Name: direct-coupled electroretinogram (dc-erg) for recording the light-evoked electrical responses of the mouse retinal pigment epithelium
Uploaded: 2020-07-14T12:30:00
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Diese Arbeit wurde von nei-Intramural-Fonds unterstützt. Die Autoren würdigen Dr. Sheldon Miller aufrichtig für seine wissenschaftliche Beratung, technische Beratung und Expertise in RPE-Physiologie und Krankheit. Die Autoren danken Megan Kopera und dem Tierpfleger für die Verwaltung der Mauskolonien und Dr. Tarun Bansal, Raymond Zhou und Yuan Wang für die technische Unterstützung.

Dieses Protokoll folgt den Leitlinien für die Tierpflege, die in dem vom Tierpflege- und Verwendungsausschuss des National Eye Institute genehmigten Tierstudienprotokoll summiert sind.
1. Importieren von Lichtstimulationsprotokollen für DC-ERG
HINWEIS: Folgen Sie den anweisungen unten, um die Lichtstimulationsprotokolle für das DC-ERG in die ERG-Systemsoftware (Tabelle der Materialien )zu importieren. Das Protokoll besteht aus einem 0,5 min Pre-Sti...

<ol>
	<li>Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+the+retinal+pigment+epithelium+and+the+neural+retina.">Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina.</a> Documenta Ophthalmologica. 60 (4), 327-346 (1985).</li><li>Sahu, B., Maeda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPE+Visual+Cycle+and+Biochemical+Phenotypes+of+Mutant+Mouse+Models.">RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models.</a> Methods in Molecular Biology. 1753, 89-102 (2018).</li><li>Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. 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O., Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+in+the+RPE.">Ion channels in the RPE.</a> Progress in Retinal Eye Research. 26 (3), 263-301 (2007).</li><li>Gundersen, D., Orlowski, J., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+polarity+of+Na,K-ATPase+in+retinal+pigment+epithelium+is+linked+to+a+reversal+of+the+ankyrin-fodrin+submembrane+cytoskeleton.">Apical polarity of Na,K-ATPase in retinal pigment epithelium is linked to a reversal of the ankyrin-fodrin submembrane cytoskeleton.</a> Journal of Cell Biology. 112 (5), 863-872 (1991).</li><li>Fletcher, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+age-related+macular+degeneration+using+animal+models.">Studying age-related macular degeneration using animal models.</a> Optometry and Vision Science. 91 (8), 878-886 (2014).</li><li>Gu, S. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=the+product+of+the+Best+vitelliform+macular+dystrophy+gene+(VMD2),+localizes+to+the+basolateral+plasma+membrane+of+the+retinal+pigment+epithelium.">the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).</li><li>Chang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+studies+of+retinal+degeneration+and+diseases.">Mouse models for studies of retinal degeneration and diseases.</a> Methods in Molecular Biology. 935, 27-39 (2013).</li><li>Collin, G. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+responses+of+the+retinal+pigment+epithelium:+changes+accompanying+photoreceptor+loss+in+the+mouse.">Light-evoked responses of the retinal pigment epithelium: changes accompanying photoreceptor loss in the mouse.</a> Journal of Neurophysiology. 104 (1), 391-402 (2010).</li><li>Wu, J., Marmorstein, A. D., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+abnormalities+in+the+retinal+pigment+epithelium+of+CFTR+mutant+mice.">Functional abnormalities in the retinal pigment epithelium of CFTR mutant mice.</a> Experimental Eye Research. 83 (2), 424-428 (2006).