Name: direct-coupled electroretinogram (dc-erg) for recording the light-evoked electrical responses of the mouse retinal pigment epithelium
Uploaded: 2020-07-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct-Coupled Electroretinogram DC-ERG for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av NEI intramural midler. Forfatterne anerkjenner oppriktig Dr. Sheldon Miller for hans vitenskapelige veiledning, tekniske råd og ekspertise innen RPE fysiologi og sykdom. Forfatterne takker Megan Kopera og dyrepleiepersonalet for å administrere musekoloniene, og Dr. Tarun Bansal, Raymond Zhou og Yuan Wang for teknisk støtte.

Denne protokollen følger retningslinjene for dyrepleie som er beskrevet i dyrestudieprotokollen godkjent av Dyreverns- og brukskomiteen ved National Eye Institute.
1. Importere lysstimuleringsprotokoller for DC-ERG
MERK: Følg instruksjonene nedenfor for å importere lysstimuleringsprotokollene for DC-ERG til ERG-systemprogramvaren (Materials tabell). Protokollen består av et intervall på 0,5 min før stimulans, etterfulgt av et lystrinn (10 cd/m<s...

<ol>
	<li>Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+the+retinal+pigment+epithelium+and+the+neural+retina.">Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina.</a> Documenta Ophthalmologica. 60 (4), 327-346 (1985).</li><li>Sahu, B., Maeda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPE+Visual+Cycle+and+Biochemical+Phenotypes+of+Mutant+Mouse+Models.">RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models.</a> Methods in Molecular Biology. 1753, 89-102 (2018).</li><li>Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis:+use+and+utility+of+RPE+cells+in+culture.">Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture.</a> Experimental Eye Resarch. 126, 51-60 (2014).</li><li>Wimmers, S., Karl, M. O., Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+in+the+RPE.">Ion channels in the RPE.</a> Progress in Retinal Eye Research. 26 (3), 263-301 (2007).</li><li>Gundersen, D., Orlowski, J., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+polarity+of+Na,K-ATPase+in+retinal+pigment+epithelium+is+linked+to+a+reversal+of+the+ankyrin-fodrin+submembrane+cytoskeleton.">Apical polarity of Na,K-ATPase in retinal pigment epithelium is linked to a reversal of the ankyrin-fodrin submembrane cytoskeleton.</a> Journal of Cell Biology. 112 (5), 863-872 (1991).</li><li>Fletcher, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+age-related+macular+degeneration+using+animal+models.">Studying age-related macular degeneration using animal models.</a> Optometry and Vision Science. 91 (8), 878-886 (2014).</li><li>Gu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+RPE65+cause+autosomal+recessive+childhood-onset+severe+retinal+dystrophy.">Mutations in RPE65 cause autosomal recessive childhood-onset severe retinal dystrophy.</a> Nature Genetics. 17 (2), 194-197 (1997).</li><li>Marlhens, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+RPE65+cause+Leber's+congenital+amaurosis.">Mutations in RPE65 cause Leber's congenital amaurosis.</a> Nature Genetics. 17 (2), 139-141 (1997).</li><li>Marmorstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=the+product+of+the+Best+vitelliform+macular+dystrophy+gene+(VMD2),+localizes+to+the+basolateral+plasma+membrane+of+the+retinal+pigment+epithelium.">the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).</li><li>Chang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+studies+of+retinal+degeneration+and+diseases.">Mouse models for studies of retinal degeneration and diseases.</a> Methods in Molecular Biology. 935, 27-39 (2013).</li><li>Collin, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+Inherited+Retinal+Degeneration+with+Photoreceptor+Cell+Loss.">Mouse Models of Inherited Retinal Degeneration with Photoreceptor Cell Loss.</a> Cells. 9 (4), (2020).</li><li>Shrock, E., G&#252;ell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+in+Animals+and+Animal+Models.">CRISPR in Animals and Animal Models.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 152, 95-114 (2017).</li><li>Smalley, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+mouse+model+boom,+rat+model+renaissance.">CRISPR mouse model boom, rat model renaissance.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 893-894 (2016).</li><li>Benchorin, G., Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Vollrath, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Murine+Retinal+Function+by+Electroretinography.">Assessment of Murine Retinal Function by Electroretinography.</a> Bio Protocol. 7 (7), (2017).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+phagolysosomal+activity+by+miR-204+critically+influences+structure+and+function+of+retinal+pigment+epithelium/retina.">Regulation of phagolysosomal activity by miR-204 critically influences structure and function of retinal pigment epithelium/retina.