिए आंत मेटाबोलाइट्स के विशिष्ट समूहों को जोड़ने से हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस पूर्व वीवो को नियंत्रित करता है। एक साथ लिया गया, यह प्रोटोकॉल जीआई ट्रैक्ट में सी एल्बिकन हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस को नियंत्रित करने वाले पर्यावरणीय संकेतों की पहचान करने और जांच करने के लिए एक उपन्यास विधि का प्रतिनिधित्व करता है।

थंगामानी प्रयोगशाला60 से पिछले निष्कर्षों के साथ इन परिणामों से संकेत मिलता है कि जब सी एल्बिकान पेट, छोटी आंतों और अनुपचारित नियंत्रण और एंटीबायोटिक उपचारित चूहों की बड़ी आंतों से लिए गए ?...

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An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

इस अध्ययन में आंत समरूप अर्क और इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग का उपयोग करके वर्णित पूर्व वीवो परख जीआई पथ में कैंडिडा एल्बिकान के हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस की जांच करने के लिए एक उपन्यास विधि का प्रतिनिधित्व करती है। इस विधि का उपयोग आंत में मॉर्फोजेनेटिक संक्रमण को विनियमित करने वाले पर्यावरणीय संकेतों की जांच करने के लिए किया जा सकता है।

गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट में कैंडिडा एल्बिकान हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए एक पूर्व वीवो परख