</li><li>Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+responses+of+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).</li><li>Peachey, N. S., Stanton, J. B., Marmorstein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+recording+and+response+characteristics+of+the+rat+dc-electroretinogram.">Noninvasive recording and response characteristics of the rat dc-electroretinogram.</a> Visual Neuroscience. 19 (6), 693-701 (2002).</li><li>Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+retinal+pigment+epithelium+dysfunction+is+concomitant+with+hyperglycemia+in+mouse+models+of+type+1+and+type+2+diabetes.">Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).</li><li>Marmorstein, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light+peak+of+the+electroretinogram+is+dependent+on+voltage-gated+calcium+channels+and+antagonized+by+bestrophin+(best-1).">The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1).</a> Journal of General Physiology. 127 (5), 577-589 (2006).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invest.+Ophtalmol.+Vis.+Sci.">Invest. Ophtalmol. Vis. Sci.</a> Annual Meeting for the Association for Research in Vision and Ophthalmology. , 3568 (2017).</li><li>Iacovelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Cre+transgenic+mice+with+postnatal+RPE-specific+ocular+expression.">Generation of Cre transgenic mice with postnatal RPE-specific ocular expression.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1378-1383 (2011).</li><li>Wang, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-204/211+alters+epithelial+physiology.">MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology.</a> FASEB Journal. 24 (5), 1552-1571 (2010).</li><li>He, L., Marioutina, M., Dunaief, J. L., Marneros, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-+and+gene-dosage-dependent+cre-induced+abnormalities+in+the+retinal+pigment+epithelium.">Age- and gene-dosage-dependent cre-induced abnormalities in the retinal pigment epithelium.</a> American Journal of Pathology. 184 (6), 1660-1667 (2014).</li><li>Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+modulation+of+basolateral+membrane+Cl-+conductance+in+chick+retinal+pigment+epithelium:+the+light+peak+and+fast+oscillation.">Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation.</a> Journal of Neurophysiology. 70 (4), 1669-1680 (1993).</li><li>Blaug, S., Quinn, R., Quong, J., Jalickee, S., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelial+function:+a+role+for+CFTR.">Retinal pigment epithelial function: a role for CFTR.</a> Documenta Ophthalmologica. 106 (1), 43-50 (2003).</li><li>Gallemore, R. P., Griff, E. R., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+in+support+of+a+photoreceptoral+origin+for+the+"light-peak+substance".">Evidence in support of a photoreceptoral origin for the "light-peak substance".</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (4), 566-571 (1988).</li><li>Shahi, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+Electroretinogram+after+Kir7.1+Channel+Suppression+Suggests+Role+in+Retinal+Electrophysiology.">Abnormal Electroretinogram after Kir7.1 Channel Suppression Suggests Role in Retinal Electrophysiology.</a> Science Reports. 7 (1), 10651 (2017).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+human+RPE65+P25L+hypomorph+resembles+wild+type+under+normal+light+rearing+but+is+fully+resistant+to+acute+light+damage.">Mouse model of human RPE65 P25L hypomorph resembles wild type under normal light rearing but is fully resistant to acute light damage.</a> Human Molecular Genetics. 24 (15), 4417-4428 (2015).</li></ol>