</a> Human Molecular Genetics. 28 (20), 3355-3368 (2019).</li><li>Samuels, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+responses+of+the+retinal+pigment+epithelium:+changes+accompanying+photoreceptor+loss+in+the+mouse.">Light-evoked responses of the retinal pigment epithelium: changes accompanying photoreceptor loss in the mouse.</a> Journal of Neurophysiology. 104 (1), 391-402 (2010).</li><li>Wu, J., Marmorstein, A. D., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+abnormalities+in+the+retinal+pigment+epithelium+of+CFTR+mutant+mice.">Functional abnormalities in the retinal pigment epithelium of CFTR mutant mice.</a> Experimental Eye Research. 83 (2), 424-428 (2006).</li><li>Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+responses+of+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).</li><li>Peachey, N. S., Stanton, J. B., Marmorstein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+recording+and+response+characteristics+of+the+rat+dc-electroretinogram.">Noninvasive recording and response characteristics of the rat dc-electroretinogram.</a> Visual Neuroscience. 19 (6), 693-701 (2002).</li><li>Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+retinal+pigment+epithelium+dysfunction+is+concomitant+with+hyperglycemia+in+mouse+models+of+type+1+and+type+2+diabetes.">Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).</li><li>Marmorstein, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light+peak+of+the+electroretinogram+is+dependent+on+voltage-gated+calcium+channels+and+antagonized+by+bestrophin+(best-1).">The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1).</a> Journal of General Physiology. 127 (5), 577-589 (2006).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invest.+Ophtalmol.+Vis.+Sci.">Invest. Ophtalmol. Vis. Sci.</a> Annual Meeting for the Association for Research in Vision and Ophthalmology. , 3568 (2017).</li><li>Iacovelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Cre+transgenic+mice+with+postnatal+RPE-specific+ocular+expression.">Generation of Cre transgenic mice with postnatal RPE-specific ocular expression.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1378-1383 (2011).</li><li>Wang, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-204/211+alters+epithelial+physiology.">MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology.</a> FASEB Journal. 24 (5), 1552-1571 (2010).</li><li>He, L., Marioutina, M., Dunaief, J. L., Marneros, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-+and+gene-dosage-dependent+cre-induced+abnormalities+in+the+retinal+pigment+epithelium.">Age- and gene-dosage-dependent cre-induced abnormalities in the retinal pigment epithelium.</a> American Journal of Pathology. 184 (6), 1660-1667 (2014).</li><li>Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+modulation+of+basolateral+membrane+Cl-+conductance+in+chick+retinal+pigment+epithelium:+the+light+peak+and+fast+oscillation.">Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation.</a> Journal of Neurophysiology. 70 (4), 1669-1680 (1993).</li><li>Blaug, S., Quinn, R., Quong, J., Jalickee, S., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelial+function:+a+role+for+CFTR.">Retinal pigment epithelial function: a role for CFTR.</a> Documenta Ophthalmologica. 106 (1), 43-50 (2003).</li><li>Gallemore, R. P., Griff, E. R., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+in+support+of+a+photoreceptoral+origin+for+the+"light-peak+substance".">Evidence in support of a photoreceptoral origin for the "light-peak substance".</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (4), 566-571 (1988).</li><li>Shahi, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+Electroretinogram+after+Kir7.1+Channel+Suppression+Suggests+Role+in+Retinal+Electrophysiology.">Abnormal Electroretinogram after Kir7.1 Channel Suppression Suggests Role in Retinal Electrophysiology.</a> Science Reports. 7 (1), 10651 (2017).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+human+RPE65+P25L+hypomorph+resembles+wild+type+under+normal+light+rearing+but+is+fully+resistant+to+acute+light+damage.">Mouse model of human RPE65 P25L hypomorph resembles wild type under normal light rearing but is fully resistant to acute light damage.</a> Human Molecular Genetics. 24 (15), 4417-4428 (2015).</li></ol>

Kritiske trinn
Et godt DC-ERG-opptak krever stabile elektroder som er fri for bobler som skaper artefakter og uønsket drift, da de er ekstremt følsomme for utgassing og temperaturendringer. Det er viktig at en stabil grunnlinje oppnås når elektrodene plasseres i HBSS-badeløsningen før de fortsetter med museopptaket. Små bobler har en tendens til å samle seg ved foten av kapillærelektroden eller rundt silikonpakningen og er vanskelig å se når elektrodeholderen er fer...

