Name: direct-coupled electroretinogram (dc-erg) for recording the light-evoked electrical responses of the mouse retinal pigment epithelium
Uploaded: 2020-07-14T12:30:00
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Este trabalho foi apoiado por fundos intramuros do NEI. Os autores reconhecem sinceramente o Dr. Sheldon Miller por sua orientação científica, aconselhamento técnico e especialização em fisiologia e doenças RPE. Os autores agradecem a Megan Kopera e a equipe de cuidados com animais por gerenciar as colônias de ratos, e o Dr. Tarun Bansal, Raymond Zhou e Yuan Wang pelo apoio técnico.

Este protocolo segue as diretrizes de cuidado animal descritas no protocolo de estudo animal aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Instituto Nacional de Olhos.
1. Importação de protocolos de estimulação de luz para DC-ERG
NOTA: Siga as instruções abaixo para importar os protocolos de estimulação de luz para o DC-ERG no software do sistema ERG (Tabela de Materiais). O protocolo consiste em um intervalo pré-estímulo de 0,5 min,...

<ol>
	<li>Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+the+retinal+pigment+epithelium+and+the+neural+retina.">Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina.</a> Documenta Ophthalmologica. 60 (4), 327-346 (1985).</li><li>Sahu, B., Maeda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPE+Visual+Cycle+and+Biochemical+Phenotypes+of+Mutant+Mouse+Models.">RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models.</a> Methods in Molecular Biology. 1753, 89-102 (2018).</li><li>Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. 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O., Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+in+the+RPE.">Ion channels in the RPE.</a> Progress in Retinal Eye Research. 26 (3), 263-301 (2007).</li><li>Gundersen, D., Orlowski, J., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+polarity+of+Na,K-ATPase+in+retinal+pigment+epithelium+is+linked+to+a+reversal+of+the+ankyrin-fodrin+submembrane+cytoskeleton.">Apical polarity of Na,K-ATPase in retinal pigment epithelium is linked to a reversal of the ankyrin-fodrin submembrane cytoskeleton.</a> Journal of Cell Biology. 112 (5), 863-872 (1991).</li><li>Fletcher, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+age-related+macular+degeneration+using+animal+models.">Studying age-related macular degeneration using animal models.</a> Optometry and Vision Science. 91 (8), 878-886 (2014).</li><li>Gu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+RPE65+cause+autosomal+recessive+childhood-onset+severe+retinal+dystrophy.">Mutations in RPE65 cause autosomal recessive childhood-onset severe retinal dystrophy.</a> Nature Genetics. 17 (2), 194-197 (1997).</li><li>Marlhens, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+RPE65+cause+Leber's+congenital+amaurosis.">Mutations in RPE65 cause Leber's congenital amaurosis.</a> Nature Genetics. 17 (2), 139-141 (1997).</li><li>Marmorstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=the+product+of+the+Best+vitelliform+macular+dystrophy+gene+(VMD2),+localizes+to+the+basolateral+plasma+membrane+of+the+retinal+pigment+epithelium.">the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).</li><li>Chang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+studies+of+retinal+degeneration+and+diseases.">Mouse models for studies of retinal degeneration and diseases.</a> Methods in Molecular Biology. 935, 27-39 (2013).</li><li>Collin, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+Inherited+Retinal+Degeneration+with+Photoreceptor+Cell+Loss.">Mouse Models of Inherited Retinal Degeneration with Photoreceptor Cell Loss.</a> Cells. 9 (4), (2020).</li><li>Shrock, E., G&#252;ell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+in+Animals+and+Animal+Models.">CRISPR in Animals and Animal Models.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 152, 95-114 (2017).</li><li>Smalley, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+mouse+model+boom,+rat+model+renaissance.">CRISPR mouse model boom, rat model renaissance.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 893-894 (2016).</li><li>Benchorin, G., Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Vollrath, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Murine+Retinal+Function+by+Electroretinography.">Assessment of Murine Retinal Function by Electroretinography.</a> Bio Protocol. 7 (7), (2017).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+phagolysosomal+activity+by+miR-204+critically+influences+structure+and+function+of+retinal+pigment+epithelium/retina.">Regulation of phagolysosomal activity by miR-204 critically influences structure and function of retinal pigment epithelium/retina.</a> Human Molecular Genetics. 