Name: an ex vivo assay to study candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal tract
Uploaded: 2020-07-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract at JoVE.com

Los autores reconocen los recursos y el apoyo de la central de investigación de núcleos celulares y moleculares de la Universidad del Medio Oeste.

Todos los protocolos de animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad del Medio Oeste (IACUC) como se describió antesdel 57. El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad del Medio Oeste aprobó este estudio bajo el Protocolo MWU IACUC #2894. Las políticas de cuidado animal de MWU siguen la Política del Servicio de Salud Pública (PHS) sobre cuidado y uso humano de animales de laboratorio y las políticas establec...

El método descrito aquí presenta una forma novedosa de investigar el efecto de los impactos antibiótico, dietético, xenobiótico y terapéutico en la morfogénesis hiphal de C. albicans en el tracto gastrointestinal. Dado que la mayoría de las infecciones sistémicas se originan en el tracto gastrointestinal21,22,23,24,25,<sup class="x...

Candida albicans es un patógeno fúngico oportunista y polimórfico que normalmente es commensal, pero puede sufrir un cambio morfológico en una forma virulenta capaz de causar infecciones potencialmente mortales en individuos inmunocomprometidos1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. C. albicans es una de las principales causas de infecciones nosocomiales sistémicas, con una tasa de mortalidad de 40-u201260% incluso con tratamiento antifúngico2,14,15. Aunque C. albicans reside en diferentes nichos de acogida, incluido el sistema reproductivo femenino16,17, la cavidad oral de individuos sanos18 y el tracto gastrointestinal (GI)19,20, la mayoría de las infecciones sistémicas se originan en el tracto gastrointestinal y, además, la fuente de infección sistémica se confirma a menudo como el tracto gastrointestinal21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. C. patogenicidad albicans en el tracto gastrointestinal está influenciado por una amplia gama de factores; sin embargo, una característica importante necesaria para la virulencia es la transición de una morfología celular de levadura a una morfología celular hiphal virulenta35,36,37,38,39,40,41,42,43,44. C. El apego y la difusión de los hongos del tracto gastrointestinal durante la infección está altamente asociado con su capacidad de transición de una levadura commensal a hifas virulentas, permitiendo que los hongos causen enfermedades invasivas44,45,46,47,48,49,50,51,52,53.
Una variedad de factores en el intestino, incluyendo n-acetilglucosamina, regular la formación de hiphal por C. albicans. Por lo tanto, es crucial reducir la brecha en el conocimiento con respecto a la morfogénesis hifal de este patógeno fúngico en el tracto gastrointestinal54,55,56. La evidencia reciente indica que varios metabolitos intestinales controlan diferencialmente la morfogénesis hifral de C. albicans in vitro57,58,59,60. Sin embargo, las limitaciones técnicas presentan problemas al intentar estudiar la formación de las hifas de C. albicans en muestras intestinales in vivo, especialmente la tinción de células de levadura e hifas y el análisis cuantitativo del desarrollo hiphal. Para entender la morfogénesis hifrética de C. albicans en el tracto gastrointestinal, se desarrolló un método ex vivo utilizando extractos solubles de contenido intestinal homogeneizado de ratones para estudiar el efecto de los metabolitos en la morfogénesis hipófológica fúngica. Utilizando muestras intestinales de ratones que son resistentes y susceptibles a la infección por C. albicans GI, este método ayudará a identificar y estudiar el efecto de metabolitos, antibióticos y xenobióticos en la morfogénesis hipófológica fúngica en el tracto gastrointestinal.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 - 10 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-454</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 - 1000 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-400</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 - 200 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-451</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutyric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>193070-25G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen (Fisher)</td>
			<td>A11008</td>
			<td>IF Staining secondary ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td>YPD agar component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Imaging Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZX700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Candida Albicans Antibody</td>
			<td>Invitrogen (Fisher)</td>
			<td>PA1-27158</td>
			<td>IF Staining primary ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cefoperazone</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>16113</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deoxycholic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30960</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-500</td>
			<td>hyphal-promoting compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lactic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAAL13242-06</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lithocholic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6250-10G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>palmitic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5585-10G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td>IF Staining fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS), 10x</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62692</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-tolylacetic acid</td>
			<td>SCBT</td>
			<td>sc-257959</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sebacic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>283258-250G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sharp ended scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>28301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile Milli-Q water</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD Broth</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>242810</td>
			<td>YPD agar component</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo assay to study candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal tract

