Name: an ex vivo assay to study candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal tract
Uploaded: 2020-07-01T14:30:00
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저자는 미드웨스턴 대학 세포 및 분자 코어 연구 시설에서 자원과 지원을 인정합니다.

모든 동물 프로토콜은57이전에 설명된 바와 같이 중서부 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었다. 미드웨스턴 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회는 MWU IACUC 프로토콜 #2894 따라이 연구를 승인했습니다. MWU 동물 관리 정책은 실험실 동물의 인도적 관리 및 사용에 대한 공중 보건 서비스 (PHS) 정책과 동물 복지법 (AWA)에 명시된 정책을 따릅니다.
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여기에서 기술된 방법은 기관에 있는 C. albicans 최면 형태발생에 대한 항생제, 규정식, xenobiotic 및 치료 충격의 효력을 조사하는 새로운 방법을 제시합니다. 전신 감염의 대부분은 기관21,22,23,24,25,26,27,</su...

칸디다 알비칸스는 일반적으로 기만적이지만 면역 절인 개인1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12, 12, 12에서생명을 위협하는 감염을 유발할 수 있는 악성 형태로 형태학적 변화를 겪을 수 있습니다. C. 알비칸은 항진균 치료2,14,15에서도40\u201260% 사망률을 가진 전신 외장 감염의 주요 원인이다. C. albicans는 여성 생식시스템(16,17)및 건강한 개인의구강(18)과 위장관(GI)19,20,전신 감염의 대부분을 기관에서 유래하는 등 상이한 숙주 틈새에 거주하고 있지만, 또한, 전신 감염의 근원은 종종 GI요로 확인된다21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32, 33,34. C. 기관의 알비칸 병원성은 광범위한 요인에 의해 영향을 받습니다. 그러나, 독성에 필요한 주요 특징은 효모 세포 형태에서 악성 최음세포형태(35,36,37,38,39,40,41,42, 43,44)로의 전환이다. C. 알비칸스 감염 시 기관으로부터의 부착 및 보급은 기막 효모에서 악성 최면으로 전환하는 능력과 매우 관련이 있어 곰팡이가 침습적 질환44,45,47,48,49,50,51,52,53을유발할 수 있다.
n-아세틸글루코사민을 포함한 창자에 있는 다양한 요인은 C. albicans에의하여 최면 형성을 조절합니다. 따라서, 기관54,55,56에서이 곰팡이 병원균의 최면 형태발생에 관한 지식의 격차를 좁히는 것이 중요하다. 최근 증거에 따르면 다양한 장 대사산물이 체외57,58,59,60에서 C. 알비칸의 최면 형태 발생을 차별화적으로 제어한다는 것을 나타낸다. 그러나, 기술적 제약은 생체 내 의 자궁 내의 C. 알비칸최면 형성, 특히 염색 효모 및 최면 세포 및 최면 발달의 정량적 분석을 연구하려고 할 때 문제를 제시한다. 기관에서 C. 알비칸스 최면 형태발생을 이해하기 위해, 전 생체 내 방법은 균질 최면 형태발생에 대한 대사산물의 효과를 연구하기 위해 마우스로부터 균질화 된 장 함량의 용용 추출물을 사용하여 개발되었다. C. albicans GI 감염에 저항하고 영향을 받기 쉬운 마우스에서 창자 견본을 이용하는, 이 방법은 GI 관에 있는 곰팡이 최면 형태발생에 대사 산물, 항생제 및 xenobiotics의 효력을 확인하고 공부하는 것을 도울 것입니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 - 10 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-454</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 - 1000 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-400</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 - 200 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-451</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutyric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>193070-25G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen (Fisher)</td>
			<td>A11008</td>
			<td>IF Staining secondary ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td>YPD agar component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Imaging Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZX700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Candida Albicans Antibody</td>
			<td>Invitrogen (Fisher)</td>
			<td>PA1-27158</td>
			<td>IF Staining primary ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cefoperazone</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>16113</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deoxycholic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30960</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-500</td>
			<td>hyphal-promoting compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lactic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAAL13242-06</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lithocholic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6250-10G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>palmitic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5585-10G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td>IF Staining fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS), 10x</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62692</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-tolylacetic acid</td>
			<td>SCBT</td>
			<td>sc-257959</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sebacic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>283258-250G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sharp ended scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>28301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile Milli-Q water</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD Broth</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>242810</td>
			<td>YPD agar component</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo assay to study candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal tract