28 (20), 3355-3368 (2019).</li><li>Samuels, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+responses+of+the+retinal+pigment+epithelium:+changes+accompanying+photoreceptor+loss+in+the+mouse.">Light-evoked responses of the retinal pigment epithelium: changes accompanying photoreceptor loss in the mouse.</a> Journal of Neurophysiology. 104 (1), 391-402 (2010).</li><li>Wu, J., Marmorstein, A. D., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+abnormalities+in+the+retinal+pigment+epithelium+of+CFTR+mutant+mice.">Functional abnormalities in the retinal pigment epithelium of CFTR mutant mice.</a> Experimental Eye Research. 83 (2), 424-428 (2006).</li><li>Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+responses+of+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).</li><li>Peachey, N. S., Stanton, J. B., Marmorstein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+recording+and+response+characteristics+of+the+rat+dc-electroretinogram.">Noninvasive recording and response characteristics of the rat dc-electroretinogram.</a> Visual Neuroscience. 19 (6), 693-701 (2002).</li><li>Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+retinal+pigment+epithelium+dysfunction+is+concomitant+with+hyperglycemia+in+mouse+models+of+type+1+and+type+2+diabetes.">Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).</li><li>Marmorstein, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light+peak+of+the+electroretinogram+is+dependent+on+voltage-gated+calcium+channels+and+antagonized+by+bestrophin+(best-1).">The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1).</a> Journal of General Physiology. 127 (5), 577-589 (2006).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invest.+Ophtalmol.+Vis.+Sci.">Invest. Ophtalmol. Vis. Sci.</a> Annual Meeting for the Association for Research in Vision and Ophthalmology. , 3568 (2017).</li><li>Iacovelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Cre+transgenic+mice+with+postnatal+RPE-specific+ocular+expression.">Generation of Cre transgenic mice with postnatal RPE-specific ocular expression.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1378-1383 (2011).</li><li>Wang, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-204/211+alters+epithelial+physiology.">MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology.</a> FASEB Journal. 24 (5), 1552-1571 (2010).</li><li>He, L., Marioutina, M., Dunaief, J. L., Marneros, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-+and+gene-dosage-dependent+cre-induced+abnormalities+in+the+retinal+pigment+epithelium.">Age- and gene-dosage-dependent cre-induced abnormalities in the retinal pigment epithelium.</a> American Journal of Pathology. 184 (6), 1660-1667 (2014).</li><li>Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+modulation+of+basolateral+membrane+Cl-+conductance+in+chick+retinal+pigment+epithelium:+the+light+peak+and+fast+oscillation.">Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation.</a> Journal of Neurophysiology. 70 (4), 1669-1680 (1993).</li><li>Blaug, S., Quinn, R., Quong, J., Jalickee, S., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelial+function:+a+role+for+CFTR.">Retinal pigment epithelial function: a role for CFTR.</a> Documenta Ophthalmologica. 106 (1), 43-50 (2003).</li><li>Gallemore, R. P., Griff, E. R., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+in+support+of+a+photoreceptoral+origin+for+the+"light-peak+substance".">Evidence in support of a photoreceptoral origin for the "light-peak substance".</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (4), 566-571 (1988).</li><li>Shahi, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+Electroretinogram+after+Kir7.1+Channel+Suppression+Suggests+Role+in+Retinal+Electrophysiology.">Abnormal Electroretinogram after Kir7.1 Channel Suppression Suggests Role in Retinal Electrophysiology.</a> Science Reports. 7 (1), 10651 (2017).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+human+RPE65+P25L+hypomorph+resembles+wild+type+under+normal+light+rearing+but+is+fully+resistant+to+acute+light+damage.">Mouse model of human RPE65 P25L hypomorph resembles wild type under normal light rearing but is fully resistant to acute light damage.</a> Human Molecular Genetics. 24 (15), 4417-4428 (2015).</li></ol>

Passos críticos
Uma boa gravação DC-ERG requer eletrodos estáveis que estão livres de bolhas que criam artefatos e deriva indesejada, pois são extremamente sensíveis à superagação e mudanças de temperatura. É essencial que uma linha de base estável seja alcançada quando os eletrodos são colocados na solução de banho HBSS antes de prosseguir com a gravação do mouse. Pequenas bolhas tendem a ser coletadas na base do eletrodo capilar ou ao redor da junta de sil...

