Name: direct-coupled electroretinogram (dc-erg) for recording the light-evoked electrical responses of the mouse retinal pigment epithelium
Uploaded: 2020-07-14T12:30:00
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Ce travail a été soutenu par des fonds intra-muros nei. Les auteurs reconnaissent sincèrement le Dr Sheldon Miller pour ses conseils scientifiques, ses conseils techniques et son expertise en physiologie et en maladie de l’EPR. Les auteurs remercient Megan Kopera et le personnel de soins aux animaux pour la gestion des colonies de souris, ainsi que le Dr Tarun Bansal, Raymond Zhou et Yuan Wang pour leur soutien technique.

Ce protocole fait suite aux lignes directrices sur les soins aux animaux décrites dans le protocole d’étude des animaux approuvé par le Comité des soins et de l’utilisation des animaux de l’Institut national de l’œil.
1. Importation de protocoles de stimulation lumineuse pour DC-ERG
REMARQUE : Suivez les instructions ci-dessous pour importer les protocoles de stimulation lumineuse du DC-ERG dans le logiciel du système ERG (Tableau des matériaux<...

<ol>
	<li>Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+the+retinal+pigment+epithelium+and+the+neural+retina.">Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina.</a> Documenta Ophthalmologica. 60 (4), 327-346 (1985).</li><li>Sahu, B., Maeda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPE+Visual+Cycle+and+Biochemical+Phenotypes+of+Mutant+Mouse+Models.">RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models.</a> Methods in Molecular Biology. 1753, 89-102 (2018).</li><li>Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis:+use+and+utility+of+RPE+cells+in+culture.">Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture.</a> Experimental Eye Resarch. 126, 51-60 (2014).</li><li>Wimmers, S., Karl, M. O., Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+in+the+RPE.">Ion channels in the RPE.</a> Progress in Retinal Eye Research. 26 (3), 263-301 (2007).</li><li>Gundersen, D., Orlowski, J., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+polarity+of+Na,K-ATPase+in+retinal+pigment+epithelium+is+linked+to+a+reversal+of+the+ankyrin-fodrin+submembrane+cytoskeleton.">Apical polarity of Na,K-ATPase in retinal pigment epithelium is linked to a reversal of the ankyrin-fodrin submembrane cytoskeleton.</a> Journal of Cell Biology. 112 (5), 863-872 (1991).</li><li>Fletcher, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+age-related+macular+degeneration+using+animal+models.">Studying age-related macular degeneration using animal models.</a> Optometry and Vision Science. 91 (8), 878-886 (2014).</li><li>Gu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+RPE65+cause+autosomal+recessive+childhood-onset+severe+retinal+dystrophy.">Mutations in RPE65 cause autosomal recessive childhood-onset severe retinal dystrophy.</a> Nature Genetics. 17 (2), 194-197 (1997).</li><li>Marlhens, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+RPE65+cause+Leber's+congenital+amaurosis.">Mutations in RPE65 cause Leber's congenital amaurosis.</a> Nature Genetics. 17 (2), 139-141 (1997).</li><li>Marmorstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=the+product+of+the+Best+vitelliform+macular+dystrophy+gene+(VMD2),+localizes+to+the+basolateral+plasma+membrane+of+the+retinal+pigment+epithelium.">the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).</li><li>Chang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+studies+of+retinal+degeneration+and+diseases.">Mouse models for studies of retinal degeneration and diseases.</a> Methods in Molecular Biology. 935, 27-39 (2013).</li><li>Collin, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+Inherited+Retinal+Degeneration+with+Photoreceptor+Cell+Loss.">Mouse Models of Inherited Retinal Degeneration with Photoreceptor Cell Loss.</a> Cells. 9 (4), (2020).</li><li>Shrock, E., G&#252;ell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+in+Animals+and+Animal+Models.">CRISPR in Animals and Animal Models.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 152, 95-114 (2017).</li><li>Smalley, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+mouse+model+boom,+rat+model+renaissance.">CRISPR mouse model boom, rat model renaissance.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 893-894 (2016).</li><li>Benchorin, G., Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Vollrath, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Murine+Retinal+Function+by+Electroretinography.">Assessment of Murine Retinal Function by Electroretinography.</a> Bio Protocol. 7 (7), (2017).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+phagolysosomal+activity+by+miR-204+critically+influences+structure+and+function+of+retinal+pigment+epithelium/retina.">Regulation of phagolysosomal activity by miR-204 critically influences structure and function of retinal pigment epithelium/retina.