Name: direct-coupled electroretinogram (dc-erg) for recording the light-evoked electrical responses of the mouse retinal pigment epithelium
Uploaded: 2020-07-14T12:30:00
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Questo lavoro è stato sostenuto da fondi intramurali NEI. Gli autori riconoscono sinceramente il Dr. Sheldon Miller per la sua guida scientifica, consulenza tecnica e competenza nella fisiologia e nelle malattie RPE. Gli autori ringraziano Megan Kopera e lo staff di cura degli animali per la gestione delle colonie di topi, e il Dr. Tarun Bansal, Raymond Zhou e Yuan Wang per il supporto tecnico.

Questo protocollo segue le linee guida per la cura degli animali delineate nel protocollo di studio sugli animali approvato dal Comitato per la cura e l'uso degli animali del National Eye Institute.
1. Importazione di protocolli di stimolazione della luce per DC-ERG
NOTA: Seguire le istruzioni riportate di seguito per importare i protocolli di stimolazione della luce per il DC-ERG nel software del sistema ERG(Table of Materials). Il protocollo consist...

<ol>
	<li>Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+the+retinal+pigment+epithelium+and+the+neural+retina.">Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina.</a> Documenta Ophthalmologica. 60 (4), 327-346 (1985).</li><li>Sahu, B., Maeda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPE+Visual+Cycle+and+Biochemical+Phenotypes+of+Mutant+Mouse+Models.">RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models.</a> Methods in Molecular Biology. 1753, 89-102 (2018).</li><li>Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis:+use+and+utility+of+RPE+cells+in+culture.">Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture.</a> Experimental Eye Resarch. 126, 51-60 (2014).</li><li>Wimmers, S., Karl, M. O., Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+in+the+RPE.">Ion channels in the RPE.</a> Progress in Retinal Eye Research. 26 (3), 263-301 (2007).</li><li>Gundersen, D., Orlowski, J., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+polarity+of+Na,K-ATPase+in+retinal+pigment+epithelium+is+linked+to+a+reversal+of+the+ankyrin-fodrin+submembrane+cytoskeleton.">Apical polarity of Na,K-ATPase in retinal pigment epithelium is linked to a reversal of the ankyrin-fodrin submembrane cytoskeleton.</a> Journal of Cell Biology. 112 (5), 863-872 (1991).</li><li>Fletcher, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+age-related+macular+degeneration+using+animal+models.">Studying age-related macular degeneration using animal models.</a> Optometry and Vision Science. 91 (8), 878-886 (2014).</li><li>Gu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+RPE65+cause+autosomal+recessive+childhood-onset+severe+retinal+dystrophy.">Mutations in RPE65 cause autosomal recessive childhood-onset severe retinal dystrophy.</a> Nature Genetics. 17 (2), 194-197 (1997).</li><li>Marlhens, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+RPE65+cause+Leber's+congenital+amaurosis.">Mutations in RPE65 cause Leber's congenital amaurosis.</a> Nature Genetics. 17 (2), 139-141 (1997).</li><li>Marmorstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=the+product+of+the+Best+vitelliform+macular+dystrophy+gene+(VMD2),+localizes+to+the+basolateral+plasma+membrane+of+the+retinal+pigment+epithelium.">the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).</li><li>Chang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+studies+of+retinal+degeneration+and+diseases.">Mouse models for studies of retinal degeneration and diseases.</a> Methods in Molecular Biology. 935, 27-39 (2013).</li><li>Collin, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+Inherited+Retinal+Degeneration+with+Photoreceptor+Cell+Loss.">Mouse Models of Inherited Retinal Degeneration with Photoreceptor Cell Loss.</a> Cells. 9 (4), (2020).</li><li>Shrock, E., G&#252;ell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+in+Animals+and+Animal+Models.">CRISPR in Animals and Animal Models.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 152, 95-114 (2017).</li><li>Smalley, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+mouse+model+boom,+rat+model+renaissance.">CRISPR mouse model boom, rat model renaissance.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 893-894 (2016).</li><li>Benchorin, G., Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Vollrath, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Murine+Retinal+Function+by+Electroretinography.">Assessment of Murine Retinal Function by Electroretinography.</a> Bio Protocol. 7 (7), (2017).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+phagolysosomal+activity+by+miR-204+critically+influences+structure+and+function+of+retinal+pigment+epithelium/retina.">Regulation of phagolysosomal activity by miR-204 critically influences structure and function of retinal pigment epithelium/retina.