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

इस वीडियो में प्रदर्शित प्रोटोकॉल हमें फंगल हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस पर आंत मेटाबोलाइट्स की भूमिका को समझने की अनुमति देता है। यह पूर्व वीवो तकनीक कमोबेश फंगल हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस का अध्ययन करने के लिए आंत के निकटतम सन्निकटन को इस तरह से दोहराती है कि कोई इन विट्रो अध्ययन दोहरा नहीं सकता है। इस विधि को अन्य आंत्रप्रेन्योर पर आंत मेटाबोलाइट्स की भूमिका का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है।ऑटोक्लेवेड निष्फल तेज-समाप्त कैंची और संदंश का उपयोग करके चूहों को विच्छेदन करें। इच्छामृत्यु के बाद, पेट को बेनकाब करने के लिए सभी अंगों को पिन करके जानवर को विच्छेदन सतह पर सुरक्षित करें। बलदंश, कैंची, या आंत वर्गों के लिए चिपके हुए से फर को रोकने के लिए 70% इथेनॉल के साथ पेट क्षेत्र स्प्रे।चुटकी और पेट के आधार पर त्वचा के एक वर्ग उठाने के लिए संदंश का प्रयोग करें और त्वचा और अंतर्निहित प्रावरणी के माध्यम से एक छोटा सा चीरा बनाने के लिए सीकम या आंतों की दीवार पंचर से बचने के लिए देखभाल कर रही है । इस कटौती को आंशिक रूप से पेरिटोनियल गुहा को उजागर करने के लिए बढ़ाएं, फिर दोनों तरफ प्रारंभिक चीरा के बिंदु पर शुरू करने और ऊपर और बाद में विस्तार करने के लिए एक कटौती करें। इन फ्लैप्स को बाद में खींचें और पेरिटोनियल गुहा को पूरी तरह से बेनकाब करने के लिए उन्हें विच्छेदन सतह पर पिन करें।पेट से बेहतर कटौती करने के लिए और बड़ी आंत के डिस्टल क्षेत्र में आंत सामग्री की सबसे बड़ी मात्रा का संग्रह सुनिश्चित करने के लिए कैंची का उपयोग करते समय संदंश के साथ जीआई पथ निकालें। जीआई ट्रैक्ट को हटाते समय, व्यक्तिगत घटकों को टूटने से बचने का ध्यान रखें। पेट, छोटी आंत, सीकम और बड़ी आंत को उनके समीपस्थ और डिस्टल सिरों पर अलग करें।प्रत्येक खंड से आंत सामग्री के संग्रह के लिए, डिस्टल अंत में एक ही चीरा बनाएं, फिर मैन्युअल रूप से आंत की सामग्री को 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में संदंश के साथ निष्कासित करें। पूर्व वीवो परख के लिए नमूनों को शून्य से 80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। एक YPD आगर प्लेट पर C.albicans SC5314 की एक ताजा संस्कृति लकीर और यह 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर इनक्यूबेट ।अगले दिन, दो या तीन मध्यम आकार की व्यक्तिगत कॉलोनियों को चुनें और उन्हें पीबीएस के एक मिलीलीटर में फिर से खर्च करें। फ्रीजर से जमे हुए आंत सामग्री को पुनः प्राप्त करें और उन्हें 25 डिग्री सेल्सियस पर गल लें। एक नई 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में आंत सामग्री के लगभग 150 मिलीग्राम स्थानांतरित करें और उन्हें पीबीएस के 150 माइक्रोलीटर के साथ फिर से खर्च करें।भंवर आंत सामग्री को समरूप बनाने के लिए 30 सेकंड के लिए उच्च गति पर नमूना और यह लगभग एक मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठने के लिए अनुमति देते हैं । तीन मिनट के लिए 1, 000 बार जी पर समरूपता अपकेंद्रित्र, तो किसी भी मलबे हस्तांतरण नहीं करने के लिए ध्यान रखते हुए एक नई १.५ मिलीलीटर ट्यूब के लिए supernatant हस्तांतरण । अपकेंद्रित्र को दोहराने के बाद, सी एल्बिकान इनोकुलम के 10 माइक्रोलीटर को सुपरनैंट में जोड़ें, अच्छी तरह से मिलाएं, और नमूना को चार से पांच घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।C.albicans पर बहिर्जात मेटाबोलाइट्स के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए, आंत सामग्री और पीबीएस मिश्रण में मेटाबोलाइट्स की वांछित एकाग्रता जोड़ें, फिर 30 सेकंड के लिए उच्च गति से नमूना भंवर, यह 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठते हैं, और अपकेंद्रित्र और टीका के रूप में पहले वर्णित प्रदर्शन करते हैं । दो मिनट के लिए 1, 000 बार जी पर कवक सेल संस्कृति को अपकेंद्रित्र करें और सुपरनेट को त्यागें। 2% पीएफए के 100 माइक्रोलीटर में नमूनों को 15 मिनट के लिए ठीक करें, फिर अपकेंद्री दोहराएं और सुपरनेट को त्यागें।पांडुलिपि निर्देशों के अनुसार पीबीएस के एक मिलीलीटर के साथ दो बार नमूनों को धोएं, फिर 30 मिनट के लिए पॉलीक्लोनल सी एल्बिकान एंटीबॉडी के साथ पीबीएस के १०० माइक्रोलीटर में कमरे के तापमान पर नमूनों को इनक्यूबेट करें । इनक्यूबेशन के बाद, फोटोब्लैचिंग से बचने के लिए मंद प्रकाश में काम करते हुए पीबीएस के साथ तीन बार और नमूना धोएं। एक अंधेरे कमरे में, पीबीएस के 100 माइक्रोलीटर में 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर नमूनों को इनक्यूबेट करें जिसमें एंटी-रैबिट आईजीजी एलेक्सा फ्लोर 488 एंटीबॉडी एक से 500 कमजोर पड़ने पर होता है।पीबीएस के एक मिलीलीटर के साथ तीन बार नमूना धोने के बाद, इसे पीबीएस के 100 माइक्रोलीटर में फिर से खर्च करें और इमेजिंग के लिए इसे 96-अच्छी प्लेट में स्थानांतरित करें। 20X और 40X उद्देश्य लेंस और एक हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन फिल्टर का उपयोग कर एक फ्लोरेसेंस इमेजिंग माइक्रोस्कोप के साथ कवक कोशिकाओं छवि । जब C.albicans पेट, छोटी आंतों और अनुपचारित नियंत्रण और एंटीबायोटिक इलाज चूहों की बड़ी आंतों से लिया आंत समरूप अर्क में पूर्व वीवो हो जाता है, यह आम तौर पर एक खमीर आकृति विज्ञान के साथ विकसित करता है ।हालांकि, जब एंटीबायोटिक-इलाज चूहों से सीकल निकालने में उगाया जाता है, तो सी एल्बिकन आसानी से मॉर्मोजेनेसिस से गुजरता है जिसके परिणामस्वरूप खमीर और हाइफेट रूप होते हैं। यह इंगित करता है कि एंटीबायोटिक उपचार सीकल वातावरण में परिवर्तन का कारण बनता है, जो सी एल्बिकान के हाइफाल मॉर्फोजेनेसिस को प्रेरित करता है। एंटीबायोटिक-इलाज चूहों के सेकल समरूप में ग्लूकोज के एक्सोजेनस इसके अलावा एक बड़े पैमाने पर हाइफल विकास पूर्व वीवो दिखाया गया।इन परिणामों से पता चलता है कि एंटीबायोटिक-इलाज चूहों के सीकल समरूप में वापस आंत मेटाबोलाइट्स के अलावा अलग सी एल्बिकान के मॉर्फोजेनेसिस को नियंत्रित करता है। इस प्रोटोकॉल का प्रयास करते समय, ध्यान रखें कि आंत सामग्री के कमजोर पड़ने का अनुकूलन मलबे के संग्रह के बिना आंत मेटाबोलाइट्स का पर्याप्त संग्रह सुनिश्चित करता है। दो से एक मीडिया-टू-आंत सामग्री कमजोर पड़ने से अधिक न करें और यदि संभव हो तो कम कमजोर पड़ने का लक्ष्य रखें।इस तकनीक का उपयोग अब यह पता लगाने के लिए किया जा रहा है कि आंत प्रभाव हाइफाल विकास में विशिष्ट मेटाबोलाइट्स कैसे होते हैं, जिससे शोधकर्ताओं को फंगल रोगजनकों पर आंत मेटाबोलाइट्स की भूमिका को बेहतर ढंग से समझने की अनुमति देता है।

Research

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