O epitélio pigmento da retina (RPE) é uma monocamada de células especializadas que alinham o segmento posterior do olho e exercem funções críticas para manter a homeostase da retina1. O RPE suporta fotorreceptores regenerando seu pigmento visual captura de fótons em um processo chamado ciclo visual2, participando da fagocitose diurna das pontas do segmento externo do galpão3, e no transporte de nutrientes e produtos metabólicos entre fotorreceptores e os choriocapillaris4,5. Anormalidades na função RPE estão por trás de inúmeras doenças da retina humana, como a degeneração macular relacionada à idade6, a amaurose congênita de Leber7,8 e Melhor distrofia macular vitelliform9. Como os tecidos oculares doadores são frequentemente difíceis de obter apenas para fins de pesquisa, modelos animais com modificações genéticas podem fornecer uma maneira alternativa de estudar o desenvolvimento de doenças da retina10,11. Além disso, o surgimento e a aplicação da tecnologia CRISPR cas9 agora permitem introduções genômicas (knock-in) ou exclusões (knock-out) em um processo simples de uma etapa superando as limitações das tecnologias anteriores de segmentação genética12. O boom na disponibilidade de novos modelos de mouse13 requer um protocolo de gravação mais eficiente para avaliar não invasivamente a função RPE.
A medição das respostas elétricas evocadas pela luz do RPE pode ser obtida utilizando uma técnica de eletroretinograma acoplado direto (DC-ERG). Quando usado em combinação com gravações convencionais de ERG que medem as respostas celulares fotorreceptoras (a-onda) e bipolar (onda b)14,o DC-ERG pode definir como as propriedades de resposta do RPE mudam com a degeneração da retina15,16,17 ou se a disfunção RPE precede a perda do fotorreceptor. Este protocolo descreve um método adaptado do trabalho de Marmorstein, Peachey e colegas que desenvolveram pela primeira vez a técnica DC-ERG16,18,19,20 e melhora a reprodutibilidade e facilidade de uso.
A gravação do DC-ERG é difícil de realizar devido ao longo tempo de aquisição (9 min) durante o qual qualquer interrupção ou introdução de ruído pode complicar a interpretação dos dados. A vantagem deste novo método é que as linhas de base atingem um estado estável em um período menor de tempo reduzindo a probabilidade de que o animal acorde prematuramente da anestesia e seja menos propenso à formação de bolhas nos eletrodos capilares.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ag/AgCl (mouth) Electrode</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>EP1</td>
			<td>Mouth reference electrode for mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Tile</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>CTS</td>
			<td>Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Cleaning Stick</td>
			<td>Puritan Medical Products</td>
			<td>867-WC No Glue</td>
			<td>To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroretinogram (ERG) System</td>
			<td>Diagnosys LLC</td>
			<td>E3 System</td>
			<td>Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen Burner</td>
			<td>Argos Technologies</td>
			<td>BW20002460</td>
			<td>Or equivlaent to shape glass under flame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary Tube (1.5 mm)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF150-75</td>
			<td>For filling with HBSS and making contact to the cornea</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Buffered Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>14175-095</td>
			<td>Commercially available. Maintain at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Line Filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>6722-5001</td>
			<td>To protect vacuum pump from aerosols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Noise Cable for Microelectrode Holders</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>5372</td>
			<td>Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Ball Joint</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>500871</td>
			<td>For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>MatLab: For editing the analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab Curvefit Toolbox</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab Compiler</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab Runtime version 9.5</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2018b (9.5)</td>
			<td>Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Holders (45 degrees)</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>MEH345-15</td>
			<td>For holding the capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle (25 ga)</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8881250313</td>
			<td>For filling the capillary tubes with HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle (ground) electrode</td>
			<td>Rhythmlink</td>
			<td>13mm - one elctrode</td>
			<td>Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regulator/Power Conditioner</td>
			<td>Furman</td>
			<td>P-1800</td>
			<td>Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (12 mL)</td>
			<td>Monoject</td>
			<td>1181200777</td>
			<td>For filling the capillary tubes with HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-clip</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06852-20</td>
			<td>For electrode holder assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>420120000</td>
			<td>Clear polycarbonate bottom &#38; cover</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmacological treatment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant eye gel</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>0078-0429-47</td>
			<td>Helps lubricates corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine Hydrochloride 2.5%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>17478-201-15</td>
			<td>Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proparacaine Hydrochloride 0.5%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>17478-263-12</td>
			<td>Local anesthetic for ophthalmic instillation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide 0.5%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>17478-101-12</td>
			<td>Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>AnaSed</td>
			<td>sc-362949Rx</td>
			<td>Analgesic and muscle relaxant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetamine (Ketamine HCl)</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>501072</td>
			<td>Anesthetic for intramuscular injections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct-coupled electroretinogram (dc-erg) for recording the light-evoked electrical responses of the mouse retinal pigment epithelium