</a> Human Molecular Genetics. 28 (20), 3355-3368 (2019).</li><li>Samuels, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+responses+of+the+retinal+pigment+epithelium:+changes+accompanying+photoreceptor+loss+in+the+mouse.">Light-evoked responses of the retinal pigment epithelium: changes accompanying photoreceptor loss in the mouse.</a> Journal of Neurophysiology. 104 (1), 391-402 (2010).</li><li>Wu, J., Marmorstein, A. D., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+abnormalities+in+the+retinal+pigment+epithelium+of+CFTR+mutant+mice.">Functional abnormalities in the retinal pigment epithelium of CFTR mutant mice.</a> Experimental Eye Research. 83 (2), 424-428 (2006).</li><li>Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+responses+of+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).</li><li>Peachey, N. S., Stanton, J. B., Marmorstein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+recording+and+response+characteristics+of+the+rat+dc-electroretinogram.">Noninvasive recording and response characteristics of the rat dc-electroretinogram.</a> Visual Neuroscience. 19 (6), 693-701 (2002).</li><li>Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+retinal+pigment+epithelium+dysfunction+is+concomitant+with+hyperglycemia+in+mouse+models+of+type+1+and+type+2+diabetes.">Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).</li><li>Marmorstein, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light+peak+of+the+electroretinogram+is+dependent+on+voltage-gated+calcium+channels+and+antagonized+by+bestrophin+(best-1).">The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1).</a> Journal of General Physiology. 127 (5), 577-589 (2006).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invest.+Ophtalmol.+Vis.+Sci.">Invest. Ophtalmol. Vis. Sci.</a> Annual Meeting for the Association for Research in Vision and Ophthalmology. , 3568 (2017).</li><li>Iacovelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Cre+transgenic+mice+with+postnatal+RPE-specific+ocular+expression.">Generation of Cre transgenic mice with postnatal RPE-specific ocular expression.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1378-1383 (2011).</li><li>Wang, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-204/211+alters+epithelial+physiology.">MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology.</a> FASEB Journal. 24 (5), 1552-1571 (2010).</li><li>He, L., Marioutina, M., Dunaief, J. L., Marneros, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-+and+gene-dosage-dependent+cre-induced+abnormalities+in+the+retinal+pigment+epithelium.">Age- and gene-dosage-dependent cre-induced abnormalities in the retinal pigment epithelium.</a> American Journal of Pathology. 184 (6), 1660-1667 (2014).</li><li>Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+modulation+of+basolateral+membrane+Cl-+conductance+in+chick+retinal+pigment+epithelium:+the+light+peak+and+fast+oscillation.">Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation.</a> Journal of Neurophysiology. 70 (4), 1669-1680 (1993).</li><li>Blaug, S., Quinn, R., Quong, J., Jalickee, S., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelial+function:+a+role+for+CFTR.">Retinal pigment epithelial function: a role for CFTR.</a> Documenta Ophthalmologica. 106 (1), 43-50 (2003).</li><li>Gallemore, R. P., Griff, E. R., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+in+support+of+a+photoreceptoral+origin+for+the+"light-peak+substance".">Evidence in support of a photoreceptoral origin for the "light-peak substance".</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (4), 566-571 (1988).</li><li>Shahi, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+Electroretinogram+after+Kir7.1+Channel+Suppression+Suggests+Role+in+Retinal+Electrophysiology.">Abnormal Electroretinogram after Kir7.1 Channel Suppression Suggests Role in Retinal Electrophysiology.</a> Science Reports. 7 (1), 10651 (2017).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+human+RPE65+P25L+hypomorph+resembles+wild+type+under+normal+light+rearing+but+is+fully+resistant+to+acute+light+damage.">Mouse model of human RPE65 P25L hypomorph resembles wild type under normal light rearing but is fully resistant to acute light damage.</a> Human Molecular Genetics. 24 (15), 4417-4428 (2015).</li></ol>

Passaggi critici
Una buona registrazione DC-ERG richiede elettrodi stabili che sono liberi da bolle che creano artefatti e deriva indesiderata in quanto sono estremamente sensibili al degassamento e alle variazioni di temperatura. È essenziale che si ottiene una linea di base stabile quando gli elettrodi vengono posizionati nella soluzione da bagno HBSS prima di procedere con la registrazione del mouse. Piccole bolle tendono a raccogliere alla base dell'elettrodo capillare o ...