</a> Human Molecular Genetics. 28 (20), 3355-3368 (2019).</li><li>Samuels, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+responses+of+the+retinal+pigment+epithelium:+changes+accompanying+photoreceptor+loss+in+the+mouse.">Light-evoked responses of the retinal pigment epithelium: changes accompanying photoreceptor loss in the mouse.</a> Journal of Neurophysiology. 104 (1), 391-402 (2010).</li><li>Wu, J., Marmorstein, A. D., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+abnormalities+in+the+retinal+pigment+epithelium+of+CFTR+mutant+mice.">Functional abnormalities in the retinal pigment epithelium of CFTR mutant mice.</a> Experimental Eye Research. 83 (2), 424-428 (2006).</li><li>Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+responses+of+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).</li><li>Peachey, N. S., Stanton, J. B., Marmorstein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+recording+and+response+characteristics+of+the+rat+dc-electroretinogram.">Noninvasive recording and response characteristics of the rat dc-electroretinogram.</a> Visual Neuroscience. 19 (6), 693-701 (2002).</li><li>Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+retinal+pigment+epithelium+dysfunction+is+concomitant+with+hyperglycemia+in+mouse+models+of+type+1+and+type+2+diabetes.">Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).</li><li>Marmorstein, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light+peak+of+the+electroretinogram+is+dependent+on+voltage-gated+calcium+channels+and+antagonized+by+bestrophin+(best-1).">The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1).</a> Journal of General Physiology. 127 (5), 577-589 (2006).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invest.+Ophtalmol.+Vis.+Sci.">Invest. Ophtalmol. Vis. Sci.</a> Annual Meeting for the Association for Research in Vision and Ophthalmology. , 3568 (2017).</li><li>Iacovelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Cre+transgenic+mice+with+postnatal+RPE-specific+ocular+expression.">Generation of Cre transgenic mice with postnatal RPE-specific ocular expression.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1378-1383 (2011).</li><li>Wang, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-204/211+alters+epithelial+physiology.">MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology.</a> FASEB Journal. 24 (5), 1552-1571 (2010).</li><li>He, L., Marioutina, M., Dunaief, J. L., Marneros, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-+and+gene-dosage-dependent+cre-induced+abnormalities+in+the+retinal+pigment+epithelium.">Age- and gene-dosage-dependent cre-induced abnormalities in the retinal pigment epithelium.</a> American Journal of Pathology. 184 (6), 1660-1667 (2014).</li><li>Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+modulation+of+basolateral+membrane+Cl-+conductance+in+chick+retinal+pigment+epithelium:+the+light+peak+and+fast+oscillation.">Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation.</a> Journal of Neurophysiology. 70 (4), 1669-1680 (1993).</li><li>Blaug, S., Quinn, R., Quong, J., Jalickee, S., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelial+function:+a+role+for+CFTR.">Retinal pigment epithelial function: a role for CFTR.</a> Documenta Ophthalmologica. 106 (1), 43-50 (2003).</li><li>Gallemore, R. P., Griff, E. R., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+in+support+of+a+photoreceptoral+origin+for+the+"light-peak+substance".">Evidence in support of a photoreceptoral origin for the "light-peak substance".</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (4), 566-571 (1988).</li><li>Shahi, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+Electroretinogram+after+Kir7.1+Channel+Suppression+Suggests+Role+in+Retinal+Electrophysiology.">Abnormal Electroretinogram after Kir7.1 Channel Suppression Suggests Role in Retinal Electrophysiology.</a> Science Reports. 7 (1), 10651 (2017).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+human+RPE65+P25L+hypomorph+resembles+wild+type+under+normal+light+rearing+but+is+fully+resistant+to+acute+light+damage.">Mouse model of human RPE65 P25L hypomorph resembles wild type under normal light rearing but is fully resistant to acute light damage.</a> Human Molecular Genetics. 24 (15), 4417-4428 (2015).</li></ol>

Étapes critiques
Un bon enregistrement DC-ERG nécessite des électrodes stables qui sont exemptes de bulles qui créent des artefacts et des dérives indésirables car elles sont extrêmement sensibles au dégazage et aux changements de température. Il est essentiel qu’une ligne de base stable soit atteinte lorsque les électrodes sont placées dans la solution de bain HBSS avant d’aller de l’avant avec l’enregistrement de la souris. Les petites bulles ont tendance ...