Kritische Schritte
Eine gute DC-ERG-Aufnahme erfordert stabile Elektroden, die frei von Blasen sind, die Artefakte und unerwünschte Drift erzeugen, da sie extrem empfindlich auf Ausgasung und Temperaturänderungen reagieren. Es ist wichtig, dass eine stabile Ausgangsbasis erreicht wird, wenn die Elektroden in der HBSS-Badelösung platziert werden, bevor sie mit der Mausaufzeichnung fortfahren. Kleine Blasen neigen dazu, sich an der Basis der Kapillarelektrode oder um die Sili...

Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine Monoschicht spezialisierter Zellen, die das hintere Segment des Auges ausbilden und kritische Funktionen ausüben, um die netzhautige Homöostase1aufrechtzuerhalten. Das RPE unterstützt Photorezeptoren durch Regenerierung ihres photonenerfassenden visuellen Pigments in einem Prozess, der als visueller Zyklus2bezeichnet wird, durch Die Teilnahme an der tagesphagozytose der äußeren Segmentspitzen3, und beim Transport von Nährstoffen und Stoffwechselprodukten zwischen Photorezeptoren und der Choriokapillare4,5. Anomalien in der RPE-Funktion unterlegen zahlreiche menschliche Netzhauterkrankungen, wie altersbedingte Makuladegeneration6, Lebers angeborene Amaurose7,8 und Best vitelliform Makuladystrophie9. Da Spenderaugengewebe oft nur für Forschungszwecke schwer zu erhalten sind, können Tiermodelle mit genetischen Veränderungen eine alternative Möglichkeit bieten, die Entwicklung von Netzhauterkrankungen zu untersuchen10,11. Darüber hinaus ermöglicht die Entstehung und Anwendung der CRISPR cas9-Technologie nun genomische Einschleppungen (Knock-in) oder Deletionen (Knock-out) in einem einfachen, einstufigen Prozess, der die Grenzen früherer Gen-Targeting-Technologien überschreitet12. Der Boom der Verfügbarkeit neuer Mausmodelle13 erfordert ein effizienteres Aufzeichnungsprotokoll, um die RPE-Funktion nicht-invasiv auszuwerten.
Die Messung der lichtevozierten elektrischen Ansprechungen des RPE kann mit einer direkt gekoppelten Elektroretinogramm-Technik (DC-ERG) erreicht werden. In Kombination mit herkömmlichen ERG-Aufnahmen, die die Photorezeptor- (a-Welle) und bipolaren (b-Wellen) Zellreaktionen14messen, kann das DC-ERG definieren, wie sich die Ansprecheigenschaften des RPE mit Netzhautdegeneration15,16,17 ändern oder ob die RPE-Dysfunktion dem Verlust des Photorezeptors vorausgeht. Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, die an die Arbeit von Marmorstein, Peachey und Kollegen angepasst wurde, die zuerst die DC-ERG-Technik16,18,19,20 entwickelt haben und die Reproduzierbarkeit und Benutzerfreundlichkeit verbessern.
Die DC-ERG-Aufnahme ist aufgrund der langen Erfassungszeit (9 min), in der eine Unterbrechung oder Einschleppung von Rauschen die Interpretation der Daten erschweren kann, schwierig durchzuführen. Der Vorteil dieser neuen Methode ist, dass die Basislinien innerhalb einer kürzeren Zeitzeit einen stabilen Zustand erreichen und die Wahrscheinlichkeit verringern, dass das Tier vorzeitig aus der Anästhesie erwacht und weniger anfällig für Blasenbildung in den Kapillarelektroden ist.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ag/AgCl (mouth) Electrode</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>EP1</td>
			<td>Mouth reference electrode for mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Tile</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>CTS</td>
			<td>Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Cleaning Stick</td>
			<td>Puritan Medical Products</td>
			<td>867-WC No Glue</td>
			<td>To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroretinogram (ERG) System</td>
			<td>Diagnosys LLC</td>
			<td>E3 System</td>
			<td>Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen Burner</td>
			<td>Argos Technologies</td>
			<td>BW20002460</td>
			<td>Or equivlaent to shape glass under flame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary Tube (1.5 mm)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF150-75</td>
			<td>For filling with HBSS and making contact to the cornea</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Buffered Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>14175-095</td>
			<td>Commercially available. Maintain at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Line Filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>6722-5001</td>
			<td>To protect vacuum pump from aerosols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Noise Cable for Microelectrode Holders</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>5372</td>
			<td>Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Ball Joint</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>500871</td>
			<td>For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>MatLab: For editing the analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab Curvefit Toolbox</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab Compiler</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab Runtime version 9.5</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2018b (9.5)</td>
			<td>Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Holders (45 degrees)</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>MEH345-15</td>
			<td>For holding the capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle (25 ga)</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8881250313</td>
			<td>For filling the capillary tubes with HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle (ground) electrode</td>
			<td>Rhythmlink</td>
			<td>13mm - one elctrode</td>
			<td>Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regulator/Power Conditioner</td>
			<td>Furman</td>
			<td>P-1800</td>
			<td>Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (12 mL)</td>
			<td>Monoject</td>
			<td>1181200777</td>
			<td>For filling the capillary tubes with HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-clip</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06852-20</td>
			<td>For electrode holder assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>420120000</td>
			<td>Clear polycarbonate bottom &#38; cover</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmacological treatment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant eye gel</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>0078-0429-47</td>
			<td>Helps lubricates corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine Hydrochloride 2.5%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>17478-201-15</td>
			<td>Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proparacaine Hydrochloride 0.5%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>17478-263-12</td>
			<td>Local anesthetic for ophthalmic instillation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide 0.5%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>17478-101-12</td>
			<td>Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>AnaSed</td>
			<td>sc-362949Rx</td>
			<td>Analgesic and muscle relaxant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetamine (Ketamine HCl)</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>501072</td>
			<td>Anesthetic for intramuscular injections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct-coupled electroretinogram (dc-erg) for recording the light-evoked electrical responses of the mouse retinal pigment epithelium