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) è un monostrato di cellule specializzate che allineano il segmento posteriore dell'occhio ed esercitano funzioni critiche per mantenere l'omeostasi retinica1. L'RPE supporta i fotorecettori rigenerando il loro pigmento visivo che cattura fotoni in un processo chiamato ciclovisivo 2,partecipando alla fagocitosi diurna delle punte del segmentoesterno capannone 3,e nel trasporto di nutrienti e prodotti metabolici tra fotorecettori e coriocapillaris4,5. Le anomalie nella funzione RPE sono alla base di numerose malattie della retina umana, come la degenerazione maculare legata all'età6,l'amaurosi congenita di Leber7,8 e la migliore distrofia maculare vitelliforme9. Poiché i tessuti oculari del donatore sono spesso difficili da ottenere esclusivamente a scopo di ricerca, i modelli animali con modifiche genetiche possono fornire un modo alternativo per studiare lo sviluppo di malattie retiniche10,11. Inoltre, l'emergere e l'applicazione della tecnologia CRISPR cas9 consente ora l'introduzione genomica (knock-in) o le eliminazioni (knock-out) in un processo semplice in una sola fase che supera i limiti delle precedenti tecnologie di targeting genico12. Il boom nella disponibilità di nuovi modelli di mouse13 richiede un protocollo di registrazione più efficiente per valutare in modo non invasivo la funzione RPE.
La misurazione delle risposte elettriche evocate dalla luce dell'RPE può essere ottenuta utilizzando una tecnica di elettroretinogramma ad accoppiamento diretto (DC-ERG). Se utilizzato in combinazione con registrazioni ERG convenzionali che misurano le risposte cellulari fotorecettore (a-onda) e bipolare (onda b)14, il DC-ERG può definire come cambiano le proprietà di risposta dell'RPE con la degenerazione retinica15,16,17 o se la disfunzione RPE precede la perdita del fotorecettore. Questo protocollo descrive un metodo adattato dal lavoro di Marmorstein, Peachey e colleghi che per primi hanno sviluppato la tecnica DC-ERG16,18,19,20 e migliora la riproducibilità e la facilità d'uso.
La registrazione DC-ERG è difficile da eseguire a causa del lungo tempo di acquisizione (9 min) durante il quale qualsiasi interruzione o introduzione del rumore può complicare l'interpretazione dei dati. Il vantaggio di questo nuovo metodo è che le linee di base raggiungono lo stato stazionario in un lasso di tempo più breve riducendo la probabilità che l'animale si svegli prematuramente dall'anestesia ed è meno incline alla formazione di bolle negli elettrodi capillari.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ag/AgCl (mouth) Electrode</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>EP1</td>
			<td>Mouth reference electrode for mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Tile</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>CTS</td>
			<td>Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Cleaning Stick</td>
			<td>Puritan Medical Products</td>
			<td>867-WC No Glue</td>
			<td>To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroretinogram (ERG) System</td>
			<td>Diagnosys LLC</td>
			<td>E3 System</td>
			<td>Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen Burner</td>
			<td>Argos Technologies</td>
			<td>BW20002460</td>
			<td>Or equivlaent to shape glass under flame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary Tube (1.5 mm)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF150-75</td>
			<td>For filling with HBSS and making contact to the cornea</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Buffered Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>14175-095</td>
			<td>Commercially available. Maintain at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Line Filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>6722-5001</td>
			<td>To protect vacuum pump from aerosols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Noise Cable for Microelectrode Holders</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>5372</td>
			<td>Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Ball Joint</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>500871</td>
			<td>For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>MatLab: For editing the analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab Curvefit Toolbox</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab Compiler</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab Runtime version 9.5</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2018b (9.5)</td>
			<td>Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Holders (45 degrees)</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>MEH345-15</td>
			<td>For holding the capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle (25 ga)</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8881250313</td>
			<td>For filling the capillary tubes with HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle (ground) electrode</td>
			<td>Rhythmlink</td>
			<td>13mm - one elctrode</td>
			<td>Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regulator/Power Conditioner</td>
			<td>Furman</td>
			<td>P-1800</td>
			<td>Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (12 mL)</td>
			<td>Monoject</td>
			<td>1181200777</td>
			<td>For filling the capillary tubes with HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-clip</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06852-20</td>
			<td>For electrode holder assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>420120000</td>
			<td>Clear polycarbonate bottom &#38; cover</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmacological treatment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant eye gel</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>0078-0429-47</td>
			<td>Helps lubricates corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine Hydrochloride 2.5%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>17478-201-15</td>
			<td>Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proparacaine Hydrochloride 0.5%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>17478-263-12</td>
			<td>Local anesthetic for ophthalmic instillation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide 0.5%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>17478-101-12</td>
			<td>Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>AnaSed</td>
			<td>sc-362949Rx</td>
			<td>Analgesic and muscle relaxant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetamine (Ketamine HCl)</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>501072</td>
			<td>Anesthetic for intramuscular injections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct-coupled electroretinogram (dc-erg) for recording the light-evoked electrical responses of the mouse retinal pigment epithelium

