Name: direct-coupled electroretinogram (dc-erg) for recording the light-evoked electrical responses of the mouse retinal pigment epithelium
Uploaded: 2020-07-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct-Coupled Electroretinogram DC-ERG for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Эта работа была поддержана интрамуральными фондами НЭИ. Авторы искренне признают д-р Шелдон Миллер за его научные рекомендации, технические консультации, и опыт в области физиологии RPE и болезней. Авторы благодарят Меган Копера и персонал по уходу за животными за управление колониями мышей, а также доктора Таруна Бансала, Раймонда Чжоу и Yuan Wang за техническую поддержку.

Этот протокол следует руководящим принципам по уходу за животными, изложенным в протоколе исследования животных, утвержденном Комитетом по уходу за животными и использованию Национального института глаз.
1. Импорт протоколов стимуляции света для DC-ERG
ПРИМ?...

<ol>
	<li>Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+the+retinal+pigment+epithelium+and+the+neural+retina.">Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina.</a> Documenta Ophthalmologica. 60 (4), 327-346 (1985).</li><li>Sahu, B., Maeda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPE+Visual+Cycle+and+Biochemical+Phenotypes+of+Mutant+Mouse+Models.">RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models.</a> Methods in Molecular Biology. 1753, 89-102 (2018).</li><li>Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis:+use+and+utility+of+RPE+cells+in+culture.">Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture.</a> Experimental Eye Resarch. 126, 51-60 (2014).</li><li>Wimmers, S., Karl, M. O., Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+in+the+RPE.">Ion channels in the RPE.</a> Progress in Retinal Eye Research. 26 (3), 263-301 (2007).</li><li>Gundersen, D., Orlowski, J., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+polarity+of+Na,K-ATPase+in+retinal+pigment+epithelium+is+linked+to+a+reversal+of+the+ankyrin-fodrin+submembrane+cytoskeleton.">Apical polarity of Na,K-ATPase in retinal pigment epithelium is linked to a reversal of the ankyrin-fodrin submembrane cytoskeleton.</a> Journal of Cell Biology. 112 (5), 863-872 (1991).</li><li>Fletcher, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+age-related+macular+degeneration+using+animal+models.">Studying age-related macular degeneration using animal models.</a> Optometry and Vision Science. 91 (8), 878-886 (2014).</li><li>Gu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+RPE65+cause+autosomal+recessive+childhood-onset+severe+retinal+dystrophy.">Mutations in RPE65 cause autosomal recessive childhood-onset severe retinal dystrophy.</a> Nature Genetics. 17 (2), 194-197 (1997).</li><li>Marlhens, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+RPE65+cause+Leber's+congenital+amaurosis.">Mutations in RPE65 cause Leber's congenital amaurosis.</a> Nature Genetics. 17 (2), 139-141 (1997).</li><li>Marmorstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=the+product+of+the+Best+vitelliform+macular+dystrophy+gene+(VMD2),+localizes+to+the+basolateral+plasma+membrane+of+the+retinal+pigment+epithelium.">the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).</li><li>Chang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+studies+of+retinal+degeneration+and+diseases.">Mouse models for studies of retinal degeneration and diseases.</a> Methods in Molecular Biology. 935, 27-39 (2013).</li><li>Collin, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+Inherited+Retinal+Degeneration+with+Photoreceptor+Cell+Loss.">Mouse Models of Inherited Retinal Degeneration with Photoreceptor Cell Loss.</a> Cells. 9 (4), (2020).</li><li>Shrock, E., G&#252;ell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+in+Animals+and+Animal+Models.">CRISPR in Animals and Animal Models.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 152, 95-114 (2017).</li><li>Smalley, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+mouse+model+boom,+rat+model+renaissance.">CRISPR mouse model boom, rat model renaissance.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 893-894 (2016).</li><li>Benchorin, G., Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Vollrath, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Murine+Retinal+Function+by+Electroretinography.">Assessment of Murine Retinal Function by Electroretinography.</a> Bio Protocol. 7 (7), (2017).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+phagolysosomal+activity+by+miR-204+critically+influences+structure+and+function+of+retinal+pigment+epithelium/retina.">Regulation of phagolysosomal activity by miR-204 critically influences structure and function of retinal pigment epithelium/retina.