Name: an ex vivo assay to study candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal tract
Uploaded: 2020-07-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract at JoVE.com

Gli autori riconoscono le risorse e il supporto della midwest University Cellular and Molecular Core Research facility.

Tutti i protocolli sugli animali sono stati approvati dal Midwestern University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) come descritto primadel 57. Il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Midwest University ha approvato questo studio nell'ambito del protocollo MWU IACUC #2894. Le politiche di assistenza agli animali del MWU seguono la politica del Servizio sanitario pubblico (PHS) sulla cura e l'uso umano degli animali da laboratorio e le politiche stabilite n...

Il metodo qui descritto presenta un nuovo modo per indagare l'effetto degli impatti antibiotici, dietetici, xenobiotici e terapeutici sulla morfogenesi ifale di C. albicans nel tratto GASTROINTESTINALe. Poiché la maggior parte delle infezioni sistemiche proviene dal trattogastrointestinale 21,22,23,24,25,26,</s...

Candida albicans è un patogeno fungino opportunistico e polimorfico che normalmente è commensale, ma può subire un cambiamento morfologico in una forma virulento in grado di causare infezioni potenzialmente letali in individui immunocompromati1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. C. albicans è una delle principali cause di infezioni nosocomiali sistemiche, con un tasso di mortalità del 40\u201260% anche con trattamento antimicotico2,14,15. Sebbene C. albicans risieda in diverse nicchie ospiti tra cui il sistema riproduttivofemminile 16,17, la cavità orale di individuisani 18 e il tratto gastrointestinale (GI)19,20, la maggior parte delle infezioni sistemiche provengono dal tratto GASTROINTESTINALe e inoltre, la fonte dell'infezione sistemica è spesso confermata come il trattoGASTROINTESTINAL 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. C. la patogenicità degli albicani nel tratto gastrointestinale è influenzata da un'ampia gamma di fattori; tuttavia, una delle principali caratteristiche necessarie per la virulenza è il passaggio da una morfologia cellulare di lievito a una morfologia virulento delle cellule ifali35,36,37,38,39,40,41,42,43,44. C. l'attaccamento e la diffusione degli albicani dal tratto gastrointestinale durante l'infezione è altamente associato alla sua capacità di passare da un lievito commensale in ife virulenti, consentendo ai funghi di causare malattie invasive44,45,46,47,48,49,50,51,52,53.
Una varietà di fattori nell'intestino, tra cui n-acetilglucosamina, regolano la formazione ifale di C. albicans. Pertanto, è fondamentale ridurre il divario di conoscenza per quanto riguarda la morfogenesi ifale di questo agente patogeno fungino nel trattoGASTROINTESTINAL 54,55,56. Recenti prove indicano che vari metaboliti intestinali controllano in modo differenziato la morfogenesi ifale di C. albicans in vitro57,58,59,60. Tuttavia, i vincoli tecnici presentano problemi quando si tenta di studiare la formazione di ife di C. albicans in campioni intestinali in vivo, in particolare la colorazione di lieviti e cellule ife e l'analisi quantitativa dello sviluppo ifale. Per comprendere la morfogenesi ifobia di C. albicans nel tratto GASTROINTESTINAL, è stato sviluppato un metodo ex vivo utilizzando estratti solubili di contenuto intestinale omogeneizzato dai topi per studiare l'effetto dei metaboliti sulla morfogenesi ifossica fungina. Utilizzando campioni intestinali di topi resistenti e suscettibili all'infezione da GI C. albicans, questo metodo aiuterà a identificare e studiare l'effetto di metaboliti, antibiotici e xenobiotici sulla morfogenesi ifossica fungina nel tratto GASTROINTESTINALe.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 - 10 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-454</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 - 1000 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-400</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 - 200 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-451</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutyric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>193070-25G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen (Fisher)</td>
			<td>A11008</td>
			<td>IF Staining secondary ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td>YPD agar component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Imaging Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZX700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Candida Albicans Antibody</td>
			<td>Invitrogen (Fisher)</td>
			<td>PA1-27158</td>
			<td>IF Staining primary ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cefoperazone</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>16113</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deoxycholic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30960</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-500</td>
			<td>hyphal-promoting compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lactic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAAL13242-06</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lithocholic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6250-10G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>palmitic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5585-10G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td>IF Staining fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS), 10x</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62692</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-tolylacetic acid</td>
			<td>SCBT</td>
			<td>sc-257959</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sebacic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>283258-250G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sharp ended scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>28301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile Milli-Q water</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD Broth</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>242810</td>
			<td>YPD agar component</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo assay to study candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal tract