L'epitelio pigmentato retinico (RPE) è un monostrato specializzato di cellule strategicamente situate tra la retina e il coriocapillaris che mantengono la salute generale e l'integrità strutturale dei fotorecettori. L'RPE è polarizzato, esibendo recettori o canali localizzati in modo apico e basale, ed esegue il trasporto vettoriale di acqua, ioni, metaboliti e secenere diverse citochine.
Le misurazioni nonive in vivo della funzione RPE possono essere effettuate utilizzando ENG ad accoppiamento diretto (DC-ENG). La metodologia alla base del DC-ERG è stata introdotta da Marmorstein, Peachey e colleghi che utilizzano un sistema di registrazione della stimolazione personalizzato e in seguito ha dimostrato di utilizzare un sistema disponibile in commercio. La tecnica DC-ERG utilizza capillari di vetro riempiti con la soluzione di sale tamponato (HBSS) di Hank per misurare le risposte elettriche più lente dell'RPE suscitate dai cambiamenti di concentrazione evocati dalla luce nello spazio subretinale a causa dell'attività del fotorecettore. Lo stimolo luminoso prolungato e la lunghezza della registrazione DC-ERG lo rendono vulnerabile alla deriva e al rumore con conseguente bassa resa di registrazioni utilizzabili. Qui presentiamo un metodo rapido e affidabile per migliorare la stabilità delle registrazioni riducendo al contempo il rumore utilizzando la pressione del vuoto per ridurre / eliminare le bolle derivanti dal degassamento dell'HBSS e del supporto per elettrodi. Inoltre, gli artefatti della linea elettrica vengono attenuati utilizzando un regolatore di tensione / condizionatore di potenza. Includiamo i protocolli di stimolazione della luce necessari per un sistema ERG disponibile in commercio e script per l'analisi dei componenti DC-ERG: onda c, oscillazione rapida, picco di luce e risposta off. Grazie alla migliore facilità di registrazione e al flusso di lavoro di analisi rapida, questo protocollo semplificato è particolarmente utile per misurare i cambiamenti legati all'età nella funzione RPE, nella progressione della malattia e nella valutazione dell'intervento farmacologico.

La figura 2 è un set di dati di esempio di mouse miR-204 ko/ko cre/+ (KO condizionale) e di tipo selvaggio (WT). MiR-204 ko/ko cre/+ sono topi con un knockout condizionale di microRNA 204 nell'epitelio pigmentato retinico. Questi topi sono generati incrociando topi miR-204 floxed (prodotti da NEIGEF)22 con topi VMD2-CRE23. MiR-204 è altamente espresso nell'RPE dove regola l'espressione di proteine critiche per la funzione epiteliale che mante...

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Direct-Coupled Electroretinogram DC-ERG for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Qui, presentiamo un metodo per registrare le risposte elettriche evocate dalla luce dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) nei topi usando una tecnica nota come DC-ENG descritta per la prima volta da Marmorstein, Peachey e colleghi nei primi anni 2000.