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) está estrechamente controlada por varias señales ambientales, y desempeña un papel importante en la difusión y patogénesis de este patógeno fúngico oportunista. Sin embargo, los métodos para visualizar las hifas fúngicas en el tracto gastrointestinal in vivo son desafiantes, lo que limita la comprensión de las señales ambientales en el control de este proceso de morfogénesis. El protocolo descrito aquí demuestra un novedoso método ex vivo para la visualización de la morfogénesis hifal en extractos de homogeneización intestinal. Utilizando un ensayo ex vivo, este estudio demuestra que el contenido de cecal de ratones tratados con antibióticos, pero no de ratones de control no tratados, promueven la morfogénesis hiphal de C. albicans en el contenido intestinal. Además, la adición de grupos específicos de metabolitos intestinales al contenido de cecal de ratones tratados con antibióticos regula diferencialmente la morfogénesis hifílo ex vivo. En conjunto, este protocolo representa un método novedoso para identificar e investigar las señales ambientales que controlan la morfogénesis hipófrica de C. albicans en el tracto gastrointestinal.

Estos resultados junto con los hallazgos anteriores del laboratorio Thangamani60 indican que cuando C. albicans se cultiva ex vivo en extractos de homogeneato intestinal tomados del estómago, intestino delgado e intestino grueso de control no tratado y ratones tratados con antibióticos, C. albicans generalmente se desarrolla con una morf levaduraología (Figura 1B). Sin embargo, cuando se cultiva en el extracto de cecal de ratones tratados con ...

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An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

El ensayo ex vivo descrito en este estudio utilizando extractos de homogeneización intestinal y tinción de inmunofluorescencia representa un método novedoso para examinar la morfogénesis hifágica de Candida albicans en el tracto gastrointestinal. Este método se puede utilizar para investigar las señales ambientales que regulan la transición morfogenética en el intestino.

Un ensayo ex vivo para estudiar Candida albicans Morphogenesis hifal en el tracto gastrointestinal

