Name: an ex vivo assay to study candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal tract
Uploaded: 2020-07-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract at JoVE.com

Авторы признают ресурсы и поддержку со стороны Среднего Запада университета сотовых и молекулярных основных научно-исследовательских объектов.

Все протоколы животных были одобрены Midwestern University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), как описано до57. Институциональный комитет по уходу за животными и использованию в Среднем Западе университета одобрил это исследование в соответствии с протоколом MWU IACUC #2894. Политика MWU по уходу...

Метод, описанный здесь представляет собой новый способ исследовать влияние антибиотиков, диетических, ксенобиотических и терапевтических воздействий на C. Albicans hyphal морфогенез в желудочно-кишечном тракте. Поскольку большинство системных инфекций происходятиз желудочно...

Candida albicans является оппортунистическим, полиморфным грибковым патогеном, который обычно commensal, но может пройти морфологические изменения в вирулентной форме, способной вызвать опасные для жизниинфекции у людей с ослабленным иммунитетом 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. C. albicans является ведущей причиной системных нозокомиальных инфекций, с 40-201260% смертности даже при противогрибковомлечении 2,14,15. Хотя C. albicans проживает в различных нишах хозяина включаяженскую репродуктивную систему 16,17, устную полостьздоровых индивидуалов 18 и желудочно-кишечный тракт (GI)тракта 19,20, большинство системных инфекций возникают от тракта GI и более того, Источником системной инфекции часто подтверждаетсяжелудочно-кишечный тракт 21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. C. микробиканы патогенности в желудочно-кишечном тракте зависит от широкого спектра факторов; Однако главной характеристикой, необходимой для вирулентности, является переход от морфологии дрожжевых клеток к вирулентной морфологиигипхал-клеток 35,36, 37,38, 39,40,41,42,43,44. C. Albicans крепления и распространения из желудочно-кишечного тракта во время инфекции тесно связано с его способностью к переходу от commensal дрожжей в вирулентной гифы, чтопозволяет грибам вызывать инвазивные заболевания 44,45,46,47,48,49,50,51,52,53.
Разнообразие факторов в кишечнике, в том числе n-acetylglucosamine, регулируют образование гифаля C. albicans. Поэтому крайне важно сократить пробел в знаниях относительно гипхал-морфогенеза этого грибкового патогена в желудочно-кишечномтракте 54,55,56. Последние данные свидетельствуют отом,что различные метаболиты кишечника дифференциально контролируют гипхалморфогенез C. Albicans in vitro57,58,59,60. Тем не менее, технические ограничения представляют проблемы при попытке изучения C. Albicans гифы формирования в образцах кишечника in vivo, особенно окрашивания дрожжей и клеток гифы и количественного анализа развития гипхала. Чтобы понять гипахал-морфогенез C. albicans в желудочно-кишечном тракте, был разработан метод ex vivo с использованием растворимых экстрактов гомогенизированного содержимого кишечника у мышей для изучения влияния метаболитов на грибковый гипхалморфез. Используя образцы кишечника у мышей, которые устойчивы и восприимчивы к инфекции C. Albicans GI, этот метод поможет определить и изучить влияние метаболитов, антибиотиков и ксенобиотиков на грибковый гипахал морфогенез в желудочно-кишечном тракте.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 - 10 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-454</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 - 1000 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-400</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 - 200 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-451</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutyric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>193070-25G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen (Fisher)</td>
			<td>A11008</td>
			<td>IF Staining secondary ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td>YPD agar component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Imaging Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZX700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Candida Albicans Antibody</td>
			<td>Invitrogen (Fisher)</td>
			<td>PA1-27158</td>
			<td>IF Staining primary ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cefoperazone</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>16113</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deoxycholic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30960</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-500</td>
			<td>hyphal-promoting compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lactic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAAL13242-06</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lithocholic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6250-10G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>palmitic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5585-10G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td>IF Staining fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS), 10x</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62692</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-tolylacetic acid</td>
			<td>SCBT</td>
			<td>sc-257959</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sebacic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>283258-250G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sharp ended scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>28301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile Milli-Q water</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD Broth</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>242810</td>
			<td>YPD agar component</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo assay to study candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal tract