</a> Human Molecular Genetics. 28 (20), 3355-3368 (2019).</li><li>Samuels, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+responses+of+the+retinal+pigment+epithelium:+changes+accompanying+photoreceptor+loss+in+the+mouse.">Light-evoked responses of the retinal pigment epithelium: changes accompanying photoreceptor loss in the mouse.</a> Journal of Neurophysiology. 104 (1), 391-402 (2010).</li><li>Wu, J., Marmorstein, A. D., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+abnormalities+in+the+retinal+pigment+epithelium+of+CFTR+mutant+mice.">Functional abnormalities in the retinal pigment epithelium of CFTR mutant mice.</a> Experimental Eye Research. 83 (2), 424-428 (2006).</li><li>Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+responses+of+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).</li><li>Peachey, N. S., Stanton, J. B., Marmorstein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+recording+and+response+characteristics+of+the+rat+dc-electroretinogram.">Noninvasive recording and response characteristics of the rat dc-electroretinogram.</a> Visual Neuroscience. 19 (6), 693-701 (2002).</li><li>Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+retinal+pigment+epithelium+dysfunction+is+concomitant+with+hyperglycemia+in+mouse+models+of+type+1+and+type+2+diabetes.">Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).</li><li>Marmorstein, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light+peak+of+the+electroretinogram+is+dependent+on+voltage-gated+calcium+channels+and+antagonized+by+bestrophin+(best-1).">The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1).</a> Journal of General Physiology. 127 (5), 577-589 (2006).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invest.+Ophtalmol.+Vis.+Sci.">Invest. Ophtalmol. Vis. Sci.</a> Annual Meeting for the Association for Research in Vision and Ophthalmology. , 3568 (2017).</li><li>Iacovelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Cre+transgenic+mice+with+postnatal+RPE-specific+ocular+expression.">Generation of Cre transgenic mice with postnatal RPE-specific ocular expression.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1378-1383 (2011).</li><li>Wang, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-204/211+alters+epithelial+physiology.">MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology.</a> FASEB Journal. 24 (5), 1552-1571 (2010).</li><li>He, L., Marioutina, M., Dunaief, J. L., Marneros, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-+and+gene-dosage-dependent+cre-induced+abnormalities+in+the+retinal+pigment+epithelium.">Age- and gene-dosage-dependent cre-induced abnormalities in the retinal pigment epithelium.</a> American Journal of Pathology. 184 (6), 1660-1667 (2014).</li><li>Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+modulation+of+basolateral+membrane+Cl-+conductance+in+chick+retinal+pigment+epithelium:+the+light+peak+and+fast+oscillation.">Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation.</a> Journal of Neurophysiology. 70 (4), 1669-1680 (1993).</li><li>Blaug, S., Quinn, R., Quong, J., Jalickee, S., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelial+function:+a+role+for+CFTR.">Retinal pigment epithelial function: a role for CFTR.</a> Documenta Ophthalmologica. 106 (1), 43-50 (2003).</li><li>Gallemore, R. P., Griff, E. R., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+in+support+of+a+photoreceptoral+origin+for+the+"light-peak+substance".">Evidence in support of a photoreceptoral origin for the "light-peak substance".</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (4), 566-571 (1988).</li><li>Shahi, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+Electroretinogram+after+Kir7.1+Channel+Suppression+Suggests+Role+in+Retinal+Electrophysiology.">Abnormal Electroretinogram after Kir7.1 Channel Suppression Suggests Role in Retinal Electrophysiology.</a> Science Reports. 7 (1), 10651 (2017).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+human+RPE65+P25L+hypomorph+resembles+wild+type+under+normal+light+rearing+but+is+fully+resistant+to+acute+light+damage.">Mouse model of human RPE65 P25L hypomorph resembles wild type under normal light rearing but is fully resistant to acute light damage.</a> Human Molecular Genetics. 24 (15), 4417-4428 (2015).</li></ol>

Критические шаги
Хорошая запись DC-ERG требует стабильных электродов, которые свободны от пузырьков, которые создают артефакты и нежелательный дрейф, поскольку они чрезвычайно чувствительны к outgassing и изменения температуры. Очень важно, чтобы стабильный базовый у...

