Name: an ex vivo assay to study candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal tract
Uploaded: 2020-07-01T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract at JoVE.com

Yazarlar, Midwestern Üniversitesi Hücresel ve Moleküler Çekirdek Araştırma tesisinin kaynaklarını ve desteğini kabul ediyor.

Tüm hayvan protokolleri Midwestern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından57önce açıklandığı gibi onaylanmıştır. Midwestern Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi, #2894 MWU IACUC Protokolü kapsamında bu çalışmayı onayladı. MWU hayvan bakım politikaları, Laboratuvar Hayvanlarının İnsani Bakımı ve Kullanımına Ilişkin Halk Sağlığı Hizmeti (PHS) Politikası'nı ve Hayvan Refahı Yasası'nda (AWA) belirtilen poli...

Burada açıklanan yöntem, antibiyotik, diyet, ksenobiyotik ve terapötik etkileri nin C. albicans hyphal morfogenezi üzerindeki etkisini araştırmak için yeni bir yol sunar GI sisteminde. Sistemik enfeksiyonların çoğunluğu GI sistemi kaynaklanan olduğundan21,22,23,24,25,26,27</s...

Candida albicans normalde kommensal bir fırsatçı, polimorfik mantar patojen, ancak bağışıklık tehlikeyebireylerdeyaşamı tehdit eden enfeksiyonlara neden yeteneğine sahip öldürücü bir forma morfolojik bir değişim geçirebilir 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13. C. albicans sistemik nosokomiyal enfeksiyonların önde gelen nedenidir, bir 40\u201260% mortalite oranı ile antifungal tedavi ile bile2,14,15. C. albicans kadın üreme sistemi16dahil olmak üzere farklı konak nişlerde ikamet rağmen16 ,17, sağlıklı bireylerin ağız boşluğu18 ve gastrointestinal (GI) yolu19,20, sistemik enfeksiyonların çoğunluğu GI sistemi ve dahası kaynaklanan, sistemik enfeksiyon kaynağı genellikle GI yolu olduğu doğrulanır21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. C. albicans patojenite GI yolu faktörlerin geniş bir yelpazede etkilenir; ancak, virülans için gerekli önemli bir özelliği öldürücü bir hiphal hücre morfolojisi içine bir maya hücre morfolojisi geçiş35,36,37,38,39,40,41,42,43,44. C. albicans eki ve enfeksiyon sırasında GI sisteminden yayılması son derece öldürücü hyphae içine bir commensal maya geçiş kapasitesi ile ilişkilidir, mantar invaziv hastalığa neden sağlayan44,45,46,47,48,49,50,51,52,53.
Bağırsakta çeşitli faktörler, n-asetilglucosamine dahil, C. albicanstarafından hiphal oluşumunu düzenleyen. Bu nedenle, GI sisteminde bu mantar patojeninin hiphal morfogenezi ile ilgili bilgi açığını daraltmak çok önemlidir54,55,56. Son kanıtlar çeşitli bağırsak metabolitlerinin farklı olarak C. albicans in vitro57,58,59,60hipofna morfogenezini kontrol ettiğini göstermektedir. Ancak, teknik kısıtlamalar in vivo gut örneklerinde C. albicans hyphae oluşumunu incelemeye çalışırken sorunlar mevcut, özellikle maya ve hyphae hücreleri boyama ve hyplal gelişimi kantitatif analizi. Gi sisteminde C. albicans hyphal morfogenezi anlamak için, bir ex vivo yöntemi mantar hyphal morfogenez üzerinde metabolitlerin etkisini incelemek için farelerden homojenize bağırsak içeriğinin çözünür özleri kullanılarak geliştirilmiştir. C. albicans GI enfeksiyonuna dirençli ve duyarlı farelerden alınan bağırsak örneklerini kullanan bu yöntem, metabolitlerin, antibiyotiklerin ve ksenobiyotiklerin GI sistemindeki mantar lı hiphal morfogenezi üzerindeki etkisini belirlemeye ve incelemeye yardımcı olacaktır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 - 10 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-454</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 - 1000 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-400</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 - 200 &#181;L Pipet Tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-451</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-methylbutyric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>193070-25G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 goat anti-rabbit IgG</td>
			<td>Invitrogen (Fisher)</td>
			<td>A11008</td>
			<td>IF Staining secondary ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP1423-500</td>
			<td>YPD agar component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated Imaging Microscope</td>
			<td>Keyence</td>
			<td>BZX700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Candida Albicans Antibody</td>
			<td>Invitrogen (Fisher)</td>
			<td>PA1-27158</td>
			<td>IF Staining primary ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cefoperazone</td>
			<td>Cayman</td>
			<td>16113</td>
			<td>antibiotic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>deoxycholic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>30960</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>D16-500</td>
			<td>hyphal-promoting compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>08-885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lactic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>AAAL13242-06</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lithocholic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L6250-10G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>palmitic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P5585-10G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A11313</td>
			<td>IF Staining fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS), 10x</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>J62692</td>
			<td>PBS component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>p-tolylacetic acid</td>
			<td>SCBT</td>
			<td>sc-257959</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sebacic acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>283258-250G</td>
			<td>hyphal-inhibitory compound</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sharp ended scissors</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>28301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile Milli-Q water</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Misc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>YPD Broth</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>242810</td>
			<td>YPD agar component</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo assay to study candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal tract