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est un monocouche de cellules spécialisées qui tapissent le segment postérieur de l’œil et exercent des fonctions critiques pour maintenir l’homéostasierétinienne 1. Le RPE prend en charge les photorécepteurs en régénérant leur pigment visuel photon-capture dans un processus appelé le cycle visuel2, en participant à la phagocytose diurne des pointes du segment extérieurhangar 3, et dans le transport des nutriments et des produits métaboliques entre les photorécepteurs et les choriocapillaris4,5. Les anomalies dans la fonction de RPE sous-tendent de nombreuses maladies rétiniennes humaines, telles que la dégénérescence maculaire relative à l’âge6,l’amaurosis congénital de Leber7,8 et la dystrophie maculaire vitelliforme meilleure9. Comme les tissus oculaires des donneurs sont souvent difficiles à obtenir uniquement à des fins de recherche, les modèles animaux avec des modifications génétiques peuvent fournir une autre façon d’étudier le développement des maladiesrétiniennes 10,11. En outre, l’émergence et l’application de la technologie CRISPR cas9 permettent maintenant des introductions génomiques (knock-in) ou des suppressions (knock-out) dans un processus simple en une étape dépassant les limites des technologies antérieures de ciblagegénétique 12. L’explosion de la disponibilité de nouveaux modèles muraux13 nécessite un protocole d’enregistrement plus efficace pour évaluer non invasivement la fonction RPE.
La mesure des réponses électriques évoquées par la lumière de l’EPR peut être obtenue à l’aide d’une technique d’électrorétogramme couplé directement (DC-ERG). Lorsqu’il est utilisé en combinaison avec des enregistrements ERG conventionnels qui mesurent le photorécepteur (a-wave) et bipolaire (b-onde) réponsescellulaires 14, le DC-ERG peut définir comment les propriétés de réponse de l’EPR changer avec la dégénérescencerétinienne 15,16,17 ou si le dysfonctionnement RPE précède la perte de photorécepteur. Ce protocole décrit une méthode adaptée des travaux de Marmorstein, Peachey et ses collègues qui ont développé pour la première fois la technique DC-ERG16,18,19,20 et améliore la reproductibilité et la facilité d’utilisation.
L’enregistrement DC-ERG est difficile à réaliser en raison du long temps d’acquisition (9 min) pendant lequel toute interruption ou introduction du bruit peut compliquer l’interprétation des données. L’avantage de cette nouvelle méthode est que les lignes de base atteignent un état stable dans un laps de temps plus court réduisant la probabilité que l’animal se réveille prématurément de l’anesthésie et est moins enclin à la formation de bulles dans les électrodes capillaires.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ag/AgCl (mouth) Electrode</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>EP1</td>
			<td>Mouth reference electrode for mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Tile</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>CTS</td>
			<td>Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Cleaning Stick</td>
			<td>Puritan Medical Products</td>
			<td>867-WC No Glue</td>
			<td>To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroretinogram (ERG) System</td>
			<td>Diagnosys LLC</td>
			<td>E3 System</td>
			<td>Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen Burner</td>
			<td>Argos Technologies</td>
			<td>BW20002460</td>
			<td>Or equivlaent to shape glass under flame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary Tube (1.5 mm)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF150-75</td>
			<td>For filling with HBSS and making contact to the cornea</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Buffered Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>14175-095</td>
			<td>Commercially available. Maintain at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Line Filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>6722-5001</td>
			<td>To protect vacuum pump from aerosols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Noise Cable for Microelectrode Holders</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>5372</td>
			<td>Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Ball Joint</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>500871</td>
			<td>For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>MatLab: For editing the analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab Curvefit Toolbox</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab Compiler</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab Runtime version 9.5</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2018b (9.5)</td>
			<td>Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Holders (45 degrees)</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>MEH345-15</td>
			<td>For holding the capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle (25 ga)</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8881250313</td>
			<td>For filling the capillary tubes with HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle (ground) electrode</td>
			<td>Rhythmlink</td>
			<td>13mm - one elctrode</td>
			<td>Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regulator/Power Conditioner</td>
			<td>Furman</td>
			<td>P-1800</td>
			<td>Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (12 mL)</td>
			<td>Monoject</td>
			<td>1181200777</td>
			<td>For filling the capillary tubes with HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-clip</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06852-20</td>
			<td>For electrode holder assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>420120000</td>
			<td>Clear polycarbonate bottom &#38; cover</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmacological treatment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant eye gel</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>0078-0429-47</td>
			<td>Helps lubricates corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine Hydrochloride 2.5%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>17478-201-15</td>
			<td>Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proparacaine Hydrochloride 0.5%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>17478-263-12</td>
			<td>Local anesthetic for ophthalmic instillation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide 0.5%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>17478-101-12</td>
			<td>Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>AnaSed</td>
			<td>sc-362949Rx</td>
			<td>Analgesic and muscle relaxant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetamine (Ketamine HCl)</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>501072</td>
			<td>Anesthetic for intramuscular injections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct-coupled electroretinogram (dc-erg) for recording the light-evoked electrical responses of the mouse retinal pigment epithelium

