Name: an ex vivo assay to study candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal tract
Uploaded: 2020-07-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract at JoVE.com

Forfatterne anerkjenner ressurser og støtte fra Midwestern University Cellular and Molecular Core Research anlegget.

Alle dyreprotokoller ble godkjent av Midwestern University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) som beskrevet før57. Institutional Animal Care and Use Committee ved Midwestern University godkjente denne studien under MWU IACUC Protocol #2894. MWU-retningslinjene for dyrepleie følger Folkehelsetjenestens (PHS) retningslinjer for human omsorg og bruk av laboratoriedyr og retningslinjene i dyrevelferdsloven (AWA).
1. Mus studie standard protokoll
<ol><li...

Metoden som er beskrevet her presenterer en ny måte å undersøke effekten av antibiotika, kosttilskudd, xenobiotiske og terapeutiske virkninger på C. albicans bindestrekmorfogenese i GI-kanalen. Siden flertallet av systemiske infeksjoner stammer fra GI tract21,22,23,24,25,26,27<s...

Candida albicans er en opportunistisk, polymorf sopppatogen som normalt er commensal, men kan gjennomgå en morfologisk endring i en virulent form som er i stand til å forårsake livstruende infeksjoner hos immunkompromitterte individer1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. C. albicans er en ledende årsak til systemiske nosocomial infeksjoner, med en 40 \\ u201260% dødelighet selv med antifungal behandling2,14,15. Selv om C. albicans bor i forskjellige vertsnisjemer, inkludert det kvinnelige reproduktivesystemet 16,17,munnhulen til friskeindivider 18 og mage-tarmkanalen (GI)19,20, stammer flertallet av de systemiske infeksjonene fra GI-kanalen og videre, kilden til systemisk infeksjon er ofte bekreftet å være GI tract21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. C. albicans patogenitet i GI-kanalen påvirkes av et bredt spekter av faktorer; Men en viktig egenskap som er nødvendig for virulens er overgangen fra en gjær celle morfologi til en virulent bindestrekcelle morfologi35,36,37,38,39,40,41,42,43,44. C. albicans vedlegg og spredning fra GI-kanalen under infeksjon er svært forbundet med sin evne til å gå fra en commensal gjær til virulent hyphae, slik at soppene kan forårsake invasiv sykdom44,45,46,47,48,49,50,51,52,53.
En rekke faktorer i tarmen, inkludert n-acetylglucosamine, regulerer bindestrekdannelse av C. albicans. Derfor er det avgjørende å begrense kunnskapsgapet om bindestrekmorfogenesen til dette sopppatogenet iGI-kanalen 54,55,56. Nyere bevis indikerer at ulike tarmmetabolitter differensialt kontrollerer bindestrekmorfogenesen til C. albicans in vitro57,58,59,60. Tekniske begrensninger gir imidlertid problemer når man forsøker å studere C. albicans-hyfaedannelse i in vivo-tarmprøver, spesielt farging av gjær- og bindestrekceller og kvantitativ analyse av bindestrekutvikling. For å forstå C. albicans bindestrekmorfogenese i GI-kanalen, ble en ex vivo-metode utviklet ved hjelp av løselige ekstrakter av homogenisert tarminnhold fra mus for å studere effekten av metabolitter på soppgefokal morfogenese. Ved hjelp av tarmprøver fra mus som er resistente og utsatt for C. albicans GI-infeksjon, vil denne metoden bidra til å identifisere og studere effekten av metabolitter, antibiotika og xenobiotika på sopp bindestrekmorfogenese i GI-kanalen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 - 10 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-454</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 - 1000 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-400</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 - 200 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-451</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutyric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>193070-25G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen (Fisher)</td>
			<td>A11008</td>
			<td>IF Staining secondary ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td>YPD agar component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Imaging Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZX700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Candida Albicans Antibody</td>
			<td>Invitrogen (Fisher)</td>
			<td>PA1-27158</td>
			<td>IF Staining primary ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cefoperazone</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>16113</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deoxycholic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30960</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-500</td>
			<td>hyphal-promoting compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lactic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAAL13242-06</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lithocholic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6250-10G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>palmitic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5585-10G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td>IF Staining fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS), 10x</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62692</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-tolylacetic acid</td>
			<td>SCBT</td>
			<td>sc-257959</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sebacic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>283258-250G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sharp ended scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>28301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile Milli-Q water</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD Broth</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>242810</td>
			<td>YPD agar component</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo assay to study candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal tract