O epitélio pigmento da retina (RPE) é uma monocamada especializada de células estrategicamente localizadas entre a retina e os coriocapillaris que mantêm a saúde geral e a integridade estrutural dos fotorreceptores. O RPE é polarizado, exibindo receptores ou canais localizados apicamente e basally, e realiza transporte vetorial de água, íons, metabólitos e secreta várias citocinas.
As medidas in vivo não invasivas da função RPE podem ser feitas usando ERGs acoplados diretos (DC-ERGs). A metodologia por trás do DC-ERG foi pioneira por Marmorstein, Peachey, e colegas usando um sistema de gravação de estimulação personalizado e mais tarde demonstrou usando um sistema comercialmente disponível. A técnica DC-ERG usa capilares de vidro preenchidos com a solução de sal tampão (HBSS) de Hank para medir as respostas elétricas mais lentas do RPE provocadas a partir de mudanças de concentração evocadas pela luz no espaço subretinal devido à atividade do fotorreceptor. O estímulo de luz prolongado e o comprimento da gravação dc-ERG tornam-no vulnerável à deriva e ao ruído, resultando em um baixo rendimento de gravações de utilidade. Aqui, apresentamos um método rápido e confiável para melhorar a estabilidade das gravações, ao mesmo tempo em que reduzimos o ruído usando pressão de vácuo para reduzir/eliminar bolhas que resultam da eliminação do HBSS e do suporte de eletrodos. Além disso, os artefatos da linha de energia são atenuados usando um regulador de tensão/condicionador de energia. Incluímos os protocolos necessários de estimulação de luz para um sistema ERG comercialmente disponível, bem como scripts para análise dos componentes DC-ERG: onda c, oscilação rápida, pico de luz e resposta off. Devido à melhor facilidade de registros e ao fluxo de trabalho de análise rápida, este protocolo simplificado é particularmente útil na medição de mudanças relacionadas à idade na função RPE, progressão da doença e na avaliação da intervenção farmacológica.

Figura 2 é um conjunto de dados de amostra de miR-204 ko/ko cre/+ (KO condicional) e ratos do tipo selvagem (WT). MiR-204 ko/ko cre/+ são camundongos com um nocaute condicional de microRNA 204 no epitélio pigmento da retina. Esses camundongos são gerados pela travessia de camundongos miR-204 floxed (produzidos pela NEIGEF)22 com ratos VMD2-CRE23. O MiR-204 é altamente expresso no RPE, onde regula a expressão de proteínas críticas para a...

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Direct-Coupled Electroretinogram DC-ERG for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Aqui, apresentamos um método para registrar respostas elétricas evocadas pela luz do epitélio pigmento da retina (RPE) em camundongos usando uma técnica conhecida como DC-ERGs descrita pela primeira vez por Marmorstein, Peachey, e colegas no início dos anos 2000.

Eletroretinograma acoplado direto (DC-ERG) para gravar as respostas elétricas evocadas pela luz do epitélio pigmento de retina do rato

The retinal pigment epithelium (RPE) is a specialized monolayer of cells strategically located between the retina and the choriocapillaris that maintain ...