Das retinale Pigmentepithel (RPE) ist eine spezialisierte Monoschicht von Zellen, die strategisch zwischen der Netzhaut und der Choriokapillare liegen und die allgemeine Gesundheit und strukturelle Integrität der Photorezeptoren erhalten. Das RPE ist polarisiert, zeigt apisch und basal lokalisierte Rezeptoren oder Kanäle, und führt vektoriell Transport von Wasser, Ionen, Metaboliten, und sezernieren mehrere Zytokine.
In vivo nichtinvasive Messungen der RPE-Funktion können mit direkt gekoppelten ERGs (DC-ERGs) durchgeführt werden. Die Methodik hinter dem DC-ERG wurde von Marmorstein, Peachey und Kollegen mit einem kundenspezifischen Stimulationsaufzeichnungssystem entwickelt und später mit einem kommerziell erhältlichen System demonstriert. Die DC-ERG-Technik verwendet Glaskapillaren, die mit Hanks gepufferter Salzlösung (HBSS) gefüllt sind, um die langsameren elektrischen Reaktionen des RPE zu messen, die durch lichtevokte Konzentrationsänderungen im subretinalen Raum aufgrund der Photorezeptoraktivität ausgelöst werden. Der verlängerte Lichtreiz und die Länge der DC-ERG-Aufnahme machen sie anfällig für Drift und Rauschen, was zu einer geringen Ausbeute an verwendbaren Aufnahmen führt. Hier präsentieren wir eine schnelle, zuverlässige Methode zur Verbesserung der Stabilität der Aufnahmen bei gleichzeitiger Reduzierung von Geräuschen durch Verwendung von Vakuumdruck zur Reduzierung/Beseitigung von Blasen, die sich aus der Ausgasung des HBSS- und Elektrodenhalters ergeben. Darüber hinaus werden Stromleitungsartefakte mit einem Spannungsregler/Leistungsaufbereiter abgeschwächt. Wir beinhalten die notwendigen Lichtstimulationsprotokolle für ein handelsübliches ERG-System sowie Skripte zur Analyse der DC-ERG-Komponenten: c-Wave, schnelle Schwingung, Lichtspitzen- und Off-Response. Aufgrund der verbesserten Leichtigkeit der Aufzeichnungen und des schnellen Analyse-Workflows ist dieses vereinfachte Protokoll besonders nützlich bei der Messung altersbedingter Veränderungen der RPE-Funktion, des Krankheitsverlaufs und bei der Bewertung pharmakologischer Interventionen.

Abbildung 2 ist ein Beispiel-Dataset von miR-204 ko/ko cre/+ (bedingte KO) und Wildtyp (WT) Mäuse. MiR-204 ko/ko cre/+ sind Mäuse mit einem bedingten Knockout von microRNA 204 im retinalen Pigmentepithel. Diese Mäuse werden durch Kreuzung von floxed miR-204 Mäusen (produziert von NEIGEF)22 mit VMD2-CRE Mäusen23erzeugt. MiR-204 wird stark in der RPE exprimiert, wo es die Expression von Proteinen reguliert, die für die Epithelfunktion kriti...