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est un monocouche spécialisé de cellules stratégiquement situées entre la rétine et les choriocapillaris qui maintiennent la santé globale et l’intégrité structurale des photorécepteurs. L’EPR est polarisée, présente des récepteurs ou des canaux situés de façon apique et basique, et effectue le transport vectoriel de l’eau, des ions, des métabolites et sécrète plusieurs cytokines.
Des mesures in vivo non invasives de la fonction RPE peuvent être effectuées à l’aide d’ERGs couplés directs (DC-ERGs). La méthodologie derrière le DC-ERG a été mise au point par Marmorstein, Peachey et ses collègues à l’aide d’un système d’enregistrement de stimulation sur mesure et a ensuite démontré l’utilisation d’un système disponible dans le commerce. La technique DC-ERG utilise des capillaires en verre remplis de la solution de sel tamponné (HBSS) de Hank pour mesurer les réponses électriques plus lentes de l’EPR obtenues par les changements de concentration évoqués par la lumière dans l’espace sous-réceptif en raison de l’activité des photorécepteurs. Le stimulus léger prolongé et la longueur de l’enregistrement DC-ERG le rendent vulnérable à la dérive et au bruit, ce qui entraîne un faible rendement d’enregistrements utilisables. Ici, nous présentons une méthode rapide et fiable pour améliorer la stabilité des enregistrements tout en réduisant le bruit en utilisant la pression sous vide pour réduire/éliminer les bulles qui résultent de l’outgassing du HBSS et du support d’électrode. En outre, les artefacts de la ligne électrique sont atténués à l’aide d’un régulateur de tension / conditionneur de puissance. Nous incluons les protocoles de stimulation lumineuse nécessaires pour un système ERG disponible dans le commerce ainsi que des scripts pour l’analyse des composants DC-ERG : c-wave, oscillation rapide, pic lumineux et réponse éteinte. En raison de la facilité améliorée des enregistrements et du flux de travail rapide d’analyse, ce protocole simplifié est particulièrement utile en mesurant des changements relatifs à l’âge dans la fonction de RPE, la progression de la maladie, et dans l’évaluation de l’intervention pharmacologique.

La figure 2 est un ensemble de données d’échantillons provenant de souris miR-204 ko/ko cre/+ (KO conditionnelle) et sauvages (WT). MiR-204 ko/ko cre/+ sont des souris avec un KO conditionnel de microARN 204 dans l’épithélium pigmentaire rétinien. Ces souris sont générées en croisant des souris miR-204 floxées (produites par NEIGEF)22 avec des souris VMD2-CRE23. MiR-204 est fortement exprimé dans l’EPR où il régule l’express...

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Direct-Coupled Electroretinogram DC-ERG for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Ici, nous présentons une méthode pour enregistrer les réponses électriques évoquées par la lumière de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) chez la souris en utilisant une technique connue sous le nom de DC-ERGs décrite pour la première fois par Marmorstein, Peachey et ses collègues au début des années 2000.