Candida albicans bindestrekmorfogenese i mage-tarmkanalen (GI) er tett kontrollert av ulike miljøsignaler, og spiller en viktig rolle i formidling og patogenese av dette opportunistiske sopppatogenet. Metoder for å visualisere sopphyphae i GI-kanalen in vivo er imidlertid utfordrende, noe som begrenser forståelsen av miljøsignaler for å kontrollere denne morfogeneseprosessen. Protokollen beskrevet her demonstrerer en ny ex vivo metode for visualisering av bindestrekmorfogenese i tarm homogenate ekstrakter. Ved hjelp av en ex vivo analyse viser denne studien at cecal innhold fra antibiotikabehandlede mus, men ikke fra ubehandlede kontrollmus, fremmer C. albicans bindestrekmorfogenese i tarminnholdet. Videre, legge tilbake bestemte grupper av tarm metabolitter til cecal innholdet fra antibiotika-behandlet mus differensialt regulerer bindestrek morfogenese ex vivo. Samlet representerer denne protokollen en ny metode for å identifisere og undersøke miljøsignalene som styrer C. albicans bindestrekmorfogenese i GI-kanalen.

Disse resultatene sammen med tidligere funn fra Thangamani-laboratoriet60 indikerer at når C. albicans dyrkes ex vivo i tarmhomogenate ekstrakter tatt fra magen, tynntarmen og tykktarmen av ubehandlet kontroll og antibiotikabehandlede mus, utvikler C. albicans vanligvis med gjærmorfologi (figur 1B). Men når dyrket i cecal ekstrakt fra antibiotikabehandlede mus, C. albicans gjennomgår lett morfogenese, noe som resulterer i prøver som inn...

Watch this Scientific Journal Video about An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract at JoVE.com

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Ex vivo analysen beskrevet i denne studien ved hjelp av tarm homogenate ekstrakter og immunofluorescence farging representerer en ny metode for å undersøke bindestrekmorfogenese av Candida albicans i GI-kanalen. Denne metoden kan benyttes til å undersøke miljøsignalene som regulerer morfogenetisk overgang i tarmen.

En Ex vivo analyse for å studere Candida albicans bindestrek morfogenese i mage-tarmkanalen