A técnica DC-ERG pode ser utilizada para a avaliação não evasiva da função de epitélio do pigmento da retina para monitorar alterações relacionadas à idade ou progressão da doença e para avaliar os efeitos da intervenção farmacológica. Esta técnica melhora a capacidade de reprodução dc-ERG e a facilidade de uso simplificando a preparação do eletrodo capilar. Ele também pode ser complementado com um aplicativo de software ohm padrão para facilitar a análise.Comece deslizando cuidadosamente uma agulha de seringa de calibre 25 através da junta de borracha de silicone para a parede traseira do suporte do eletrodo. Encha a base do suporte do eletrodo com HBSS desgaseado enquanto retraia lentamente a agulha, tomando cuidado para não introduzir bolhas e substitua a tampa roscada sem apertar. Reinsera a agulha de seringa para preencher o espaço vazio dentro da lacuna com HBSS e segure o capilar horizontalmente enquanto encha para evitar que a solução escape da outra extremidade.Agarrando o capilar preenchido na extremidade dobrada, insira lentamente a outra extremidade através da tampa solta e aperte a tampa do parafuso no lugar. Incline os suportes de eletrodos com os eletrodos capilares voltados para cima para permitir que quaisquer bolhas fluam e desgas os capilares em uma câmara de vácuo por cinco a 10 minutos. Em seguida, solte lentamente o vácuo e recarregue os porta-eletrodos e capilares de vidro, como demonstrado.Para fazer uma posição personalizada para o suporte de microeletrodos, remova os clipes poliacetais pretos de um lado de um t-clip número oito e use uma base de cilindro com juntas de esfera magnética usinadas ao meio para ajustar a altura. Fixar os clipes T modificados nos parafusos de montagem da esfera magnética com porcas do tamanho M3 e um slide em uma alça de madeira afilada de aproximadamente uma polegada, modificada a partir de uma vara de limpeza de ponta de algodão, no suporte em um ângulo para fixar o suporte de microeletrodes no suporte de esfera magnética de clipe T personalizado. Em seguida, use a base do cilindro de ímãs de terras raras para posicionar com segurança o suporte de eletrodo personalizado sobre a placa metálica do palco, permitindo uma rotação de 360 graus em um eixo de 180 graus.Para realizar um teste de eletrodo, primeiro, abaixe suavemente os microeletrodos capilares totalmente montados do HBSS em um pequeno recipiente de HBSS. Coloque o eletrodo moído da agulha e o eletrodo de referência de pelotas centrada em cloreto prateado no mesmo HBSS para completar o circuito e selecione ou crie um identificador apropriado para descrever o mouse a ser testado. Para selecionar o protocolo de eletroretinograma acoplado direto a ser executado, clique em protocolos e selecione DC-ERG.Clique em executar. Uma caixa de diálogo aparecerá com as informações do paciente. Se a informação estiver correta, clique em sim e proceda para a etapa um dos seis.Feche as portas da gaiola de Faraday e clique em impedância para exibir o modo de impedância. Verifique se os valores para a referência da boca, o solo da cauda e os eletrodos de gravação são aceitáveis e clique na etapa para prosseguir para a etapa quatro de seis para testar a estabilidade da linha de base. Para começar a visualizar os traços, clique em visualização.Os traços devem ser de baixo ruído com uma amplitude de pico a pico de menos de 200 microvolts. Para posicionar o camundongo e os eletrodos para um experimento, anestesiar a córnea de um rato sedado com uma gota de ácido clorídrico de 5% de proparacaina antes de dilatar a córnea com uma queda de 2,5% de fenilefrina HCL e 5% de tropamida. No software do sistema ERG, verifique se o paciente correto está selecionado.Clique nos protocolos. Na descrição do protocolo, selecione DC-ERG e clique em executar. Clique em sim para verificar se o teste correto está sendo realizado.Use o passo um de seis para acender uma luz vermelha fraca dentro da cúpula e coloque o mouse em uma mesa de gravação aquecida. Use fórceps para cuidadosamente tenda a pele da perna traseira. E usando uma mão para segurar firmemente o eletrodo da agulha, use a outra mão para inserir o eletrodo subcutâneamente na perna traseira para fixar o eletrodo no lugar.Coloque o eletrodo de prata e cloreto de prata na boca do animal para que a pelota centrada repouse ao longo da bochecha traseira e fique no lugar atrás dos dentes. Antes de colocar os eletrodos capilares no olho, posicione o suporte do eletrodo com os capilares de vidro orientados verticalmente e aperte o suporte do eletrodo com um dedo indicador para remover quaisquer bolhas que possam ter sido introduzidas. Use uma agulha de calibre 25 para encher as pontas capilares com HBSS e inspecione os capilares para garantir que não haja bolhas de ar presas nas pontas.Posicione o suporte do porta-eletrodos para que as pontas abertas dos capilares cheios de HBSS estejam em contato suave com a córnea. E tomando o cuidado de evitar a introdução de bolhas, inverta o distribuidor de gel de olho lubrificante para descartar as gotas iniciais. Em seguida, coloque uma gota de gel lubrificante em cada olho para manter a condutividade e evitar a dessecação durante a gravação.Para gravar os DC-ERGs, clique em passo para selecionar o passo cinco de seis e clique em impedância para usar a tela de verificação de impedância para examinar as resistências dos olhos esquerdo e direito. Os valores de impedância para os eletrodos de gravação em cada olho devem ser semelhantes. E os valores de impedância tanto para os eletrodos de terra quanto para referência devem ser inferiores a 10 kilohms.Clique na visualização para ver os traços dos olhos esquerdo e direito e espere até 10 minutos para que uma linha de base estável seja alcançada. Em seguida, clique em parar para sair da visualização do rastreamento e clique em executar para iniciar a gravação. Aqui, um conjunto de dados de amostra de nocaute condicional e ratos do tipo selvagem é mostrado.Nesta análise, o traço sofria de bolhas minúsculas no eletrodo. Aumentou o ruído de pico ao pico no rastreamento. Em uma análise separada, as bolhas foram eliminadas utilizando-se a câmara de vácuo antes da montagem dos microeletrodos dentro das arquibancadas do porta-eletrodos.As linhas mais adequadas para os 25 segundos iniciais podem ser calculadas, permitindo que as respostas corrigidas à deriva sejam replotadas e as amplitudes dos componentes DC-ERG sejam identificadas. Como esperado, a expressão reduzida de cura 7,1 canais de potássio no RPE atenua muito a onda c e a oscilação rápida, indicando um prejuízo significativo das propriedades elétricas do pigmento da retina. Aqui, as amplitudes relativas dos componentes DC-ERG, normalizadas para tipo selvagem e plotadas contra as duas maiores amplitudes de onda evocadas por luz, são mostradas.Esta forma de análise pode determinar se as respostas elétricas reduzidas do RPE podem ser contabilizadas apenas pela redução da atividade fotorreceptora. Ou se há um defeito subjacente que se origina no RPE. Lembre-se de alcançar uma linha de base estável antes de passar para a gravação do mouse e para reinspecionar os eletrodos periodicamente para bolhas que podem ter sido introduzidas.ERGs adaptados à escuridão podem ser registrados antes do DC-ERG para medir a função de retina orientada pelo cone. ERGs adaptados à luz também podem ser realizados após o DC-ERG para avaliar as respostas de retina orientadas por cone.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium

LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations

LabVIEW operado Osmometer nanolitro Novel de Investigações de gelo ligação às proteínas

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition ...

Química

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Complexos de produção de transmembrana Disulfide-estabilizados Peptídicos para estudos estruturais

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

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Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

A High-throughput-compatible FRET-based Platform for Identification and Characterization of Botulinum Neurotoxin Light Chain Modulators

Botulinum neurotoxin (BoNT) is a potent and potentially lethal bacterial toxin that binds to host motor neurons, is internalized into the cell, and ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Formação de Estruturas Biomoleculares Ordenadas pela Automontagem de Peptídeos Pequenos

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Optimization of Synthetic Proteins: Identification of Interpositional Dependencies Indicating Structurally and/or Functionally Linked Residues

Otimização de proteínas sintéticas: Identificação de interposição Dependências Indicating Estruturalmente e / ou resíduos funcionalmente ligadas

Protein alignments are commonly used to evaluate the similarity of protein residues, and the derived consensus sequence used for identifying functional ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

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Síntese de Bioconjugados de proteínas<em&gt; via</em&gt; Química cisteína-maleimida

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Síntese Facile de micelas Worm-like por luz visível Mediated Dispersão Polimerização Usando Photoredox Catalisador

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Usando Eletroforese Capilar para quantificar ácidos orgânicos a partir de tecido da planta: um caso de teste de exame<em&gt; Coffea arabica</em&gt; Sementes

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

Insights sobre as interações de aminoácidos e peptídeos com Materiais Inorgânicos Usando Single-Molecule Força Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...