Électrorétinogramme couplé direct (DC-ERG) pour l’enregistrement des réponses électriques évoquées par la lumière de l’épithélium pigmentaire rétinien de souris

The retinal pigment epithelium (RPE) is a specialized monolayer of cells strategically located between the retina and the choriocapillaris that maintain ...

La technique DC-ERG peut être utilisée pour l’évaluation non évasive de la fonction d’épithélium pigmentaire rétinien pour surveiller les changements liés à l’âge ou la progression de la maladie et pour évaluer les effets d’intervention pharmacologique. Cette technique améliore la capacité de reproduction dc-ERG et la facilité d’utilisation en simplifiant la préparation des électrodes capillaires. Il peut également être complété par une application logicielle ohm standard pour faciliter l’analyse.Commencez par glisser soigneusement une aiguille de seringue de calibre 25 à travers le joint en caoutchouc de silicone jusqu’à la paroi arrière du support d’électrode. Remplissez la base du support d’électrode avec du HBSS dégazé tout en rétractant lentement l’aiguille, en prenant soin de ne pas introduire de bulles, et remplacez le bouchon fileté sans serrer. Réinsérer l’aiguille de seringue pour remplir l’espace vide dans l’espace avec HBSS et tenir le capillaire horizontalement tout en remplissant pour empêcher la solution s’échapper de l’autre extrémité.Saisir le capillaire rempli à l’extrémité pliée, insérer lentement l’autre extrémité à travers le bouchon desserré et serrer le bouchon de vis en place. Inclinez les supports d’électrode avec les électrodes capillaires orientées vers le haut pour permettre à toutes les bulles de s’écouler et dégazer les capillaires dans une chambre à vide pendant cinq à dix minutes. Ensuite, relâchez lentement le vide et remplissez les porte-électrodes et les capillaires en verre, comme démontré.Pour faire un stand personnalisé pour le support microélecrode, retirez les clips polytacétaux noirs d’un côté d’un t-clip numéro huit et utilisez une base de cylindre avec des joints de boule magnétique usinés en deux pour ajuster la hauteur. Fixez les t-clips modifiés aux vis de montage de boule magnétique avec des écrous de taille M3 et une glissière dans la poignée en bois conique d’environ un pouce, modifiée à partir d’un bâton de nettoyage de pointe de coton, dans le stand à un angle pour fixer le support de microélecrode dans le support magnétique fait sur mesure de boule magnétique de T-clip. Ensuite, utilisez la base du cylindre des aimants de terres rares pour positionner en toute sécurité le support d’électrode personnalisé sur la plaque métallique de la scène, permettant une rotation de 360 degrés sur un axe à 180 degrés.Pour effectuer un test d’électrode, d’abord, abaissez doucement les microélecrodes capillaires remplies de HBSS entièrement assemblées dans un petit récipient de HBSS. Placez l’électrode au sol de l’aiguille et l’électrode de référence de granulés argentée au chlorure argenté dans le même HBSS pour compléter le circuit et sélectionner ou créer un identificateur approprié pour décrire la souris à tester. Pour sélectionner le protocole d’électrorétogramme couplé direct à effectuer, cliquez sur protocoles et sélectionnez DC-ERG.Cliquez sur exécuter. Une boîte de dialogue apparaîtra avec les informations du patient. Si l’information est correcte, cliquez sur oui et passez aux étapes une des six.Fermez les portes de la cage de Faraday et cliquez sur impedance pour afficher le mode d’impedance. Vérifiez que les valeurs de référence de la bouche, du sol arrière et des électrodes d’enregistrement sont acceptables et cliquez sur l’étape pour passer à l’étape quatre de six pour tester la stabilité de base. Pour commencer à visualiser les traces, cliquez sur aperçu.Les traces devraient être un faible bruit avec une amplitude de pointe à maximale de moins de 200 microvolts. Pour positionner la souris et les électrodes pour une expérience, anesthésier la cornée d’une souris sédated avec une goutte d’acide chlorhydrique proparacaine de 5%avant de dilatation de la cornée avec une baisse de 2,5% phényléphrine HCL et 5% tropicamide. Dans le logiciel du système ERG, vérifiez que le bon patient est sélectionné.Cliquez sur protocoles. Sous