Elettroretinogramma ad accoppiamento diretto (DC-ERG) per la registrazione delle risposte elettriche evocate dalla luce dell'epitelio pigmentato retinico del mouse

The retinal pigment epithelium (RPE) is a specialized monolayer of cells strategically located between the retina and the choriocapillaris that maintain ...

La tecnica DC-ERG può essere utilizzata per la valutazione non evasiva della funzione dell'epitelio pigmentato retinico per monitorare i cambiamenti legati all'età o la progressione della malattia e per valutare gli effetti dell'intervento farmacologico. Questa tecnica migliora la capacità di riproduzione di DC-ERG e la facilità d'uso semplificando la preparazione dell'elettrodo capillare. Può anche essere integrato con un'applicazione software ohm standard per facilitare l'analisi.Inizia facendo scorrere con cura un ago per siringhe calibro 25 attraverso la guarnizione in gomma siliconica verso la parete posteriore del supporto dell'elettrodo. Riempire la base del supporto dell'elettrodo con HBSS degassato mentre si ritrae lentamente l'ago, facendo attenzione a non introdurre bolle e sostituire il cappuccio filettato senza serraggio. Reinserire l'ago della siringa per riempire lo spazio vuoto all'interno dello spazio con HBSS e tenere il capillare orizzontalmente durante il riempimento per evitare che la soluzione fuorievi dall'altra estremità.Afferrando il capillare riempito all'estremità piegata, inserire lentamente l'altra estremità attraverso il cappuccio allentato e stringere il tappo della vite in posizione. Inclinare i supporti degli elettrodi con gli elettrodi capillari rivolti verso l'alto per consentire a eventuali bolle di fluire e degasare i capillari in una camera a vuoto per cinque-10 minuti. Quindi, rilasciare lentamente il vuoto e riempire i supporti degli elettrodi e i capillari di vetro, come dimostrato.Per creare un supporto personalizzato per il supporto in microelettrodi, rimuovere le clip poliacetali nere da un lato di una clip a T numero otto e utilizzare una base cilindrica con giunti a sfera magnetica lavorati a metà per regolare l'altezza. Fissare le clip a T modificate alle viti di montaggio a sfera magnetica con dadi di dimensioni M3 e uno scivolo in una maniglia in legno affusolata da circa un pollice, modificata da un bastoncino per la pulizia della punta di cotone, nel supporto con un angolo per fissare il supporto in microelettrode nel supporto del giunto a sfera magnetica a clip a T su misura. Quindi, utilizzare la base del cilindro dei magneti a terre rare per posizionare in modo sicuro il supporto dell'elettrodo personalizzato sulla piastra metallica dello stadio, consentendo una rotazione a 360 gradi su un asse di 180 gradi.Per eseguire un test degli elettrodi, in primo luogo, abbassare delicatamente i microelettrodi capillari riempiti di HBSS completamente assemblati in un piccolo contenitore di HBSS. Posizionare l'elettrodo a terra dell'ago e l'elettrodo di riferimento a pellet centrato sul cloruro d'argento argento nello stesso HBSS per completare il circuito e selezionare o creare un identificatore appropriato per descrivere il mouse da testare. Per selezionare il protocollo di elettroretinogramma ad accoppiamento diretto da eseguire, fare clic sui protocolli e selezionare DC-ERG.Fare clic su Esegui. Verrà visualizzata una finestra di dialogo con le informazioni sul paziente. Se le informazioni sono corrette, fare clic su sì e procedere ai passaggi uno dei sei.Chiudere le porte della gabbia di Faraday e fare clic sull'impedenza per visualizzare la modalità di impedenza. Verificare che i valori per gli elettrodi di riferimento della bocca, della coda e della registrazione siano accettabili e fare clic sul passaggio per procedere al passaggio quattro di sei per testare la stabilità della linea di base. Per iniziare a visualizzare le tracce, fare clic su anteprima.Le tracce dovrebbero essere a basso rumore con un'ampiezza da picco a picco inferiore a 200 microvolt. Per posizionare il topo e gli elettrodi per un esperimento, anestetizzare la cornea di un topo sedato con una goccia di acido cloridrico di proparacaina al 5% prima di dilatare la cornea con una goccia del 2,5% di fenilefrina HCL e del 5%tropicamide. Nel software di sistema ERG verificare che sia