Эпителий пигмента сетчатки (RPE) является монослой специализированных клеток, которые высовывает задний сегмент глаза и оказывают критические функции для поддержания гомеостазасетчатки 1. RPE поддерживает фоторецепторы путем регенерации их фотон захвата визуального пигмента в процессе, называемомвизуальный цикл 2, участвуя в диурнальный фагоцитоз пролить внешнийсегмент советы 3, и в транспортировке питательных веществ и метаболических продуктов между фоторецепторами и choriocapillaris4,5. Аномалии в функции RPE лежат в основе многочисленных заболеваний сетчатки человека, таких как возрастнаямакулярная дегенерация 6, врожденныйамауроз Лебера 7,8 и лучшая вителлиформная макулярнаядистрофия 9. Поскольку донорские ткани глаз часто трудно получить исключительно для исследовательских целей, модели животных с генетическими модификациями могут предоставить альтернативный способ изученияразвития заболеваний сетчатки 10,11. Кроме того, появление и применение технологии CRISPR cas9 теперь позволяет геномные введения (стук в) или удаления (нокаут) в простой, одношаговый процесс, превосходя ограничения предыдущих технологий таргетинга генов12. Бум доступности новых моделей мыши13 требует более эффективного протокола записи для неинвазивной оценки функции RPE.
Измерение световых электрических реакций RPE может быть достигнуто с помощью метода электроретинограммы (DC-ERG). При использовании в сочетании с обычными записями ERG, которые измеряют фоторецептор (волна) и биполярные (b-волновые)ответы клеток 14, DC-ERG может определить, как ответные свойства RPE изменения с дегенерациейсетчатки 15,16,17 или же дисфункция RPE предшествует потере фоторецептора. Этот протокол описывает метод, адаптированный из работы Marmorstein, Peachey, и коллег, которые впервые разработали метод DC-ERG16,18,19,20 и улучшает воспроизводимость и простоту использования.
Запись DC-ERG затруднена из-за длительного времени приобретения (9 мин), в течение которого любое прерывание или введение шума может осложнить интерпретацию данных. Преимущество этого нового метода заключается в том, что базовые линии достигают стабильного состояния в течение более короткого периода времени, уменьшая вероятность того, что животное пробудится преждевременно от наркоза и менее подвержено образованию пузырьков в капиллярных электродах.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ag/AgCl (mouth) Electrode</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>EP1</td>
			<td>Mouth reference electrode for mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Tile</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>CTS</td>
			<td>Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Cleaning Stick</td>
			<td>Puritan Medical Products</td>
			<td>867-WC No Glue</td>
			<td>To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroretinogram (ERG) System</td>
			<td>Diagnosys LLC</td>
			<td>E3 System</td>
			<td>Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen Burner</td>
			<td>Argos Technologies</td>
			<td>BW20002460</td>
			<td>Or equivlaent to shape glass under flame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary Tube (1.5 mm)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF150-75</td>
			<td>For filling with HBSS and making contact to the cornea</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Buffered Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>14175-095</td>
			<td>Commercially available. Maintain at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Line Filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>6722-5001</td>
			<td>To protect vacuum pump from aerosols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Noise Cable for Microelectrode Holders</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>5372</td>
			<td>Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Ball Joint</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>500871</td>
			<td>For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>MatLab: For editing the analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab Curvefit Toolbox</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab Compiler</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab Runtime version 9.5</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2018b (9.5)</td>
			<td>Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Holders (45 degrees)</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>MEH345-15</td>
			<td>For holding the capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle (25 ga)</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8881250313</td>
			<td>For filling the capillary tubes with HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle (ground) electrode</td>
			<td>Rhythmlink</td>
			<td>13mm - one elctrode</td>
			<td>Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regulator/Power Conditioner</td>
			<td>Furman</td>
			<td>P-1800</td>
			<td>Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (12 mL)</td>
			<td>Monoject</td>
			<td>1181200777</td>
			<td>For filling the capillary tubes with HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-clip</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06852-20</td>
			<td>For electrode holder assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>420120000</td>
			<td>Clear polycarbonate bottom &#38; cover</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmacological treatment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant eye gel</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>0078-0429-47</td>
			<td>Helps lubricates corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine Hydrochloride 2.5%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>17478-201-15</td>
			<td>Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proparacaine Hydrochloride 0.5%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>17478-263-12</td>
			<td>Local anesthetic for ophthalmic instillation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide 0.5%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>17478-101-12</td>
			<td>Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>AnaSed</td>
			<td>sc-362949Rx</td>
			<td>Analgesic and muscle relaxant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetamine (Ketamine HCl)</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>501072</td>
			<td>Anesthetic for intramuscular injections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct-coupled electroretinogram (dc-erg) for recording the light-evoked electrical responses of the mouse retinal pigment epithelium