la description du protocole, sélectionnez DC-ERG et cliquez sur exécuter. Cliquez sur oui pour vérifier que le test correct est effectué.Utilisez l’étape un des six pour allumer une faible lumière rouge à l’intérieur du dôme et placer la souris sur une table d’enregistrement chauffée. Utilisez des forceps pour tenter soigneusement la peau de la jambe arrière. Et en utilisant une main pour tenir fermement l’électrode aiguille, utiliser l’autre main pour insérer l’électrode sous-cutanée dans la jambe arrière pour fixer l’électrode en place.Placez l’électrode de chlorure d’argent et d’argent de référence dans la bouche de l’animal afin que la pastille centrée repose le long de la joue arrière et soit maintenue en place derrière les dents. Avant de placer les électrodes capillaires sur l’œil, placez le support d’électrode avec les capillaires en verre orientés verticalement et faites glisser le support d’électrode avec un index pour enlever toutes les bulles qui pourraient avoir été introduites. Utilisez une aiguille de calibre 25 pour remplir les pointes capillaires avec hbss et inspecter les capillaires pour s’assurer qu’il n’y a pas de bulles d’air piégées dans les extrémités.Placez le support d’électrode de sorte que les extrémités ouvertes des capillaires remplis de HBSS soient en contact doux avec la cornée. Et en prenant soin d’éviter d’introduire des bulles, inverser le distributeur de gel pour les yeux lubrifiant pour jeter les gouttes initiales. Ensuite, placez une goutte de gel pour les yeux lubrifiant sur chaque œil pour maintenir la conductivité et prévenir la dessiccation pendant l’enregistrement.Pour enregistrer les DC-ERGs, cliquez sur étape pour sélectionner l’étape cinq sur six et cliquez sur impedance pour utiliser l’écran de vérification d’impedance pour examiner les résistances des yeux gauche et droit. Les valeurs d’impédance pour les électrodes d’enregistrement à chaque œil doivent être similaires. Et les valeurs d’impédance pour le sol et les électrodes de référence devraient être inférieures à 10 kilohms.Cliquez sur aperçu pour afficher les traces pour les yeux gauche et droit et attendre jusqu’à 10 minutes pour une ligne de base stable à atteindre. Ensuite, cliquez sur arrêter pour quitter l’aperçu de la trace et cliquez sur exécuter pour démarrer l’enregistrement. Ici, un ensemble de données d’échantillons de souris conditionnelles knock-out et de type sauvage est montré.Dans cette analyse, la trace a souffert de bulles minuscules dans l’électrode. Il a augmenté le bruit de pointe à pointe dans la trace. Dans une analyse distincte, les bulles ont été éliminées à l’aide de la chambre à vide avant d’assembler les microélectrodes à l’intérieur des peuplements du support d’électrode.Les meilleures lignes d’ajustement aux 25 secondes initiales peuvent être calculées, ce qui permet de réaguiller les réponses corrigées de la dérive et d’identifier les amplitudes des composants DC-ERG. Comme prévu, l’expression réduite des canaux de potassium de traitement 7.1 dans le RPE atténue considérablement l’onde c et l’oscillation rapide, indiquant une affaiblissement significative des propriétés électriques rétiniennes d’épithélium de pigment. Ici, les amplitudes relatives des composants DC-ERG, normalisées de type sauvage et tracées contre les deux plus grandes amplitudes d’ondes a évoquées par la lumière, sont montrées.Cette forme d’analyse peut déterminer si les réponses électriques réduites de l’EPR peuvent être expliquées par la réduction de l’activité photoréceptrice seule. Ou s’il y a un défaut sous-jacent qui provient de l’EPR. N’oubliez pas d’atteindre une base de référence stable avant de passer à l’enregistrement de la souris et de réinspecter périodiquement les électrodes pour les bulles qui peuvent avoir été introduites.Les ERG adaptés à l’obscurité peuvent être enregistrés avant le DC-ERG pour mesurer la fonction rétinienne entraînée par le cône. Des ERGs adaptés à la lumière peuvent également être effectués après le DC-ERG pour évaluer les réponses rétiniennes entraînées par les cônes.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium

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Recherche

Chimie

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