selezionato il paziente corretto.Fare clic sui protocolli. In Descrizione protocollo selezionare DC-ERG e fare clic su Esegui. Fare clic su sì per verificare che venga eseguito il test corretto.Utilizzare il passaggio uno dei sei per accendere una luce rossa fioca all'interno della cupola e posizionare il mouse su un tavolo di registrazione riscaldato. Utilizzare le forcep per tendare con cura la pelle della gamba posteriore. E usando una mano per tenere saldamente l'elettrodo dell'ago, utilizzare l'altra mano per inserire l'elettrodo per via sottocutanea nella gamba posteriore per fissare l'elettrodo in posizione.Posizionare l'elettrodo di riferimento in argento, cloruro d'argento nella bocca dell'animale in modo che il pellet centrato poggia lungo la guancia posteriore e sia tenuto in posizione dietro i denti. Prima di posizionare gli elettrodi capillari sull'occhio, posizionare il supporto dell'elettrodo con i capillari di vetro orientati verticalmente e far scorrere il supporto dell'elettrodo con un dito indice per rimuovere eventuali bolle che potrebbero essere state introdotte. Utilizzare un ago calibro 25 per riempire le punte capillari con HBSS e ispezionare i capillari per assicurarsi che non ci siano bolle d'aria intrappolate nelle punte.Posizionare il supporto dell'elettrodo in modo che le punte aperte dei capillari riempiti di HBSS siano a contatto delicato con la cornea. E facendo attenzione a evitare di introdurre bolle, invertire il distributore di gel per gli occhi lubrificante per scartare le gocce iniziali. Quindi, posizionare una goccia di gel per gli occhi lubrificante su ogni occhio per mantenere la conducibilità e prevenire l'essiccazione durante la registrazione.Per registrare i DC-ENG, fate clic su passo per selezionare il passaggio cinque di sei e fate clic sull'impedenza per utilizzare la schermata di controllo dell'impedenza per esaminare le resistenze degli occhi sinistro e destro. I valori di impedenza per gli elettrodi di registrazione ad ogni occhio dovrebbero essere simili. E i valori di impedenza sia per gli elettrodi di terra che per quelli di riferimento dovrebbero essere inferiori a 10 kilohm.Fare clic sull'anteprima per visualizzare le tracce per gli occhi sinistro e destro e attendere fino a 10 minuti per ottenere una linea di base stabile. Quindi, fare clic su Interrompi per uscire dall'anteprima di traccia e fare clic su Esegui per avviare la registrazione. Qui viene mostrato un set di dati di esempio da topi knockout condizionali e di tipo selvaggio.In questa analisi, la traccia soffriva di bolle minute nell'elettrodo. Ha aumentato il rumore da picco a picco nella traccia. In un'analisi separata, le bolle sono state eliminate utilizzando la camera a vuoto prima di assemblare i microelettrodi all'interno delle supporti del supporto dell'elettrodo.È possibile calcolare le linee di adattamento migliori ai 25 secondi iniziali, consentendo di rilotizzare le risposte corrette dalla deriva e di identificare le ampiezze dei componenti DC-ERG. Come previsto, la ridotta espressione di cura 7,1 canali di potassio nell'RPE attenua notevolmente l'onda c e l'oscillazione rapida, indicando una significativa compromissione delle proprietà elettriche dell'epitelio pigmentato retinico. Qui, vengono mostrate le ampiezze relative dei componenti DC-ERG, normalizzate a tipo selvaggio e tracciate contro le due più grandi ampiezze a-onda evocate dalla luce.Questa forma di analisi può determinare se le risposte elettriche ridotte dell'RPE possono essere prese in considerazione solo dalla riduzione dell'attività del fotorecettore. O se c'è un difetto sottostante che ha origine nell'RPE. Ricordarsi di ottenere una linea di base stabile prima di passare alla registrazione del mouse e di ispezionare periodicamente gli elettrodi alla ricerca di bolle che potrebbero essere state introdotte.Gli ERG adattati al buio possono essere registrati prima del DC-ERG per misurare la funzione retinica guidata dal cono. Gli ERG adattati alla luce possono anche essere eseguiti dopo il DC-ERG per valutare le risposte retiniche guidate dal cono.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium

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Ricerca

Chimica

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