위장(GI) 관내 칸디다 알비칸스 최면 형태발생은 다양한 환경 신호에 의해 엄격하게 제어되며, 이 기회성 곰팡이 병원균의 보급 및 병원성 발생에 중요한 역할을 한다. 그러나, 생체 내 기관에서 곰팡이 최해를 시각화하는 방법은 이러한 형태 발생 과정을 제어하는 환경 신호의 이해를 제한하는 도전적이다. 여기에 설명된 프로토콜은 장 동형 추출물에서 최면 형태 발생의 시각화를 위한 새로운 ex vivo 방법을 보여줍니다. 전 생체 분석기를 사용하여, 이 연구는 항생제 처리된 마우스에게서 cecal 내용이, 그러나 처리되지 않은 대조마우스에서, 창자 내용에서 C. albicans 최면 형태발생을 승진시키는 것을 보여줍니다. 또한, 항생제 처리된 마우스로부터 세칼 내용물의 특정 군을 다시 첨가하면 자궁 내형성 전 생체내를 분화한다. 종합하면, 이 프로토콜은 기관에서 C. albicans 최면 형태발생을 제어하는 환경 신호를 식별하고 조사하는 새로운 방법을 나타냅니다.

이러한 결과는 탄가마니실험실(60)의 이전 연구 결과와 함께 C. 알비칸이 위장에서 가져온 장용 균질 추출물에서 전 생체을 재배할 때, 치료되지 않은 대조군 및 항생제 처리 마우스의 소장 및 대형 장, C. 알비칸스는 일반적으로 효모 형태학(도1B)으로개발된다는 것을 나타낸다. 그러나, 항생제 처리된 마우스에서 세칼 추출물에서 재배될 때, <em...

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An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

이 연구에서 기장 균질 추출물과 면역형광 스테인링을 사용하여 기술된 전 생체 분석법은 기관에서 칸디다 알비칸스의 최면 형태 발생을 검사하는 새로운 방법을 나타낸다. 이 방법은 창자에 있는 형태유전학 전이를 통제하는 환경 신호를 조사하기 위하여 이용될 수 있습니다.