Retinal pigment epitel (RPE) er en monolayer av spesialiserte celler som linje bakre segmentet av øyet og utøve kritiske funksjoner for å opprettholde retinal homeostase1. RPE støtter fotoreseptorer ved å regenerere deres fotonfangende visuelle pigment i en prosess som kalles den visuellesyklus 2, ved å delta i dagsfagocytose av skur ytre segmenttips3, og i transport av næringsstoffer og metabolske produkter mellom fotoreseptorer og choriocapillaris4,5. Abnormiteter i RPE-funksjonen ligger til grunn for mange humane retinale sykdommer, som aldersrelatert makuladegenerasjon6,Lebers medfødte amaurosis7,8 og Best vitelliform makuladystrofi9. Som donor øye vev er ofte vanskelig å få utelukkende for forskningsformål, dyremodeller med genetiske modifikasjoner kan gi en alternativ måte å studere utviklingen av retinal sykdommer10,11. I tillegg tillater fremveksten og anvendelsen av CRISPR cas9-teknologi nå genomiske introduksjoner (knock-in) eller slettinger (knock-out) i en enkel, ett-trinns prosess som overgår begrensninger av tidligere genmålrettingsteknologier12. Bommen i tilgjengeligheten av nye musemodeller13 krever en mer effektiv opptaksprotokoll for å ikke-invasivt evaluere RPE-funksjonen.
Måling av RPEs lyskalkede elektriske responser kan oppnås ved hjelp av en direkte skrevet elektroretinogram (DC-ERG) teknikk. Når den brukes i kombinasjon med konvensjonelle ERG-opptak som måler fotoreseptoren (a-bølge) og bipolare (b-bølge)celleresponser 14, kan DC-ERG definere hvordan responsegenskapene til RPE endres med retinal degenerasjon15,16,17 ellerom RPE-dysfunksjon går forut for fotoreseptortap. Denne protokollen beskriver en metode tilpasset fra arbeidet til Marmorstein, Peachey, og kolleger som først utviklet DC-ERG teknikk16,18,19,20 og forbedrer reproduserbarhet og brukervennlighet.
DC-ERG-opptaket er vanskelig å utføre på grunn av den lange oppkjøpstiden (9 min) der eventuelle avbrudd eller innføring av støy kan komplisere tolkningen av dataene. Fordelen med denne nye metoden er at grunnlinjene når jevn tilstand innen kortere tid, noe som reduserer sannsynligheten for at dyret vil våkne for tidlig fra anestesi og er mindre utsatt for bobledannelse i kapillære elektroder.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ag/AgCl (mouth) Electrode</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>EP1</td>
			<td>Mouth reference electrode for mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Tile</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>CTS</td>
			<td>Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Cleaning Stick</td>
			<td>Puritan Medical Products</td>
			<td>867-WC No Glue</td>
			<td>To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroretinogram (ERG) System</td>
			<td>Diagnosys LLC</td>
			<td>E3 System</td>
			<td>Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen Burner</td>
			<td>Argos Technologies</td>
			<td>BW20002460</td>
			<td>Or equivlaent to shape glass under flame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary Tube (1.5 mm)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF150-75</td>
			<td>For filling with HBSS and making contact to the cornea</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Buffered Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>14175-095</td>
			<td>Commercially available. Maintain at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Line Filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>6722-5001</td>
			<td>To protect vacuum pump from aerosols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Noise Cable for Microelectrode Holders</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>5372</td>
			<td>Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Ball Joint</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>500871</td>
			<td>For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>MatLab: For editing the analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab Curvefit Toolbox</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab Compiler</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab Runtime version 9.5</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2018b (9.5)</td>
			<td>Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Holders (45 degrees)</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>MEH345-15</td>
			<td>For holding the capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle (25 ga)</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8881250313</td>
			<td>For filling the capillary tubes with HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle (ground) electrode</td>
			<td>Rhythmlink</td>
			<td>13mm - one elctrode</td>
			<td>Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regulator/Power Conditioner</td>
			<td>Furman</td>
			<td>P-1800</td>
			<td>Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (12 mL)</td>
			<td>Monoject</td>
			<td>1181200777</td>
			<td>For filling the capillary tubes with HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-clip</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06852-20</td>
			<td>For electrode holder assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>420120000</td>
			<td>Clear polycarbonate bottom &#38; cover</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmacological treatment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant eye gel</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>0078-0429-47</td>
			<td>Helps lubricates corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine Hydrochloride 2.5%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>17478-201-15</td>
			<td>Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proparacaine Hydrochloride 0.5%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>17478-263-12</td>
			<td>Local anesthetic for ophthalmic instillation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide 0.5%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>17478-101-12</td>
			<td>Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>AnaSed</td>
			<td>sc-362949Rx</td>
			<td>Analgesic and muscle relaxant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetamine (Ketamine HCl)</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>501072</td>
			<td>Anesthetic for intramuscular injections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct-coupled electroretinogram (dc-erg) for recording the light-evoked electrical responses of the mouse retinal pigment epithelium