Candida albicans gastrointestinal hyphal morfogenez (GI) yolu sıkı çeşitli çevresel sinyaller tarafından kontrol edilir, ve bu fırsatçı mantar patojenin yayılması ve patogenezönemli önemli bir rol oynar. Ancak, in vivo GI sisteminde mantar hyphae görselleştirmek için yöntemler bu morfogenez sürecini kontrol çevresel sinyallerin anlaşılmasını sınırlar zordur. Burada açıklanan protokol, gut homojen özlerde hiphal morfogenezinin görselleştirilmesi için yeni bir ex vivo yöntemi göstermektedir. Bir ex vivo tsay kullanarak, Bu çalışma göstermiştir ki antibiyotik tedavi farelerden cecal içeriği, ancak tedavi edilmemiş kontrol fareler, bağırsak içeriğinde C. albicans hiphal morfogenezi teşvik. Ayrıca, antibiyotik tedavi farelerden sekal içeriğine bağırsak metabolitleri belirli gruplar geri ekleyerek farklı hiphal morfogenez ex vivo düzenler. Birlikte ele alındığında, bu protokol tanımlamak ve C. albicans hyphal morfogenez gi sisteminde kontrol çevresel sinyalleri araştırmak için yeni bir yöntem temsil eder.

Thangamani laboratuvarı60 önceki bulgular ile birlikte bu sonuçlar C. albicans mide, ince bağırsak ve tedavi edilmemiş kontrol ve antibiyotik tedavi farelerin kalın bağırsak alınan bağırsak homojenate özleri ex vivo yetiştirilen zaman, C. albicans genellikle bir maya morfolojisi ile gelişir göstermektedir(Şekil 1B). Ancak, antibiyotik le tedavi edilen farelerden sekal ekstresinde yetiştiğinde, C. albicans kolayca morfogene...

Watch this Scientific Journal Video about An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract at JoVE.com

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Gut homojen özler ve immünofloresan boyama kullanılarak bu çalışmada açıklanan ex vivo tsay GI sisteminde Candida albicans hiphal morfogenez incelemek için yeni bir yöntem temsil eder. Bu yöntem bağırsakta morfogenetik geçişi düzenleyen çevresel sinyalleri araştırmak için kullanılabilir.

Bir Ex vivo Assay Gastrointestinal Sistemde Candida albicans Hyphal Morphogenesis Çalışma

Candida albicans hyphal morphogenesis in the gastrointestinal (GI) tract is tightly controlled by various environmental signals, and plays an important ...