La morfogenesi ifobica candida albicans nel tratto gastrointestinale (IG) è strettamente controllata da vari segnali ambientali e svolge un ruolo importante nella diffusione e nella patogenesi di questo patogeno fungino opportunistico. Tuttavia, i metodi per visualizzare l'ife fungina nel tratto GASTROINTESTINAL in vivo sono impegnativi che limita la comprensione dei segnali ambientali nel controllo di questo processo di morfogenesi. Il protocollo qui descritto dimostra un nuovo metodo ex vivo per la visualizzazione della morfogenesi ifale negli estratti di omogenato intestinale. Utilizzando un saggio ex vivo, questo studio dimostra che il contenuto di cecal da topi trattati con antibiotici, ma non da topi di controllo non trattati, promuove la morfogenesi ifale C. albicans nel contenuto intestinale. Inoltre, l'aggiunta di gruppi specifici di metaboliti intestinali al contenuto di cecal da topi trattati con antibiotici regola in modo differenziato la morfogenesi ifogenesi ex vivo. Nel complesso, questo protocollo rappresenta un nuovo metodo per identificare e indagare i segnali ambientali che controllano la morfogenesi ifale di C. albicans nel tratto GASTROINTESTINALe.

Questi risultati, insieme ai precedenti risultati del laboratorio Thangamani60, indicano che quando C. albicans viene coltivato ex vivo in estratti di omogenato intestinale prelevati dallo stomaco, dall'intestino tenue e dall'intestino crasso di controllo non trattato e topi trattati con antibiotici, C. albicans si sviluppa generalmente con una morfologia del lievito(figura 1B). Tuttavia, se coltivato nell'estratto cecale di topi trattati con antibio...

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An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Il saggio ex vivo descritto in questo studio utilizzando estratti di omogenato intestinale e colorazione ad immunofluorescenza rappresenta un nuovo metodo per esaminare la morfogenesi iftale degli albicani Candida nel tratto GASTROINTESTINALe. Questo metodo può essere utilizzato per indagare i segnali ambientali che regolano la transizione morfogenetica nell'intestino.

Un saggio ex vivo per studiare Candida albicans Morphogenesi ifale nel tratto gastrointestinale