Retinal pigment epitel (RPE) er et spesialisert monolayer av celler strategisk plassert mellom netthinnen og choriocapillaris som opprettholder den generelle helse og strukturelle integriteten til fotoreseptorene. RPE er polarisert, viser apically og basalt plassert reseptorer eller kanaler, og utfører vektoral transport av vann, ioner, metabolitter, og utskiller flere cytokiner.
In vivo ikke-invasive målinger av RPE-funksjonen kan gjøres ved hjelp av direkte forbindelser (DC-ERGs). Metodikken bak DC-ERG ble banebrytende av Marmorstein, Peachey og kolleger ved hjelp av et spesialbygd stimuleringsopptakssystem og senere demonstrert ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig system. DC-ERG-teknikken bruker glasskapillærer fylt med Hanks bufrede saltløsning (HBSS) for å måle de langsommere elektriske reaksjonene til RPE fremkalt fra lyskalte konsentrasjonsendringer i subretinalrommet på grunn av fotoreseptoraktivitet. Den langvarige lysstimulansen og lengden på DC-ERG-opptaket gjør den sårbar for drift og støy som resulterer i et lavt utbytte av brukbare opptak. Her presenterer vi en rask og pålitelig metode for å forbedre stabiliteten til opptakene samtidig som vi reduserer støy ved å bruke vakuumtrykk for å redusere/eliminere bobler som følge av utgassing av HBSS og elektrodeholderen. I tillegg dempes strømledningsartefakter ved hjelp av en spenningsregulator/strømbetinging. Vi inkluderer de nødvendige lysstimuleringsprotokollene for et kommersielt tilgjengelig ERG-system, samt skript for analyse av DC-ERG-komponentene: c-bølge, rask svingning, lystopp og av respons. På grunn av den forbedrede enkle opptaks- og hurtiganalysearbeidsflyten er denne forenklede protokollen spesielt nyttig for måling av aldersrelaterte endringer i RPE-funksjon, sykdomsprogresjon og i vurderingen av farmakologisk intervensjon.

Figur 2 er et eksempeldatasett fra miR-204 ko/ko cre/+ (betinget KO) og villtypemus (WT). MiR-204 ko/ko cre/+ er mus med betinget knockout av microRNA 204 i retinal pigment epitel. Disse musene genereres ved å krysse floxed miR-204 mus (produsert av NEIGEF)22 med VMD2-CRE mus23. MiR-204 er høyt uttrykt i RPE hvor det regulerer uttrykket av proteiner som er kritiske for epitelfunksjon som opprettholder tett koblingsintegritet (f.eks. claudins)...

Watch this Scientific Journal Video about Direct-Coupled Electroretinogram DC-ERG for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Direct-Coupled Electroretinogram DC-ERG for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Her presenterer vi en metode for registrering av lys fremkalte elektriske responser av retinal pigment epitel (RPE) hos mus ved hjelp av en teknikk kjent som DC-ERGs først beskrevet av Marmorstein, Peachey, og kolleger tidlig på 2000-tallet.

Direkte skrevet Electroretinogram (DC-ERG) for opptak av lys-fremkalt elektriske svar av musen Retinal Pigment Epitel

The retinal pigment epithelium (RPE) is a specialized monolayer of cells strategically located between the retina and the choriocapillaris that maintain ...