Candida albicans hyphal morphogenesis в желудочно-кишечном тракте (ГИ) жестко контролируется различными экологическими сигналами, и играет важную роль в распространении и патогенезе этого оппортунистического грибкового патогена. Тем не менее, методы визуализации грибковых гиф в желудочно-кишечном тракте in vivo являются сложными, что ограничивает понимание экологических сигналов в контроле этого процесса морфогенеза. Описанный здесь протокол демонстрирует новый метод ex vivo для визуализации гипхал-морфогенеза в экстрактах гомогената кишечника. Используя анализ ex vivo, это изучение демонстрирует что cecal содержание от антибиотика обработанных мышей, но не от untreated мышей управления, повысить C. albicans гипхальный морфогенез в содержании кишки. Кроме того, добавление назад конкретных групп метаболитов кишечника к содержимому cecal от антибиотико-обработанных мышей дифференциально регулирует гипхальный морфогенез ex vivo. Взятые вместе, этот протокол представляет собой новый метод для выявления и исследования экологических сигналов, которые контролируют C. Albicans гифаль морфогенез в желудочно-кишечном тракте.

Эти результаты наряду с предыдущими выводами из лаборатории Thangamani60 показывают, что, когда C. albicans выращивается ex vivo в кишечнике гомогенатных экстрактов, взятых из желудка, тонкого кишечника и толстой кишки необработанных контроля и антибиотиков обработанных мышей, C...

Watch this Scientific Journal Video about An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract at JoVE.com

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Ex vivo анализ, описанный в этом исследовании с использованием экстрактов гомогената кишечника и иммунофторесценции окрашивания представляет собой новый метод для изучения гипхал морфогенез Candida albicans в желудочно-кишечном тракте. Этот метод может быть использован для исследования экологических сигналов, регулирующих морфогенетический переход в кишечнике.

Ex vivo Assay для изучения Candida Albicans Hyphal Morphogenesis в желудочно-кишечном тракте