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Il protocollo dimostrato in questo video ci permette di comprendere il ruolo dei metaboliti intestinali sulla morfogenesi ifogenesi fungina. Questa tecnica ex vivo è più o meno l'approssimazione più vicina dell'intestino per lo studio della morfogenesi ifossica fungina in un modo che nessuno studio in vitro può replicare. Questo metodo può essere applicato per studiare il ruolo dei metaboliti intestinali su altri agenti patogeni enterici.Sezionare topi usando forbici e forcep sterilizzate sterilizzate autoclavate. Dopo l'eutanasia, fissare l'animale a una superficie di dissezione inchiodando tutti gli arti per esporre l'addome. Spruzzare la regione addominale con il 70% di etanolo per evitare che la pelliccia si attacchi a forcep, forbici o sezioni intestinali.Utilizzare pini per pizzicare e sollevare una sezione di pelle alla base dell'addome e creare una piccola incisione attraverso la pelle e la fascia sottostante facendo attenzione a evitare di forare il cieco o la parete intestinale. Estendere questo taglio alla gabbia toracica esponendo parzialmente la cavità peritoneale, quindi effettuare un taglio a partire dal punto dell'incisione iniziale su entrambi i lati e estendendosi verso l'alto e lateralmente. Tirare questi lembi lateralmente e fissarli alla superficie di sezionazione per esporre completamente la cavità peritoneale.Estrarre il tratto GI con le forcep mentre si usano le forbici per effettuare tagli superiori allo stomaco e nella regione distale dell'intestino crasso per garantire la raccolta della massima quantità di contenuto intestinale. Quando si rimuove il tratto GI, fare attenzione a evitare di rupturing i singoli componenti. Separare lo stomaco, l'intestino tenue, il cieco e l'intestino crasso alle estremità prossimali e distali.Per la raccolta del contenuto intestinale da ogni sezione, effettuare una singola incisione all'estremità distale, quindi espellere manualmente il contenuto intestinale in un tubo microcentrifugo da 1,5 millilitri con forcep. Conservare i campioni a meno 80 gradi Celsius per i test ex vivo. Striare una nuova coltura di C.albicans SC5314 su una piastra di agar YPD e incubarla durante la notte a 30 gradi Celsius.Il giorno successivo, scegli due o tre colonie individuali di medie dimensioni e sospendile in un millilitro di PBS. Recuperare il contenuto intestinale congelato dal congelatore e scongelarli a 25 gradi Celsius. Trasferire circa 150 milligrammi di contenuto intestinale in un nuovo tubo da 1,5 millilitri e riprendarli con 150 microlitri di PBS.Vortice il campione ad alta velocità per 30 secondi per omogeneizzare il contenuto intestinale e permettergli di sedersi a temperatura ambiente per circa un minuto. Centrifugare gli omogenei a 1.000 volte G per tre minuti, quindi trasferire il supernatante in un nuovo tubo da 1,5 millilitri facendo attenzione a non trasferire detriti. Dopo aver ripetuto la centrifugazione, aggiungere 10 microlitri dell'inoculo C.albicans al supernatante, mescolare bene e incubare il campione a 37 gradi Celsius per quattro o cinque ore.Per testare l'effetto dei metaboliti esogeni sui C.albicans, aggiungere la concentrazione desiderata di metaboliti al contenuto intestinale e alla miscela PBS, quindi vortice il campione ad alta velocità per 30 secondi, lasciarlo riposare a temperatura ambiente per 10 minuti ed eseguire centrifugazione e inoculazione come descritto in precedenza. Centrifugare la coltura cellulare fungina a 1.000 volte G per due minuti e scartare il supernatante. Fissare i campioni in 100 microlitri del 2%PFA per 15 minuti, quindi ripetere la centrifugazione e scartare il supernatante.Lavare i campioni due volte con un millilitro di PBS secondo le indicazioni manoscritte, quindi incubare i campioni a temperatura ambiente in 100 microlitri di PBS con anticorpo policlonale C.albicans per 30 minuti. Dopo l'incubazione, lavare il campione altre tre volte con PBS, lavorando in condizioni di scarsa illuminazione per evitare il fotobleaching. In una stanza buia, incubare i campioni a temperatura ambiente per 15 minuti in 100 microlitri di PBS contenenti anticorpo anti-coniglio IgG Alexa Fluor 488 a una diluizione da uno a 500.Dopo aver lavato il campione tre volte con un millilitro di PBS, riprendarlo in 100 microlitri di PBS e trasferirlo su una piastra da 96 pozzetti per l'imaging. Immagine delle cellule fungine con un microscopio per immagini a fluorescenza utilizzando lenti obiettivo 20X e 40X e un filtro proteico fluorescente verde. Quando i C.albicans vengono coltivati ex vivo in estratti di omogenato intestinale prelevati dallo stomaco, dall'intestino tenue e dall'intestino crasso di topi non trattati e trattati con antibiotici, si sviluppa generalmente con una morfologia del lievito.Tuttavia, se coltivato nell'estratto cecale da topi trattati con antibiotici, il C.albicans subisce prontamente la morfogenesi con conseguente lievito e forme di ife. Ciò indica che il trattamento antibiotico causa cambiamenti nell'ambiente cecale, che inducono morfogenesi ifale di C.Albicans. L'aggiunta esogena di glucosio all'omogeneato cecale dei topi trattati con antibiotici ha mostrato un massiccio sviluppo iphal ex vivo.Questi risultati suggeriscono che l'aggiunta di metaboliti intestinali all'omogeneato cecale dei topi trattati con antibiotici regola in modo differenziato la morfogenesi dei C.albicans. Quando si tenta questo protocollo, tenere presente che l'ottimizzazione della diluizione del contenuto intestinale garantisce una raccolta sufficiente di metaboliti intestinali senza raccolta di detriti. Non superare una diluizione del contenuto media-intestino due a uno e mirare a una diluizione inferiore, se possibile.Questa tecnica viene utilizzata ora per esplorare come metaboliti specifici nello sviluppo dell'intestino imparti, consentendo ai ricercatori di comprendere meglio il ruolo dei metaboliti intestinali sulla patogenesi fungina.

Research

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Immunology and Infection

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