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

El protocolo demostrado en este vídeo nos permite comprender el papel de los metabolitos intestinales en la morfogénesis hipófística fúngica. Esta técnica ex vivo más o menos la aproximación más cercana del intestino para el estudio de la morfogénesis hipófal fúngica de una manera que ningún estudio in vitro puede replicar. Este método se puede aplicar para estudiar el papel de los metabolitos intestinales en otros patógenos entéricos.Disecciona ratones usando tijeras y fórceps esterilizados autoclavados. Después de la eutanasia, fije el animal a una superficie de disección fijando todas las extremidades para exponer el abdomen. Rocíe la región abdominal con 70% de etanol para evitar que el pelaje se pegue a los fórceps, tijeras o secciones intestinales.Utilice fórceps para pellizcar y levantar una sección de la piel en la base del abdomen y crear una pequeña incisión a través de la piel y la fascia subyacente teniendo cuidado para evitar perforar el cecum o la pared intestinal. Extienda este corte a la caja torácica exponiendo parcialmente la cavidad peritoneal, luego haga un corte comenzando en el punto de la incisión inicial a cada lado y extendiéndose hacia arriba y lateralmente. Tire de estas aletas lateralmente y anclelas a la superficie de disección para exponer completamente la cavidad peritoneal.Extraiga el tracto gastrointestinal con fórceps mientras usa tijeras para hacer cortes superiores al estómago y en la región distal del intestino grueso para asegurar la recolección de la mayor cantidad de contenido intestinal. Al retirar el tracto gastrointestinal, tenga cuidado de evitar la rotura de los componentes individuales. Separe el estómago, el intestino delgado, el cecum y el intestino grueso en sus extremos proximal y distal.Para la recolección de contenido intestinal de cada sección, haga una sola incisión en el extremo distal, luego expulse manualmente el contenido intestinal en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros con fórceps. Almacene las muestras a menos 80 grados centígrados para ensayos ex vivo. Raya un nuevo cultivo de C.albicans SC5314 en una placa de agar YPD e incuba durante la noche a 30 grados centígrados.Al día siguiente, escoge dos o tres colonias individuales de tamaño mediano y resuspendlas en un mililitro de PBS. Recupera el contenido de las tripas congeladas del congelador y descongela a 25 grados centígrados. Transfiera aproximadamente 150 miligramos de contenido intestinal a un nuevo tubo de 1,5 mililitros y resuspendándolos con 150 microlitros de PBS.Vórtice la muestra a alta velocidad durante 30 segundos para homogeneizar el contenido intestinal y permitir que se siente a temperatura ambiente durante aproximadamente un minuto. Centrifugar los homogeneiza a 1.000 veces G durante tres minutos, luego transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros teniendo cuidado de no transferir ningún escombro. Después de repetir la centrifugación, agregue 10 microlitros del C.albicans inoculum al sobrenadante, mezcle bien e incubar la muestra a 37 grados centígrados durante cuatro a cinco horas.Para probar el efecto de los metabolitos exógenos en C.albicans, añadir la concentración deseada de metabolitos al contenido intestinal y la mezcla de PBS, luego vórtice la muestra a alta velocidad durante 30 segundos, dejarla reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos, y realizar centrifugación e inoculación como se describió anteriormente. Centrifugar el cultivo de células fúngicas a 1.000 veces G durante dos minutos y deseche el sobrenadante. Fijar las muestras en 100 microlitros de 2%PFA durante 15 minutos, luego repetir la centrifugación y desechar el sobrenadante.Lave las muestras dos veces con un mililitro de PBS de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, luego incubar las muestras a temperatura ambiente en 100 microlitros de PBS con anticuerpo policlonal C.albicans durante 30 minutos. Después de la incubación, lave la muestra tres veces más con PBS, trabajando a poca luz para evitar el fotoblanquido. En una habitación oscura, incubar las muestras a temperatura ambiente durante 15 minutos en 100 microlitros de PBS que contienen anticuerpos anti-conejo IgG Alexa Fluor 488 en una dilución de uno a 500.Después de lavar la muestra tres veces con un mililitro de PBS, resuspendirlo en 100 microlitros de PBS y transferirlo a una placa de 96 pozos para la toma de imágenes. Imbrete las células fúngicas con un microscopio de imágenes de fluorescencia utilizando lentes objetivo 20X y 40X y un filtro de proteína fluorescente verde. Cuando C.albicans se cultiva ex vivo en extractos de homogeneato intestinal tomados del estómago, intestinos delgados e intestinos gruesos de control no tratado y ratones tratados con antibióticos, generalmente se desarrolla con una morfología de levadura.Sin embargo, Cuando se cultiva en el extracto de cefal de ratones tratados con antibióticos, C.albicans se somete fácilmente a morfogénesis que resulta en formas de levadura e hifas. Esto indica que el tratamiento con antibióticos causa cambios en el entorno cecal, que inducen morfogénesis hifífala de C.Albicans. La adición exógena de glucosa al homogeneato cecal de ratones tratados con antibióticos mostró un desarrollo bombo masivo ex vivo.Estos resultados sugieren que la adición de metabolitos intestinales al homogeneizado cecal de los ratones tratados con antibióticos regula diferencialmente la morfogénesis de C.albicans. Al intentar este protocolo, tenga en cuenta que la optimización de la dilución del contenido intestinal garantiza la recolección suficiente de metabolitos intestinales sin recolección de residuos. No exceda una dilución de contenido de dos a uno de medios a tripas y apunte a una dilución más baja si es posible.Esta técnica se utiliza ahora para explorar cómo metabolitos específicos en el desarrollo hifal de impacto intestinal, lo que permite a los investigadores comprender mejor el papel de los metabolitos intestinales en la patogénesis fúngica.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Los análisis competitivos de Homing para el Estudio de la tripa-trópico migración de células T

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

Investigación

Inmunología e Infección

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

El aislamiento de ARN Pseudomonas aeruginosa Que colonizan el tracto gastrointestinal murino

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establecimiento de un<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema para estudiar el comportamiento intracelular de<em&gt; Candida glabrata</em&gt; En humanos THP-1 macrófagos

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

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El estudio de las comunidades microbianas<em&gt; En Vivo</em&gt;: Un Modelo de anfitrión mediada por la interacción entre<em&gt; Candida Albicans</em&gt; Y<em&gt; Pseudomonas Aeruginosa</em&gt; En las vías respiratorias

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

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Visualización de la formación de Biofilm de Candida albicans utilizando un dispositivo microfluídico automatizado

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

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Un modelo de cultivo primario de células Bursal de pollo Ex Vivo para estudiar la patogenesia de la enfermedad Bursal infecciosa Virus

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

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Diario fototerapia con luz roja para regular crecimiento de Biofilm de Candida albicans

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualización de Candida albicans en el tracto gastrointestinal murino utilizando hibridación fluorescente in situ

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Aclaración e imagen de Candida albicans Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

Terapia fotodinámica mediada por rosa de Bengala para inhibir Candida albicans

Invasive Candida albicans infection is a significant opportunistic fungal infection in humans because it is one of the most common colonizers of the gut, ...