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Protokollen demonstrert i denne videoen tillater oss å forstå rollen som tarm metabolitter på sopp bindestrek morfogenese. Denne ex vivo teknikken mer eller mindre den nærmeste tilnærming av tarmen for å studere sopp bindestrek morfogene på en måte som ingen in vitro studie kan replikere. Denne metoden kan brukes til å studere rollen som tarmmetabolitter på andre enteriske patogener.Dissekere mus ved hjelp av autoklavert sterilisert skarp-end saks og tang. Etter eutanasi, fest dyret til en disseksjonsoverflate ved å feste alle lemmer for å eksponere magen. Spray bukregionen med 70% etanol for å hindre pels fra å holde seg til tang, saks eller tarmseksjoner.Bruk tang til å klemme og løfte en del av huden ved foten av magen og skape et lite snitt gjennom huden og underliggende fascia tar vare for å unngå punktering av cecum eller tarmveggen. Utvid dette kuttet til brystkassen delvis utsette peritoneal hulrom, deretter gjøre et kutt starter på punktet av det første snittet på hver side og strekker seg oppover og lateralt. Trekk disse klaffene sidealt og fest dem til disseksjonsoverflaten for å fullstendig eksponere bukhulen.Trekk ut GI-kanalen med tang mens du bruker saks for å gjøre kutt bedre enn magen og i den distale delen av tykktarmen for å sikre innsamling av størst mengde tarminnhold. Når du fjerner GI-kanalen, må du være forsiktig for å unngå rupturing av de enkelte komponentene. Skill mage, tynntarm, cecum og tykktarmen i deres proksimale og distale ender.For innsamling av tarminnhold fra hver seksjon, gjør et enkelt snitt på den distale enden, og fjern deretter tarminnholdet manuelt til et 1,5 milliliter mikrocentrifugerør med tang. Oppbevar prøvene ved minus 80 grader Celsius for ex vivo-analyser. Strek en frisk kultur av C.albicans SC5314 på en YPD agar plate og inkubere den over natten på 30 grader Celsius.På neste dag velger du to eller tre mellomstore individuelle kolonier og bruker dem på nytt i ett milliliter PBS. Hent frossen tarminnhold fra fryseren og tin dem ved 25 grader Celsius. Overfør ca. 150 milligram tarminnhold til et nytt 1,5 milliliter rør og gjenoppliv dem med 150 mikroliter PBS.Vortex prøven ved høy hastighet i 30 sekunder for å homogenisere tarminnholdet og la den sitte ved romtemperatur i omtrent et minutt. Sentrifuge homogenatene ved 1000 ganger G i tre minutter, og overfør deretter supernatanten til et nytt 1,5 milliliter rør som tar vare på å ikke overføre rusk. Etter å ha gjentatt sentrifugeringen, tilsett 10 mikroliter av C.albicans inokuleum til det supernatante, bland godt og inkuber prøven ved 37 grader Celsius i fire til fem timer.For å teste effekten av eksogene metabolitter på C.albicans, tilsett ønsket konsentrasjon av metabolitter til tarminnholdet og PBS-blandingen, og virvle deretter prøven ved høy hastighet i 30 sekunder, la den sitte ved romtemperatur i 10 minutter, og utfør sentrifugering og inokulasjon som tidligere beskrevet. Sentrifuger soppcellekulturen ved 1000 ganger G i to minutter og kast supernatanten. Fiks prøvene i 100 mikroliter på 2% PFA i 15 minutter, gjenta deretter sentrifugeringen og kast supernatanten.Vask prøvene to ganger med en milliliter PBS i henhold til manuskriptretninger, og inkuber deretter prøvene ved romtemperatur i 100 mikroliter PBS med polyklonale C.albicans antistoff i 30 minutter. Etter inkubasjonen vasker du prøven tre ganger til med PBS, arbeider i svakt lys for å unngå fotografering. I et mørkt rom inkuber prøvene ved romtemperatur i 15 minutter i 100 mikroliter PBS som inneholder antikanin IgG Alexa Fluor 488 antistoff ved en 1 til 500 fortynning.Etter å ha vasket prøven tre ganger med en milliliter PBS, gjenbruker du den i 100 mikroliter PBS og overfører den til en 96-brønns plate for bildebehandling. Bilde soppcellene med fluorescensavbildningsmikroskop ved hjelp av 20X og 40X objektive linser og et grønt fluorescerende proteinfilter. Når C.albicans dyrkes ex vivo i tarm homogenate ekstrakter tatt fra magen, tynntarmen og tykktarmen av ubehandlet kontroll og antibiotikabehandlede mus, utvikler det seg vanligvis med en gjærmorfologi.Men når dyrket i cecal ekstrakt fra antibiotikabehandlede mus, gjennomgår C.albicans lett morfogenese som resulterer i gjær og hyphaeformer. Dette indikerer at antibiotikabehandling forårsaker endringer i cecal miljøet, som induserer bindestrekmorfogenese av C.Albicans. Eksogene tillegg av glukose til cecal homogenate av antibiotikabehandlede mus viste en massiv bindestrek utvikling ex vivo.Disse resultatene tyder på at tilsetning av tarmmetabolitter tilbake til cecal homogenate av antibiotika-behandlet mus differensial regulerer morfogenesen av C.albicans. Når du prøver denne protokollen, Husk at optimalisering av fortynning av tarminnholdet sikrer tilstrekkelig innsamling av tarmmetabolitter uten innsamling av rusk. Ikke overskrid en to-til-en media-til-tarm-innholdsfortynning og sikt på en lavere fortynning hvis mulig.Denne teknikken brukes nå til å utforske hvordan spesifikke metabolitter i tarmpåvirkningsstreken, slik at forskerne bedre kan forstå rollen som tarmmetabolitter på sopppatogenese.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studere mikrobielle samfunn<em&gt; I Vivo</em&gt;: En modell av Host-mediert samhandling mellom<em&gt; Candida albicans</em&gt; Og<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualisering av Biofilm formasjon i Candida albicans bruker en automatisert Microfluidic enhet

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

En Ex Vivo kylling primære Bursal-celle kultur modell å studere Bursal infeksjonssykdommer Virus patogenesen

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Daglig fototerapi med rødt lys Regulate Candida albicans Biofilm vekst

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualisering av Candida albicans i murine mage-tarmkanalen ved hjelp av fluorescerende in situ hybridisering

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Avklare og imaging Candida albicans Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

Rose Bengal-mediert fotodynamisk terapi for å hemme Candida albicans

Invasive Candida albicans infection is a significant opportunistic fungal infection in humans because it is one of the most common colonizers of the gut, ...