Name: direct-coupled electroretinogram (dc-erg) for recording the light-evoked electrical responses of the mouse retinal pigment epithelium
Uploaded: 2020-07-14T12:30:00
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Este trabajo fue apoyado por los fondos intramuros de NEI. Los autores reconocen sinceramente al Dr. Sheldon Miller por su orientación científica, asesoramiento técnico y experiencia en fisiología y enfermedades de RPE. Los autores agradecen a Megan Kopera y al personal de cuidado de animales por administrar las colonias de ratones, y al Dr. Tarun Bansal, Raymond Zhou y Yuan Wang por el apoyo técnico.

Este protocolo sigue las pautas de cuidado animal descritas en el protocolo de estudio animal aprobado por el Comité de Cuidado y Uso Animal del Instituto Nacional del Ojo.
1. Importación de protocolos de estimulación de la luz para DC-ERG
NOTA: Siga las instrucciones a continuación para importar los protocolos de estimulación de la luz para el DC-ERG en el software del sistema ERG (Tabla de materiales). El protocolo consiste en un intervalo de p...

<ol>
	<li>Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+the+retinal+pigment+epithelium+and+the+neural+retina.">Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina.</a> Documenta Ophthalmologica. 60 (4), 327-346 (1985).</li><li>Sahu, B., Maeda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPE+Visual+Cycle+and+Biochemical+Phenotypes+of+Mutant+Mouse+Models.">RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models.</a> Methods in Molecular Biology. 1753, 89-102 (2018).</li><li>Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. 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O., Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+in+the+RPE.">Ion channels in the RPE.</a> Progress in Retinal Eye Research. 26 (3), 263-301 (2007).</li><li>Gundersen, D., Orlowski, J., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+polarity+of+Na,K-ATPase+in+retinal+pigment+epithelium+is+linked+to+a+reversal+of+the+ankyrin-fodrin+submembrane+cytoskeleton.">Apical polarity of Na,K-ATPase in retinal pigment epithelium is linked to a reversal of the ankyrin-fodrin submembrane cytoskeleton.</a> Journal of Cell Biology. 112 (5), 863-872 (1991).</li><li>Fletcher, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+age-related+macular+degeneration+using+animal+models.">Studying age-related macular degeneration using animal models.</a> Optometry and Vision Science. 91 (8), 878-886 (2014).</li><li>Gu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+RPE65+cause+autosomal+recessive+childhood-onset+severe+retinal+dystrophy.">Mutations in RPE65 cause autosomal recessive childhood-onset severe retinal dystrophy.</a> Nature Genetics. 17 (2), 194-197 (1997).</li><li>Marlhens, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+RPE65+cause+Leber's+congenital+amaurosis.">Mutations in RPE65 cause Leber's congenital amaurosis.</a> Nature Genetics. 17 (2), 139-141 (1997).</li><li>Marmorstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=the+product+of+the+Best+vitelliform+macular+dystrophy+gene+(VMD2),+localizes+to+the+basolateral+plasma+membrane+of+the+retinal+pigment+epithelium.">the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).</li><li>Chang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+studies+of+retinal+degeneration+and+diseases.">Mouse models for studies of retinal degeneration and diseases.</a> Methods in Molecular Biology. 935, 27-39 (2013).</li><li>Collin, G. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+responses+of+the+retinal+pigment+epithelium:+changes+accompanying+photoreceptor+loss+in+the+mouse.">Light-evoked responses of the retinal pigment epithelium: changes accompanying photoreceptor loss in the mouse.</a> Journal of Neurophysiology. 104 (1), 391-402 (2010).</li><li>Wu, J., Marmorstein, A. D., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+abnormalities+in+the+retinal+pigment+epithelium+of+CFTR+mutant+mice.">Functional abnormalities in the retinal pigment epithelium of CFTR mutant mice.</a> Experimental Eye Research. 83 (2), 424-428 (2006).</li><li>Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+responses+of+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).</li><li>Peachey, N. S., Stanton, J. B., Marmorstein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+recording+and+response+characteristics+of+the+rat+dc-electroretinogram.">Noninvasive recording and response characteristics of the rat dc-electroretinogram.</a> Visual Neuroscience. 19 (6), 693-701 (2002).</li><li>Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+retinal+pigment+epithelium+dysfunction+is+concomitant+with+hyperglycemia+in+mouse+models+of+type+1+and+type+2+diabetes.">Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).</li><li>Marmorstein, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light+peak+of+the+electroretinogram+is+dependent+on+voltage-gated+calcium+channels+and+antagonized+by+bestrophin+(best-1).">The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1).</a> Journal of General Physiology. 127 (5), 577-589 (2006).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invest.+Ophtalmol.+Vis.+Sci.">Invest. Ophtalmol. Vis. Sci.</a> Annual Meeting for the Association for Research in Vision and Ophthalmology. , 3568 (2017).</li><li>Iacovelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Cre+transgenic+mice+with+postnatal+RPE-specific+ocular+expression.">Generation of Cre transgenic mice with postnatal RPE-specific ocular expression.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1378-1383 (2011).</li><li>Wang, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-204/211+alters+epithelial+physiology.">MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology.</a> FASEB Journal. 24 (5), 1552-1571 (2010).</li><li>He, L., Marioutina, M., Dunaief, J. L., Marneros, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-+and+gene-dosage-dependent+cre-induced+abnormalities+in+the+retinal+pigment+epithelium.">Age- and gene-dosage-dependent cre-induced abnormalities in the retinal pigment epithelium.</a> American Journal of Pathology. 184 (6), 1660-1667 (2014).</li><li>Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+modulation+of+basolateral+membrane+Cl-+conductance+in+chick+retinal+pigment+epithelium:+the+light+peak+and+fast+oscillation.">Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation.</a> Journal of Neurophysiology. 70 (4), 1669-1680 (1993).</li><li>Blaug, S., Quinn, R., Quong, J., Jalickee, S., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelial+function:+a+role+for+CFTR.">Retinal pigment epithelial function: a role for CFTR.</a> Documenta Ophthalmologica. 106 (1), 43-50 (2003).</li><li>Gallemore, R. P., Griff, E. R., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+in+support+of+a+photoreceptoral+origin+for+the+"light-peak+substance".">Evidence in support of a photoreceptoral origin for the "light-peak substance".</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (4), 566-571 (1988).</li><li>Shahi, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+Electroretinogram+after+Kir7.1+Channel+Suppression+Suggests+Role+in+Retinal+Electrophysiology.">Abnormal Electroretinogram after Kir7.1 Channel Suppression Suggests Role in Retinal Electrophysiology.</a> Science Reports. 7 (1), 10651 (2017).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+human+RPE65+P25L+hypomorph+resembles+wild+type+under+normal+light+rearing+but+is+fully+resistant+to+acute+light+damage.">Mouse model of human RPE65 P25L hypomorph resembles wild type under normal light rearing but is fully resistant to acute light damage.</a> Human Molecular Genetics. 24 (15), 4417-4428 (2015).</li></ol>