DC-ERG-teknikken kan brukes til ikke-unnvikende evaluering av retinal pigmentepitetelfunksjon for å overvåke aldersrelaterte endringer eller sykdomsprogresjon og for å vurdere farmakologiske intervensjonseffekter. Denne teknikken forbedrer dc-ERG reprodusere evne og enkel bruk ved å forenkle kapillær elektrode forberedelse. Det kan også suppleres med en standard ohm program for å lette analysen.Begynn med å forsiktig skyve en 25-gauge sprøytenål gjennom silikongummipakningen til bakveggen på elektrodeholderen. Fyll bunnen av elektrodeholderen med avgassede HBSS mens du sakte trekker nålen, pass på at du ikke introduserer bobler, og skift ut gjengehetten uten å stramme. Sett sprøytenålen tilbake for å fylle det tomme rommet innenfor gapet med HBSS og hold kapillæren horisontalt mens du fyller for å hindre at oppløsningen rømmer fra den andre enden.Ta tak i det fylte kapillæret i den bøyde enden, sett den andre enden langsomt inn gjennom den løsnede hetten og trekk skrukorken på plass. Vipp elektrodeholderne med kapillære elektrodene vendt opp slik at eventuelle bobler kan strømme ut og degas kapillærene i et vakuumkammer i fem til 10 minutter. Deretter slipper du langsomt vakuumet og fyller elektrodeholderne og glasskapillærer, som vist.For å lage et tilpasset stativ for mikroelektrodholderen, fjern de svarte polyacetalklemmene fra den ene siden av en nummer åtte T-klips og bruk en sylinderbase med magnetiske kuleledd maskinert i to for å justere høyden. Fest de modifiserte T-klipsene til de magnetiske kulemonteringsskruene med M3-størrelsesmuttere og et lysbilde i ca. en-tommers konisk trehåndtak, modifisert fra en bomullsspiss rengjøringspinne, inn i stativet i en vinkel for å feste mikroelektrorodholderen inn i det skreddersydde T-klips magnetiske kuleleddstativet. Deretter bruker du den sjeldne jordmagneter sylinder base for å sikkert plassere den tilpassede elektrodeholderen stå på metallplaten på scenen, slik at en 360-graders rotasjon på en 180-graders akse.For å utføre en elektrodetest må du først senke de ferdigmonterte HBSS-fylte kapillære mikroelektrodene i en liten beholder med HBSS. Plasser nålebakken elektroden og sølv, sølvklorid sentrert pellet referanse elektrode i samme HBSS for å fullføre kretsen og velge eller lage en passende identifikator for å beskrive musen som skal testes. Hvis du vil velge den direkte sammenknede elektroretinogramprotokollen som skal utføres, klikker du protokoller og velger DC-ERG.Klikk kjør. En dialogboks vil dukke opp med pasientinformasjonen. Hvis informasjonen er riktig, klikker du ja og går videre til trinn én av seks.Lukk dørene til Faraday-buret og klikk impedans for å vise impedansmodusen. Kontroller at verdiene for munnreferansen, halebakken og opptakselektrodene er akseptable, og klikk trinn for å gå videre til trinn fire av seks for å teste grunnlinjestabiliteten. Klikk forhåndsvisning for å begynne å vise sporene.Sporene skal være lav støy med en topp-til-topp amplitude på mindre enn 200 mikrovolt. For å plassere musen og elektrodene for et eksperiment, bedøve hornhinnen til en bedøvet mus med en dråpe 5% proparacaine saltsyre før du utvider hornhinnen med en dråpe på 2,5% fenylefrin HCL og 5% tropicamid. Kontroller at riktig pasient er valgt i ERG-systemprogramvaren.Klikk på protokoller. Velg DC-ERG under protokollbeskrivelse, og klikk kjør. Klikk ja for å kontrollere at den riktige testen utføres.Bruk trinn én av seks til å slå på et svakt rødt lys inne i kuppelen og plasser musen på et oppvarmet opptaksbord. Bruk tang til å nøye telt huden på bakbenet. Og bruk den ene hånden til å holde nåleelektroden fast, bruk den andre hånden til å sette elektroden subkutant inn i bakbenet for å feste elektroden på plass.Plasser referansesølv, sølvkloridelektrode i dyrets munn slik at den sentrerte pellet hviler langs bakkinnet og holdes på plass bak tennene. Før kapillærelektrodene plasseres på øyet, plasserer du elektrodeholderen med glasskapillene orientert vertikalt og knips elektrodeholderen med en pekefinger for å fjerne eventuelle bobler som kan ha blitt introdusert. Bruk en 25-gauge nål til å fylle kapillærspissene med HBSS og inspiser kapillærene for å sikre at det ikke er noen luftbobler fanget i tuppene.Plasser elektrodeholderstativet slik at de åpne tuppene på de HBSS-fylte kapillærene er i skånsom kontakt med hornhinnen. Og ta vare på å unngå å introdusere bobler, inverter smøremiddel øye gel dispenser for å kaste de første dråpene. Deretter plasserer du en dråpe smøremiddel øyegel på hvert øye for å opprettholde konduktiviteten og for å forhindre utskalking under opptaket.Hvis du vil registrere DC-ERGs, klikker du trinn for å velge trinn fem av seks og klikker impedans for å bruke impedanskontrollskjermen til å undersøke motstandene til venstre og høyre øyne. Impedansverdiene for opptakselektrodene ved hvert øye bør være like. Og impedansverdiene for både bakken og referanseelektrodene bør være mindre enn 10 kilohms.Klikk forhåndsvisning for å vise sporene for venstre og høyre øyne, og vent opptil 10 minutter på at en stabil grunnlinje skal oppnås. Klikk deretter stopp for å avslutte sporingsforhåndsvisningen og klikke Kjør for å starte opptaket. Her vises et eksempeldatasett fra betinget knockout og villtypemus.I denne analysen led sporet av små bobler i elektroden. Det økte topp-til-topp støy i sporet. I en egen analyse ble boblene eliminert ved hjelp av vakuumkammeret før de monterte mikroelektrodene i elektrodeholderstativene.De beste tilpasningslinjene til de første 25 sekundene kan beregnes, slik at de drift-korrigerte svarene kan replottes og amplitudene til DC-ERG-komponentene som skal identifiseres. Som forventet demper redusert uttrykk for kur 7,1 kaliumkanaler i RPE sterkt c-bølgen og rask oscillasjon, noe som indikerer en betydelig svekkelse av retinal pigment epitel elektriske egenskaper. Her vises de relative amplitudene til DC-ERG-komponentene, normalisert til villtype og plottet mot de relativt to største lysfremkallede abølgea amplitudene.Denne form for analyse kan avgjøre om de reduserte elektriske svarene til RPE kan redegjøres for ved reduksjon av fotoreseptoraktivitet alene. Eller hvis det er en underliggende feil som kommer fra RPE. Husk å oppnå en stabil grunnlinje før du går videre til museopptaket og for å sette elektrodene regelmessig tilbake for bobler som kan ha blitt introdusert.Mørktilpassede ERGs kan registreres før DC-ERG for å måle den kjegledrevne retinale funksjonen. Lystilpassede ERG-er kan også utføres etter DC-ERG for å evaluere de kjegledrevne retinale responsene.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium

LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations

LabVIEW-opererte Novel nanoliter osmometer for Ice Binding Protein Undersøkelser

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition ...

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Produksjon av disulfide-stabilisert transmembrane Peptid Komplekser for Strukturelle studier

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

A High-throughput-compatible FRET-based Platform for Identification and Characterization of Botulinum Neurotoxin Light Chain Modulators

Botulinum neurotoxin (BoNT) is a potent and potentially lethal bacterial toxin that binds to host motor neurons, is internalized into the cell, and ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Dannelse av Bestilte biomolekylære strukturer ved selvbygging av Short Peptider

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Optimization of Synthetic Proteins: Identification of Interpositional Dependencies Indicating Structurally and/or Functionally Linked Residues

Optimalisering av Syntetisk Proteiner: Identifisering av Interpositional Avhengig Hente Strukturelt og / eller Funksjonelt Koblede Rester

Protein alignments are commonly used to evaluate the similarity of protein residues, and the derived consensus sequence used for identifying functional ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Syntese av Protein Bioconjugates<em&gt; via</em&gt; Cystein-maleimide kjemi

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Facile Synthesis of Worm-lignende Miceller av synlig lys mediert dispersjonspolymeriseringen Bruke Photoredox Catalyst

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Bruke Kapillær elektroforese å kvantifisere organiske syrer fra Plant Tissue: En Test Case Undersøke<em&gt; Coffea arabica</em&gt; Seeds

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

Innsikt i de Samhandling av aminosyrer og peptider med uorganiske materialer Bruke Single-Molecule Force spektroskopi

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...