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Протокол, продемонстрированый в этом видео, позволяет понять роль метаболитов кишечника в грибковом гипхал-морфогенезе. Этот метод ex vivo более или менее ближайшее приближение кишечника для изучения грибкового гипального морфогенеза таким образом, что ни одно исследование in vitro не может повторить. Этот метод может быть применен для изучения роли метаболитов кишечника на других кишечных патогенов.Вскрывать мышей с помощью автоклавных стерилизованных ножниц и типсов. После эвтаназии, закрелите животное на поверхности вскрытия, прижав все конечности, чтобы разоблачить живот. Спрей брюшной области с 70% этанола, чтобы предотвратить меха от прилипания к тибры, ножницы, или кишечника разделов.Используйте щипц, чтобы ущипнуть и поднять участок кожи у основания живота и создать небольшой разрез через кожу и основные фасции заботиться, чтобы избежать прокола cecum или кишечной стенки. Продлите этот разрез до грудной клетки, частично обнажая брюшную полость, затем сделайте разрез, начиная с точки первоначального разреза с обеих сторон и расширяя вверх и боково. Потяните эти закрылки боковой и приколоть их к поверхности вскрытия, чтобы полностью разоблачить брюшной полости.Извлекайте желудочно-кишечный тракт с помощью ножниц, чтобы сделать порезы выше желудка и в дистальной области толстой кишки, чтобы обеспечить сбор наибольшего количества содержимого кишечника. При удалении желудочно-кишечного тракта, позаботьтесь, чтобы избежать разрыва отдельных компонентов. Отделять желудок, тонкий кишечник, cecum, и толстой кишки на проксимальных и дистальных концах.Для сбора содержимого кишечника из каждого раздела, сделать один разрез на дистальной конце, а затем вручную изгнать содержимое кишечника в 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки с типсами. Храните образцы при температуре минус 80 градусов по Цельсию для анализа ex vivo. Streak свежей культуры C.albicans SC5314 на YPD агар пластины и инкубировать его на ночь при 30 градусов по Цельсию.На следующий день, выбрать два или три средних отдельных колоний и повторно использовать их в один миллилитр PBS. Извлеките замороженное содержимое кишечника из морозильной камеры и оттайте их при 25 градусах Цельсия. Перенесите около 150 миллиграммов содержимого кишечника в новую 1,5 миллилитровую трубку и повторно посовелите их 150 микролитров PBS.Vortex образца на высокой скорости в течение 30 секунд, чтобы гомогенизировать содержимое кишечника и позволить ему сидеть при комнатной температуре около минуты. Центрифуга гомогенатов на 1000 раз G в течение трех минут, а затем передать супернатант в новую трубку 1,5 миллилитров заботы, чтобы не передавать мусор. После повторения центрифуги добавьте 10 микролитров инокулума C.albicans в супернатант, хорошо перемешайте и инкубировать образец при 37 градусах по Цельсию в течение четырех-пяти часов.Чтобы проверить влияние экзогенных метаболитов на C.albicans, добавьте желаемую концентрацию метаболитов в содержание кишечника и смеси PBS, затем вихрь образца на высокой скорости в течение 30 секунд, дайте ему сидеть при комнатной температуре в течение 10 минут, и выполнять центрифугации и прививки, как описано ранее. Центрифуга грибковой клеточной культуры на 1000 раз G в течение двух минут и отказаться от супернатанта. Зафиксировать образцы в 100 микролитров 2%PFA в течение 15 минут, затем повторить центрифугации и отказаться от супернатанта.Вымойте образцы дважды одним миллилитром PBS в соответствии с рукописными указаниями, затем инкубировать образцы при комнатной температуре в 100 микролитров PBS с поликлональным антителом C.albicans в течение 30 минут. После инкубации, мыть образец еще три раза с PBS, работая в тусклом свете, чтобы избежать фотоотливания. В темной комнате, инкубировать образцы при комнатной температуре в течение 15 минут в 100 микролитров PBS, содержащих анти-кролик IgG Alexa Fluor 488 антитела на один до 500 разбавления.После мытья образца три раза с одним миллилитров PBS, повторно использовать его в 100 микролитров PBS и передать его на 96-хорошо пластины для визуализации. Изображение грибковых клеток с помощью флуоресцентного микроскопа с использованием объективных линз 20X и 40X и зеленого флуоресцентного белкового фильтра. Когда C.albicans выращивается ex vivo в экстрактах гомогената кишечника, взятых из желудка, тонкого кишечника и толстой кишки необработанных контроля и обработанных антибиотиками мышей, он обычно развивается с дрожжами морфологии.Однако, когда выращивается в экстракте cecal от антибиотиков обработанных мышей, C.albicans легко проходит морфогенез в результате дрожжей и гифы формы. Это указывает на то, что лечение антибиотиками вызывает изменения в cecal окружающей среды, которые вызывают гипхальный морфогенез C.Albicans. Экзогенное добавление глюкозы в цикальный гомогенат обработанных антибиотиками мышей показало массивное развитие гифаля ex vivo.Эти результаты показывают, что добавление метаболитов кишечника обратно в цикал гомогенат антибиотико-обработанных мышей дифференциально регулирует морфогенез C.albicans. При попытке этого протокола, имейте в виду, что оптимизация разбавления содержимого кишечника обеспечивает достаточный сбор метаболитов кишечника без сбора мусора. Не превышать два к одному медиа-кишки содержание разбавления и стремиться к более низкой разбавления, если это возможно.Этот метод в настоящее время используется для изучения того, как конкретные метаболиты в кишечнике влияние гипхал развития, что позволяет исследователям лучше понять роль метаболитов кишечника на грибковый патогенез.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Конкурентные Homing Анализы по изучению тропических Гут-Т-клеток миграции

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

РНК Выделение Синегнойной палочки Колонизация мышей Желудочно-кишечный тракт

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Создание<em&gt; В пробирке</em&gt; Система по изучению внутриклеточных Поведение<em&gt; Candida glabrata</em&gt; В человека ТНР-1 макрофагов

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Изучение микробных сообществ<em&gt; В Vivo</em&gt;: Модель узла опосредованного взаимодействия между<em&gt; Candida Albicans</em&gt; И<em&gt; Синегнойной палочки</em&gt; В Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Визуализация биопленки в Candida albicans с помощью автоматизированных Microfluidic устройства

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Ex Vivo курица первичной Bursal клеточной культуры модель для изучения патогенеза вирус инфекционного Bursal

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Ежедневные фототерапии с красный свет для регулирования Candida albicans биопленки роста

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Визуализация Candida Albicans в Желудочно-кишечном тракте Мурина с использованием флуоресцентных в ситу гибридизации

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Уточнение и изображение Candida Альбиканс Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

Роза Бенгал-Опосредованная Фотодинамическая Терапия для ингибирования Candida albicans

Invasive Candida albicans infection is a significant opportunistic fungal infection in humans because it is one of the most common colonizers of the gut, ...