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Direct-Coupled Electroretinogram DC-ERG for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Hier stellen wir eine Methode zur Aufzeichnung lichtevokierter elektrischer Reaktionen des retinalen Pigmentepithels (RPE) bei Mäusen vor, die eine Technik verwendet, die als DC-ERGs bekannt ist und von Marmorstein, Peachey und Kollegen in den frühen 2000er Jahren beschrieben wurde.

Direktgekoppeltes Elektroretinogramm (DC-ERG) zur Aufzeichnung der lichtbeschworenen elektrischen Reaktionen des retinalen Pigmentepithels der Maus

The retinal pigment epithelium (RPE) is a specialized monolayer of cells strategically located between the retina and the choriocapillaris that maintain ...

Die DC-ERG-Technik kann zur nicht-ausweichenden Bewertung der retinalen Pigmentepithelfunktion eingesetzt werden, um altersbedingte Veränderungen oder Dasentwicklung seuchen zu überwachen und pharmakologische Interventionseffekte zu bewerten. Diese Technik verbessert die DC-ERG-Reproduktionsfähigkeit und die einfache Anwendung durch die Vereinfachung der Kapillarelektrodenvorbereitung. Es kann auch mit einer Standard-Ohm-Software-Anwendung ergänzt werden, um die Analyse zu erleichtern.Beginnen Sie mit dem vorsichtigen Schieben einer 25-Spur-Spritzennadel durch die Silikon-Gummidichtung an die Rückwand des Elektrodenhalters. Füllen Sie die Basis des Elektrodenhalters mit entgastem HBSS, während Sie die Nadel langsam zurückziehen, wobei darauf geachtet wird, keine Blasen einzuführen, und ersetzen Sie die Gewindekappe ohne Anziehen. Setzen Sie die Spritzennadel wieder ein, um den leeren Raum innerhalb des Spalts mit HBSS zu füllen, und halten Sie die Kapillare horizontal während der Füllung, um zu verhindern, dass die Lösung vom anderen Ende entweicht.Greifen Sie die gefüllte Kapillare am gebogenen Ende, legen Sie langsam das andere Ende durch die gelockerte Kappe ein und ziehen Sie die Schraubkappe an Ort und Stelle. Neigen Sie die Elektrodenhalter mit den nach oben gerichteten Kapillarelektroden, damit Blasen ausfließen können, und entgasen Sie die Kapillaren in einer Vakuumkammer für fünf bis zehn Minuten. Dann lassen Sie das Vakuum langsam los und füllen Sie die Elektrodenhalter und Glaskapillaren wieder auf, wie gezeigt.Um einen benutzerdefinierten Ständer für den Mikroelektrodenhalter zu machen, entfernen Sie die schwarzen Polyacetal-Clips von einer Seite eines T-Clips der Nummer acht und verwenden Sie einen Zylindersockel mit magnetischen Kugelverbindungen, die in der Hälfte bearbeitet werden, um die Höhe einzustellen. Befestigen Sie die modifizierten T-Clips an den magnetischen Kugelbefestigungsschrauben mit M3-Muttern und einem Schlitten in etwa einem Zoll verjüngten Holzgriff, modifiziert von einem Baumwollspitzen-Reinigungsstab, in den Ständer in einem Winkel, um den Mikroelektrodenhalter in den maßgeschneiderten T-Clip Magnetkugelgelenkständer zu befestigen. Verwenden Sie dann den Zylinderboden für Seltenerdmagnete, um den kundenspezifischen Elektrodenhalter sicher auf der Metallplatte der Bühne zu positionieren, was eine 360-Grad-Drehung auf einer 180-Grad-Achse ermöglicht.Um einen Elektrodentest durchzuführen, senken Sie zunächst die vollständig montierten HBSS-gefüllten Kapillarmikroelektroden vorsichtig in einen kleinen Behälter mit HBSS. Legen Sie die Nadelmasseund die silberne, silberchloridzentrierte Pellet-Referenzelektrode in dieselbe HBSS, um den Schaltkreis abzuschließen, und wählen oder erstellen Sie eine geeignete Kennung, um die zu prüfende Maus zu beschreiben. Um das direkt gekoppelte Elektroretinogrammprotokoll auszuwählen, klicken Sie auf Protokolle und wählen Sie DC-ERG aus.Klicken Sie auf Ausführen. Ein Dialogfeld mit den Patienteninformationen wird angezeigt. Wenn die Informationen korrekt sind, klicken Sie auf Ja, und fahren Sie mit Den Schritten von sechs fort.Schließen Sie die Türen zum Faraday-Käfig, und klicken Sie auf Impedanz, um den Impedanzmodus anzuzeigen. Stellen Sie sicher, dass die Werte für mundbezogen, Schwanzmasse und Aufzeichnungselektroden akzeptabel sind, und klicken Sie auf Schritt, um mit Schritt vier von sechs fortzufahren, um die Ausgangsstabilität zu testen. Um mit der Anzeige der Ablaufverfolgungen zu beginnen, klicken Sie auf Vorschau.Die Spuren sollten mit einer Spitzen-zu-Spitzen-Amplitude von weniger als 200 Mikrovolt gering sein. Um die Maus