Эпителий пигмента сетчатки (RPE) является специализированным монослой клеток, стратегически расположенных между сетчаткой и choriocapillaris, которые поддерживают общее здоровье и структурную целостность фоторецепторов. RPE поляризуется, экспонирует апсически и базально расположенные рецепторы или каналы, и выполняет векторную транспортировку воды, ионов, метаболитов и выделяет несколько цитокинов.
Неинвазивные измерения функции RPE in vivo могут быть сделаны с использованием непосредственно связанных ERG (DC-ERG). Методология, стоящая за DC-ERG, была впервые разработана Марморштейном, Пичи и его коллегами с помощью специально построенной системы записи стимуляции, а затем продемонстрирована с использованием коммерчески доступной системы. Техника DC-ERG использует стеклянные капилляры, наполненные буферным соленым раствором Хэнка (HBSS), для измерения более медленных электрических реакций RPE, вызванных изменениями концентрации в подретинном пространстве из-за активности фоторецептора. Длительный световой стимул и длина записи DC-ERG делают его уязвимым для дрейфа и шума, что приводит к низкой урожайности годных к использованию записей. Здесь мы представляем быстрый и надежный метод повышения стабильности записей при одновременном снижении шума с помощью вакуумного давления для уменьшения/устранения пузырьков, которые являются результатом выброса HBSS и держателя электрода. Кроме того, артефакты линии электропередачи затухают с помощью регуляторов напряжения/кондиционера. Мы включаем необходимые протоколы стимуляции света для коммерчески доступной системы ERG, а также скрипты для анализа компонентов DC-ERG: c-волна, быстрое колебание, световой пик и реакция. Благодаря улучшенной простоте записей и быстрому анализу рабочего процесса, этот упрощенный протокол особенно полезен для измерения возрастных изменений в функции RPE, прогрессирования заболевания, а также в оценке фармакологического вмешательства.

Рисунок 2 — выборочный набор данных мышей miR-204 ko/ko cre/' (условный KO) и диких мышей типа (WT). MiR-204 ko/ko cre/ - это мыши с условным нокаутом микроРНК 204 в эпителии пигмента сетчатки. Эти мыши генерируются путем скрещивания floxed miR-204 мышей (производится NEIGEF)22 с VMD2-CRE<sup class="xre...

Watch this Scientific Journal Video about Direct-Coupled Electroretinogram DC-ERG for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Direct-Coupled Electroretinogram DC-ERG for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Здесь мы представляем метод записи световых электрических реакций эпителия пигмента сетчатки (RPE) у мышей с использованием метода, известного как DC-ERGs, впервые описанного Марморштейном, Пичи и его коллегами в начале 2000-х годов.

Прямая электроретинограмма (DC-ERG) для записи световых электрических реакций мыши Сетчатки Пигмент Эпителий

The retinal pigment epithelium (RPE) is a specialized monolayer of cells strategically located between the retina and the choriocapillaris that maintain ...