Bu videoda gösterilen protokol bize mantar hiphal morfogenez üzerinde bağırsak metabolitlerinin rolünü anlamak için izin verir. Bu ex vivo tekniği daha fazla veya daha az hiçbir in vitro çalışma çoğaltmak bir şekilde mantar hyphal morfogenez çalışması için bağırsak en yakın yaklaşım. Bu yöntem, bağırsak metabolitlerinin diğer enterik patojenler üzerindeki rolünü incelemek için uygulanabilir.Otoklavlı sterilize keskin uçlu makas ve forceps kullanarak fareleri inceleyin. Ötenaziden sonra, karın ortaya çıkarmak için tüm uzuvları sabitleyerek bir diseksiyon yüzeyine hayvan güvenli. Kürkün forceps, makas veya bağırsak bölümlerine yapışmasını önlemek için karın bölgesini %70 etanol püskürtün.Çimdik ve karın tabanında deri bir bölümünü kaldırmak ve ceum veya bağırsak duvarı delinme önlemek için dikkat ederek deri ve altta yatan fasya ile küçük bir kesi oluşturmak için forseps kullanın. Bu kesiği kısmen periton boşluğunu açığa çıkaran göğüs kafesine uzatın, sonra her iki taraftaki ilk kesi noktasından başlayarak yukarı ve yanal olarak uzanan bir kesik yapın. Bu kanatları yanal olarak çekin ve periton boşluğunu tamamen ortaya çıkarmak için diseksiyon yüzeyine sabitleyin.Bağırsak içeriğinin en büyük miktarda toplanmasını sağlamak için mide ve kalın bağırsağın distal bölgede kesim üstün hale makas kullanırken forceps ile GI yolu ayıklayın. GI yolu çıkarılırken, tek tek bileşenlerin yırtılmasını önlemeye dikkat edin. Onların proksimal ve distal uçlarında mide, ince bağırsak, çekum ve kalın bağırsak ayırın.Her bölümden bağırsak içeriğinin toplanması için, distal ucunda tek bir kesi yapmak, sonra el ile forseps ile 1.5 mililitremikrosantrifüj tüp içine bağırsak içeriğini dışarı atmak. Ex vivo tahlilleri için numuneleri eksi 80 santigrat derecede saklayın. Bir YPD agar plaka üzerine C.albicans SC5314 taze bir kültür Streak ve 30 santigrat derece gecede kuluçka.Ertesi gün, iki veya üç orta ölçekli bireysel koloniler seçin ve PBS bir mililitre onları yeniden askıya. Dondurucudan dondurulmuş bağırsak içeriğini alın ve 25 santigrat derecede eritin. Yaklaşık 150 miligram bağırsak içeriğini yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın ve 150 mikrolitre PBS ile yeniden askıya alın.İçgüdüiçeriğini homojenize etmek ve oda sıcaklığında yaklaşık bir dakika oturmasını sağlamak için numuneyi 30 saniye boyunca yüksek hızda girdaplayın. Homojenleri üç dakika boyunca 1,000 kez G'de santrifüj edin, sonra süpernatant'ı herhangi bir enkaz aktarmamaya özen terek yeni bir 1,5 mililitrelik tüpe aktarın. Santrifüj tekrarladıktan sonra, supernatant c.albicans inoculum 10 mikrolitre ekleyin, iyi karıştırın ve 4-5 saat boyunca 37 derece santigrat örnek kuluçka.C.albicans üzerinde eksojen metabolitlerin etkisini test etmek için, bağırsak içeriği ve PBS karışımı için metabolitlerin istenilen konsantrasyonu ekleyin, sonra yüksek hızda 30 saniye için örnek girdap, 10 dakika oda sıcaklığında oturup izin ve daha önce açıklandığı gibi santrifüj ve aşılama gerçekleştirin. Mantar hücre kültürünü 1,000 kez G'de iki dakika santrifüj edin ve süpernatant'ı atın. Numuneleri 15 dakika boyunca %2 PFA'nın 100 mikrolitresinde sabitleyin, ardından santrifüjü tekrarlayın ve süpernatant'ı atın.El yazması talimatlara göre bir mililitre PBS ile örnekleri iki kez yıkayın, ardından örnekleri oda sıcaklığında 100 mikrolitre PBS'de poliklonal C.albicans antikorile 30 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, fotobeyaztasyondan kaçınmak için loş ışıkta çalışarak numuneyi PBS ile üç kez daha yıkayın. Karanlık bir odada, 1-500 seyreltme anti-tavşan IgG Alexa Fluor 488 antikor içeren PBS 100 mikrolitre 15 dakika oda sıcaklığında örnekleri kuluçka.Numuneyi bir mililitre PBS ile üç kez yıkadıktan sonra, 100 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın ve görüntüleme için 96 kuyuluk bir plakaya aktarın. 20X ve 40X objektif lensler ve yeşil floresan protein filtresi kullanarak floresan görüntüleme mikroskobu ile mantar hücrelerini görüntüleyin. C.albicans mide, ince bağırsak ve tedavi edilmeyen kontrol ve antibiyotik tedavi farelerin kalın bağırsak alınan bağırsak homojenate özleri ex vivo büyüdü, genellikle bir maya morfolojisi ile gelişir.Ancak, antibiyotik tedavi farelerden cecal ekstresi yetiştirilen, C.albicans kolayca maya ve hyphae formları ile sonuçlanan morfogenez uğrar. Bu antibiyotik tedavisi cecal ortamda değişikliklere neden olduğunu gösterir, Hangi C.Albicans hiphal morfogenezi neden. Antibiyotik le tedavi edilen farelerin sekal homojenate glikoz eksojen eklenmesi büyük bir hiphal gelişimi ex vivo gösterdi.Bu sonuçlar, antibiyotik tedavisi görmüş farelerin sekal homojenate geri bağırsak metabolitlerinin eklenmesi farklı c.albicans morfogenezi düzenler öneririz. Bu protokolü denerken, bağırsak içeriğinin seyreltilmesinin optimizasyonunun enkaz toplamadan bağırsak metabolitlerinin yeterli şekilde toplanmasını sağladığını unutmayın. İkiye bir ortama-bağırsak içeriği seyreltme aşmayın ve mümkünse daha düşük bir seyreltme hedefleyin.Bu teknik şimdi bağırsaktaki spesifik metabolitlerin hiphal gelişimini nasıl etkilediğini araştırmak için kullanılmakta olup, araştırmacıların bağırsak metabolitlerinin mantar patogenezi üzerindeki rolünü daha iyi anlamalarını sağlar.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Ex vivo Assay to Study Candida albicans Hyphal Morphogenesis in the Gastrointestinal Tract