und die Elektroden für ein Experiment zu positionieren, befeuchten Sie die Hornhaut einer sedierten Maus mit einem Tropfen von 5%proparacainischer Salzsäure, bevor Sie die Hornhaut mit einem Tropfen von 2,5% Phenylephrin HCL und 5% Tropicamid erweitern. Überprüfen Sie in der ERG-Systemsoftware, ob der richtige Patient ausgewählt ist.Klicken Sie auf Protokolle. Wählen Sie unter Protokollbeschreibung DC-ERG aus, und klicken Sie auf Ausführen. Klicken Sie auf Ja, um zu überprüfen, ob der richtige Test durchgeführt wird.Verwenden Sie Schritt eins von sechs, um ein dim rotes Licht in der Kuppel einzuschalten und die Maus auf einen beheizten Aufnahmetisch zu legen. Verwenden Sie Zange, um die Haut des hinteren Beins vorsichtig zu zelten. Und mit einer Hand, um die Nadelelektrode fest zu halten, verwenden Sie die andere Hand, um die Elektrode subkutan in das hintere Bein einzufügen, um die Elektrode an Ort und Stelle zu befestigen.Legen Sie die Referenzsilber, Silberchloridelektrode in den Mund des Tieres, so dass das zentrierte Pellet entlang der hinteren Wange ruht und hinter den Zähnen gehalten wird. Bevor Sie die Kapillarelektroden auf das Auge legen, positionieren Sie den Elektrodenhalter mit den vertikal ausgerichteten Glaskapillaren und streichen Sie den Elektrodenhalter mit einem Zeigefinger, um eventuelle Blasen zu entfernen. Verwenden Sie eine 25-Spur-Nadel, um die Kapillarspitzen mit HBSS zu füllen und die Kapillaren zu inspizieren, um sicherzustellen, dass keine Luftblasen in den Spitzen gefangen sind.Positionieren Sie den Elektrodenhaltersoals so, dass die offenen Spitzen der HBSS-gefüllten Kapillaren in schonendem Kontakt mit der Hornhaut stehen. Und achten Sie darauf, blasen zu vermeiden, invertieren Sie den Schmierauge-Gelspender, um die ersten Tropfen zu entsorgen. Legen Sie dann einen Tropfen Schmiermittel-Augengel auf jedes Auge, um die Leitfähigkeit aufrechtzuerhalten und die Austrocknung während der Aufnahme zu verhindern.Um die DC-ERGs aufzuzeichnen, klicken Sie auf Schritt fünf, um Schritt fünf von sechs auszuwählen, und klicken Sie auf Impedanz, um den Bildschirm zur Impedanzüberprüfung zu verwenden, um die Widerstände der linken und rechten Augen zu untersuchen. Die Impedanzwerte für die Aufnahmeelektroden an jedem Auge sollten ähnlich sein. Und die Impedanzwerte für die Boden- und Referenzelektroden sollten weniger als 10 Kilohm sein.Klicken Sie auf Vorschau, um die Spuren für die linke und rechte Augen anzuzeigen, und warten Sie bis zu 10 Minuten, bis eine stabile Basislinie erreicht wird. Klicken Sie dann auf Beenden, um die Ablaufverfolgungsvorschau zu beenden, und klicken Sie auf Ausführen, um die Aufzeichnung zu starten. Hier wird ein Beispiel-Dataset von bedingten Knockout- und Wildtyp-Mäusen gezeigt.Bei dieser Analyse litt die Spur unter winzigen Blasen in der Elektrode. Es erhöhte den Spitzenlärm in der Spur. In einer separaten Analyse wurden die Blasen mit hilfe der Vakuumkammer eliminiert, bevor die Mikroelektroden im Elektrodenhalterständer montiert wurden.Die am besten passenden Linien zu den ersten 25 Sekunden können berechnet werden, so dass die driftkorrigierten Antworten nachgezeichnet und die Amplituden der DC-ERG-Komponenten identifiziert werden können. Wie erwartet dämft eine reduzierte Expression von Kur7.1 Kaliumkanälen im RPE die c-Welle und die schnelle Schwingung stark, was auf eine signifikante Beeinträchtigung der elektrischen Eigenschaften des retinalen Pigmentepithels hindeutet. Hier werden die relativen Amplituden der DC-ERG-Komponenten gezeigt, die auf Wildtyp normalisiert und gegen die relativ en beiden größten lichtevokierten A-Wellen-Amplituden geplottet werden.Diese Form der Analyse kann bestimmen, ob die reduzierten elektrischen Reaktionen des RPE allein durch die Verringerung der Photorezeptoraktivität berücksichtigt werden können. Oder wenn ein zugrunde liegender Defekt aus dem RPE stammt. Denken Sie daran, eine stabile Ausgangsbasis zu erreichen, bevor Sie zur Mausaufnahme übergehen, und die Elektroden regelmäßig auf Blasen überprüfen, die möglicherweise eingeführt wurden.Dunkel angepasste ERGs können vor dem DC-ERG aufgezeichnet werden, um die kegelgesteuerte Netzhautfunktion zu messen. Lichtangepasste ERGs können auch nach dem DC-ERG durchgeführt werden, um die kegelgesteuerten Netzhautreaktionen zu bewerten.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium

LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations

LabVIEW-betriebenen Novel Nanoliter Osmometer für Ice Binding Protein Untersuchungen

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition ...

Forschung

Chemie

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Produktion von Disulfid-stabilisierte Transmembrane Peptid-Komplexe für Structural Studies

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

A High-throughput-compatible FRET-based Platform for Identification and Characterization of Botulinum Neurotoxin Light Chain Modulators

Botulinum neurotoxin (BoNT) is a potent and potentially lethal bacterial toxin that binds to host motor neurons, is internalized into the cell, and ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Bildung geordneter Strukturen Biomolekulare durch die Selbstorganisation von kurzen Peptiden

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Optimization of Synthetic Proteins: Identification of Interpositional Dependencies Indicating Structurally and/or Functionally Linked Residues

Optimierung der synthetische Proteine: Bezeichnung interpositional Abhängigkeiten Anzeige- strukturell und / oder funktionell verknüpft Rückstände

Protein alignments are commonly used to evaluate the similarity of protein residues, and the derived consensus sequence used for identifying functional ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthese von Protein Biokonjugate<em&gt; über</em&gt; Cystein-maleimid Chemie

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Einfache Synthese von wurmartigen Mizellen durch sichtbares Licht Mediated Dispersion Polymerisation mit Photoredox Katalysator

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Mit Hilfe der Kapillarelektrophorese organischen Säuren aus Pflanzengewebe zu beziffern: ein Test Untersuchen<em&gt; Coffea arabica</em&gt; Saatgut

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

Einblicke in die Wechselwirkungen von Aminosäuren und Peptide mit anorganischen Materialien Verwendung von Einzelmolekülkraftspektroskopie

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...