Метод DC-ERG может быть использован для неумязвимой оценки функции эпителия пигмента сетчатки для мониторинга возрастных изменений или прогрессирования заболевания и оценки фармакологических эффектов вмешательства. Этот метод улучшает способность воспроизведения DC-ERG и простоту использования путем упрощения подготовки капиллярных электродов. Он также может быть дополнен стандартным ohm программное приложение для облегчения анализа.Начните с тщательного скольжения 25-го калибра шприц иглы через силиконовую резиновую прокладку к задней стенке держателя электрода. Заполните основание держателя электрода дегазатным HBSS, медленно убирая иглу, заботясь о том, чтобы не вводить пузырьки, и замените резьбовую крышку без затягивания. Reinsert шприц иглы, чтобы заполнить пустое пространство в зазоре с HBSS и держать капилляры горизонтально при заполнении, чтобы предотвратить решение побега с другого конца.Хватая заполненные капилляры на согнутом конце, медленно вставьте другой конец через ослабленную крышку и затяните крышку винта на место. Наклоните держатели электродов капиллярными электродами, обращенными вверх, чтобы позволить любым пузырям вытекать и дегализировать капилляры в вакуумной камере в течение пяти-десяти минут. Затем медленно отпустите вакуум и пополнить держатели электродов и стеклянные капилляры, как попродемонстрировано.Чтобы сделать пользовательский стенд для держателя микроэлектрода, удалите черные полиацетальные зажимы с одной стороны числа восемь T-клип и использовать основание цилиндра с магнитными шаровыми суставами, обученными пополам, чтобы регулировать высоту. Безопасные модифицированные T-клипы на магнитный шар монтажа винты с M3-размер орехи и слайд примерно в один дюйм конические деревянные ручки, измененные из хлопка наконечник очистки палку, в стенд под углом, чтобы обеспечить микроэлектроник держатель в заказ T-клип магнитного шара совместных стенд. Затем используйте редкоземельные магниты цилиндрической базы, чтобы надежно располагать индивидуальный держатель электрода стоять на металлической пластине сцены, что позволяет 360-градусное вращение на 180-градусной оси.Для выполнения электродного теста, во-первых, аккуратно опустите полностью собранные микроэлектрозы HBSS в небольшой контейнер HBSS. Поместите электрод иглы и серебряный, серебристый хлорид в центре гранулы эталонный электрод в том же HBSS для завершения цепи и выбрать или создать соответствующий идентификатор для описания мыши для тестирования. Чтобы выбрать протокол прямой электроретинограммы, нажмите протоколы и выберите DC-ERG.Нажмите запустить. Диалоговое окно будет всплывающее с информацией о пациенте. Если информация верна, нажмите "да" и перейти к шагам один из шести.Закройте двери в клетку Фарадея и нажмите impedance, чтобы отобразить режим неустумности. Убедитесь, что значения для ссылки на рот, хвост земли и записи электродов являются приемлемыми и нажмите шаг, чтобы перейти к шагу четыре из шести, чтобы проверить базовую стабильность. Чтобы начать просмотр следов, нажмите предварительный просмотр.Следы должны быть низким уровнем шума с пик-пик амплитуды менее 200 микровольт. Чтобы расповести мышь и электроды для эксперимента, анестезировать роговицу под наркозом мыши с каплей 5%proparacaine соляной кислоты перед расширением роговицы с каплей 2,5%фенилэфрин HCL и 5%тропикамид. В программном обеспечении системы ERG убедитесь, что выбран правильный пациент.Нажмите протоколы. Под описанием протокола выберите DC-ERG и нажмите кнопку запуска. Нажмите "да", чтобы убедиться, что правильный тест выполняется.Используйте шаг один из шести, чтобы включить тусклый красный свет внутри купола и поместить мышь на нагретом записывающем столе. Используйте типсы, чтобы тщательно палатку кожи задней ноги. И используя одну руку, чтобы твердо держать игольчатый электрод, используйте другую руку, чтобы вставить электрод подкожно в заднюю ногу, чтобы обеспечить электрод на место.Поместите эталонный серебристый электрод хлорида в рот животного так, чтобы центрированная гранула покоиться вдоль задней щеки и удерживалась на месте за зубами. Перед размещением капиллярных электродов на глаз, положение электрода держатель со стеклянными капиллярами ориентированы вертикально и Флик держатель электрода указательным пальцем, чтобы удалить любые пузырьки, которые, возможно, были введены. Используйте 25-калибровочный иглы, чтобы заполнить капиллярные советы с HBSS и проверить капилляры, чтобы убедиться, что Есть нет пузырьков воздуха в ловушке в советы.Позиция держатель электрода стоять так, что открытые кончики HBSS заполненные капилляры находятся в нежном контакте с роговицей. И заботы, чтобы избежать введения пузырьков, инвертировать смазки глаз гель дозатор отказаться от первоначальных капель. Затем поместите каплю смазочного геля для глаз на каждый глаз, чтобы сохранить проводимость и предотвратить высыхание во время записи.Чтобы записать DC-ERGs, нажмите шаг, чтобы выбрать пятый шаг из шести и нажмите impedance использовать экран проверки impedance для изучения сопротивления левого и правого глаз. Значения неустумности для записывающих электродов на каждом глазу должны быть схожими. А значения неустумности как для наземных, так и для эталонных электродов должны быть менее 10 киломов.Нажмите предварительный просмотр, чтобы просмотреть следы для левого и правого глаз и ждать до 10 минут для стабильной базовой линии, которая будет достигнута. Затем нажмите стоп, чтобы выйти из предварительного просмотра трассировки и нажмите запустить, чтобы начать запись. Здесь показан набор выборочных данных от условного нокаута и мышей дикого типа.В этом анализе, след страдал от мельчайших пузырьков в электроде. Это увеличило пик-пик шума в след. В отдельном анализе пузырьки были устранены с помощью вакуумной камеры перед сборкой микроэлектродов в стендах держателя электрода.Можно рассчитать наилучшие линии соответствия первоначальным 25 секундам, что позволит отколоть скорректированные ответы и определить амплитуды компонентов DC-ERG. Как и ожидалось, снижение экспрессии лечения 7,1 калийных каналов в RPE значительно снижает c-волновые и быстрые колебания, что свидетельствует о значительном ухудшении электрических свойств пигмента сетчатки. Здесь показаны относительные амплитуды компонентов DC-ERG, нормализованные до дикого типа и построенные против относительно двух самых больших световых амплитуд.Эта форма анализа может определить, можно ли объяснить снижение электрических реакций RPE только снижением активности фоторецептора. Или, если есть основной дефект, который возникает в RPE. Не забудьте достичь стабильной базовой линии до перехода к записи мыши и периодически пересматривать электроды для пузырьков, которые, возможно, были введены.Темно-адаптированные ERG могут быть записаны до DC-ERG для измерения конусо-управляемой функции сетчатки. Свето-адаптированные ERGs также могут быть выполнены после DC-ERG для оценки конусо-управляемых реакций сетчатки.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium

LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations

LabVIEW управлением Романа Nanoliter Осмометр для Ice привязки исследования белков

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition ...

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Производство дисульфид-стабилизировались трансмембранного пептидные комплексы для структурных исследований

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

A High-throughput-compatible FRET-based Platform for Identification and Characterization of Botulinum Neurotoxin Light Chain Modulators

Botulinum neurotoxin (BoNT) is a potent and potentially lethal bacterial toxin that binds to host motor neurons, is internalized into the cell, and ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Формирование упорядоченных биомолекулярных структур по самосборки коротких пептидов

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Optimization of Synthetic Proteins: Identification of Interpositional Dependencies Indicating Structurally and/or Functionally Linked Residues

Оптимизация синтетических белков: Идентификация Interpositional зависимостей индикации Конструктивно и / или функционально связанных остатков

Protein alignments are commonly used to evaluate the similarity of protein residues, and the derived consensus sequence used for identifying functional ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Синтез белка биоконъюгатов<em&gt; с помощью</em&gt; Цистеин-малеимид химии

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Facile Синтез червеобразных мицелл с помощью видимого света опосредованного дисперсионной полимеризации с использованием Photoredox Catalyst

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Использование капиллярный электрофорез для Количественно органических кислот из растительных тканей: Случай испытания экспертизы<em&gt; Арабика</em&gt; Семена

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

Исследования в взаимодействий аминокислот и пептидов с использованием неорганических материалов с использованием одномолекулярной силовой микроскопии

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...