칸디다 알비칸스 위장관에서 최면 모포 발생을 연구하는 Ex vivo 분석

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

이 비디오에서 입증 된 프로토콜은 곰팡이 최면 형태 발생에 대한 장 대사 산물의 역할을 이해할 수 있게합니다. 이 전 생체 내 기술은 체외 연구가 복제할 수 없는 방식으로 곰팡이 최면 형태 발생을 연구하기 위한 장의 가장 가까운 근사치를 더 많거나 적게 합니다. 이 방법은 다른 장내 병원체에 장 대사 산물의 역할을 연구하기 위해 적용 될 수있다.자동 살균 된 날카로운 말단 가위와 집게를 사용하여 마우스를 해부합니다. 안락사 후, 복부를 노출하기 위해 모든 사지를 고정하여 해부 표면에 동물을 고정. 모피가 집게, 가위 또는 창자 섹션에 달라붙지 않도록 70%에탄올로 복부 부위를 분사하십시오.집게를 사용하여 복부 의 바닥에 피부 의 한 부분을 꼬집고 들어 올리고 피부와 근본적인 근막을 통해 작은 절개를 만들어 cecum 또는 장 벽을 뚫지 않도록주의하십시오. 복막 구멍을 부분적으로 노출 흉곽에이 컷을 확장 한 다음 양쪽에 초기 절개 지점에서 시작하여 위쪽과 측면으로 확장 절단합니다. 이 플랩을 측면으로 당기고 해부 표면에 고정하여 복막 구멍을 완전히 노출시합니다.가위를 사용하여 위와 대장의 탈경 부위에서 절단을 보다 우수하게 만드는 동안 위스포프로 위관을 추출하여 가장 많은 양의 장 함량을 수집합니다. 기관을 제거할 때는 개별 구성 요소의 파열을 피하십시오. 위장, 소장, cecum 및 큰 내장을 근위와 탈구 끝에서 분리합니다.각 섹션에서 창자 내용물의 수집을 위해, 단상 끝에 단일 절개를 한 다음 수동으로 집게와 1.5 밀리리터 미세 센티스 리퍼지 튜브로 장 내침을 추방. 샘플을 영하 80도에서 저장하여 전 생체 내 에세이를 보관하십시오. C.albicans SC5314의 신선한 문화를 YPD 한천 접시에 적시고 섭씨 30도에서 하룻밤 동안 배양하십시오.다음 날, 2~3개의 중간 크기의 개별 식민지를 선택하고 PBS의 1밀리리터로 재보설한다. 냉동고에서 냉동 용기 내용을 검색하고 섭씨 25도에서 해동하십시오. 약 150밀리그램의 장내 함량을 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮기고 150마이크로리터의 PBS로 재보선다.30초 동안 고속으로 샘플을 소용돌이쳐 내장 함량을 균질화하고 실온에서 약 1분 동안 앉을 수 있도록 합니다. 원심분리기는 3분 동안 1, 000회 G에서 균질화한 다음, 상체관을 새로운 1.5 밀리리터 튜브로 옮기어 파편을 옮기지 않도록 주의합니다. 원심분리를 반복한 후, C.albicans 접종의 10 마이크로리터를 상체에 넣고 잘 섞고 샘플을 섭씨 37도에서 4~5시간 동안 배양합니다.C.albicans에 외인성 대사 산물의 효과를 테스트하기 위해, 창자 함량 및 PBS 혼합물에 대사 산물의 원하는 농도를 추가한 다음 30 초 동안 고속으로 샘플을 소용돌이시키고, 10 분 동안 실온에 앉아서 원심 분리 및 접종을 수행하십시오. 곰팡이 세포 배양을 1, 000회 G에서 2분 동안 원심세포 배양을 원심분리하고 상퍼를 폐기한다. 15분 동안 2%PFA의 100마이크로리터로 샘플을 수정한 다음 원심분리를 반복하고 상신자를 폐기합니다.원고 방향에 따라 PBS의 1 밀리리터로 샘플을 두 번 세척한 다음, 폴리클론 C.albicans 항체를 사용하여 PBS의 100 마이크로리터에서 실온에서 샘플을 배양합니다. 인큐베이션 후 PBS로 샘플을 세 번 더 세척하여 광표백을 피하기 위해 희미한 빛으로 작업합니다. 어두운 방에서, 1 ~ 500 희석에 안티 토끼 IgG 알렉사 플루오 488 항체를 포함하는 PBS의 100 마이크로 리터에서 실온에서 샘플을 배양.PBS의 1 밀리리터로 샘플을 세 번 세척한 후, PBS의 100 마이크로리터로 샘플을 다시 중단하고 이미징을 위해 96웰 플레이트로 옮기습니다. 20X 및 40X 객관적렌즈와 녹색 형광단백질 필터를 사용하여 형광 이미징 현미경으로 곰팡이 세포를 이미지화합니다. C.albicans가 위장, 소장 및 치료되지 않은 대조군 및 항생제 치료 마우스의 큰 장에서 가져온 장 균질 추출물에서 전 생체 균증이 재배되면 일반적으로 효모 형태로 개발됩니다.그러나, 항생제 처리된 마우스에서 세칼 추출물에서 재배될 때, C.albicans는 효모와 최해 형태의 결과로 쉽게 형태 발생을 겪는다. 이것은 항생제 처리가 C.Albicans의 최면 형태 발생을 유도하는 cecal 환경에 있는 변경을 일으키는 원인이 된다는 것을 표시합니다. 항생제 처리된 마우스의 세포 균질에 포도당의 외인성 첨가는 대규모 최면 발달 ex vivo를 보였다.이러한 결과는 항생제 처리된 마우스의 세포 균주에 다시 창자 대사산물의 추가가 C.albicans의 형태발생을 차별화적으로 조절한다는 것을 건의합니다. 이 프로토콜을 시도할 때, 장 내 내용의 희석을 최적화하면 잔해 수집없이 장 대사 산물을 충분히 수집할 수 있습니다. 2대 1 미디어-투-용기 콘텐츠 희석을 초과하지 말고 가능하면 희석을 낮추도록 목표로 하십시오.이 기술은 어떻게 창 자 충격 하이픈 개발에 특정 대사 산물 을 탐구 하기 위해 지금 사용 되 고, 연구원 더 나은 곰 팡이 병 신에 창 자 대사 산물의 역할을 이해할 수 있도록.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

굿 - 트로픽 T 세포의 마이 그 레이션을 공부 경쟁력 호밍 Assays

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

연구

면역학 및 감염병학

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

의 RNA 격리 녹농균 Murine 위장관을 Colonizing

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

설립<em&gt; 체외</em&gt; 시스템의 세포 내 행동을 연구하는<em&gt; 칸디다 글라 브라</em&gt; 인간 THP-1 식세포에

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

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미생물 커뮤니티를 공부<em&gt; 생체</em&gt; 사이에 호스트 매개 상호 작용의 모델<em&gt; 칸디다 알비 칸스</em&gt; 및<em&gt; 녹농균</em&gt; 항공에

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

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Candida albicans 자동 미세 장치를 사용 하 여에서 Biofilm 형성의 시각화

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

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Bursal 전염병 바이러스 병 인을 공부 하는 Ex Vivo 닭 기본 Bursal 세포 배양 모델

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

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규제 Candida albicans Biofilm 성장에 붉은 빛으로 매일 광선 요법

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

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시투 혼성화에서 형광을 사용하여 뮤린 위장에서 칸디다 알비칸스의 시각화

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

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칸디다 알비칸스 바이오필름 의 명확화 및 이미징

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

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로즈 벵골 매개 광역학 치료 칸 디다 알비칸을 억제하기 위해

Invasive Candida albicans infection is a significant opportunistic fungal infection in humans because it is one of the most common colonizers of the gut, ...