Competitive Homing Assays to Study Gut-tropic T Cell Migration

Gut-tropik T Hücre Göç Eğitim Rekabetçi Homing Tahliller

In order to exert their function lymphocytes need to leave the blood and migrate into different tissues in the body. Lymphocyte adhesion to endothelial ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

RNA İzolasyonu Pseudomonas aeruginosa Murin Gastrointestinal Yolu koloniler

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

Establishment of an In vitro System to Study Intracellular Behavior of Candida glabrata in Human THP-1 Macrophages

A cell culture model system, if a close mimic of host environmental conditions, can serve as an inexpensive, reproducible and easily manipulatable ...

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Studying Microbial Communities In Vivo: A Model of Host-mediated Interaction Between Candida Albicans and Pseudomonas Aeruginosa in the Airways

Mikrobiyal Toplulukları incelenmesi<em&gt; İn Vivo</em&gt;: Arası Ana aracılı Etkileşim Modeli<em&gt; Candida albicans</em&gt; Ve<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; Airways

Studying host-pathogen interaction enables us to understand the underlying mechanisms of the pathogenicity during microbial infection. The prognosis of ...

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Görselleştirme bir otomatik mikrosıvısal aygıtı kullanarak Candida albicans biyofilm oluşumu

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

An Ex Vivo Chicken Primary Bursal-cell Culture Model to Study Infectious Bursal Disease Virus Pathogenesis

Bursal bulaşıcı hastalık virüs patogenezi okumaya bir Ex Vivo tavuk birincil Bursal hücre kültürü modeli

Infectious bursal disease virus (IBDV) is a birnavirus of economic importance to the poultry industry. The virus infects B cells, causing morbidity, ...

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Daily Phototherapy with Red Light to Regulate Candida albicans Biofilm Growth

Kırmızı ışık düzenlemek Candida albicans biyofilm büyüme ile günlük fototerapi

Here, we present a protocol to assess the outcomes of per diem red light treatment on the growth of Candida albicans biofilm. To increase the planktonic ...

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Visualization of Candida albicans in the Murine Gastrointestinal Tract Using Fluorescent In Situ Hybridization

Situ Hibridizasyonfloresan Kullanarak Murine Gastrointestinal Sistemde Candida albicans Görselleştirilmesi

Candida albicans is a fungal component of the gut microbiota in humans and many other mammals. Although C. albicans does not cause symptoms in most ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

Aydınlatma ve Görüntüleme Candida albicans Biyofilmler

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy to Inhibit Candida albicans

Candida albicans'ı İnhibe Etmek için Gül Bengal Aracılı Fotodinamik Terapi

Invasive Candida albicans infection is a significant opportunistic fungal infection in humans because it is one of the most common colonizers of the gut, ...