Pasos críticos
Una buena grabación DC-ERG requiere electrodos estables que están libres de burbujas que crean artefactos y deriva no deseada, ya que son extremadamente sensibles a la desgasificación y los cambios de temperatura. Es esencial que se alcance una línea de base estable cuando los electrodos se colocan en la solución de baño HBSS antes de continuar con la grabación del ratón. Las pequeñas burbujas tienden a acumularse en la base del electrodo capilar o alr...

El epitelio pigmentario de la retina (RPE) es una monocapa de células especializadas que recuben el segmento posterior del ojo y ejercen funciones críticas para mantener la homeostasis retinal1. El RPE soporta fotorreceptores mediante la regeneración de su pigmento visual fotones-captura en un proceso llamado ciclo visual2,participando en la fagocitosis diurna del segmento exterior del cobertizo puntas3,y en el transporte de nutrientes y productos metabólicos entre fotorreceptores y los coriocapillaris4,5. Las anomalías en la función de la EPH subyacen a numerosas enfermedades de la retina humana, como la degeneración macular relacionada con la edad6,la amaurosis congénita de Leber7,8 y la mejor distrofia macular vitelliforma9. Como los tejidos oculares de los donantes a menudo son difíciles de obtener únicamente con fines de investigación, los modelos animales con modificaciones genéticas pueden proporcionar una forma alternativa de estudiar el desarrollo de enfermedades de la retina10,11. Además, la aparición y aplicación de la tecnología CRISPR cas9 permite ahora introducciones genómicas (knock-in) o eliminaciones (knock-out) en un proceso simple de un solo paso superando las limitaciones de las tecnologías de apuntamiento genético anterior12. La auge en la disponibilidad de los nuevos modelos deratón 13 requiere un protocolo de grabación más eficiente para evaluar de forma no invasiva la función RPE.
La medición de las respuestas eléctricas evocadas por la luz del RPE se puede lograr mediante una técnica de electrorretinograma de acoplamiento directo (DC-ERG). Cuando se utiliza en combinación con grabaciones ERG convencionales que miden las respuestas celulares del fotorreceptor (onda a) y bipolar (onda b)14, el DC-ERG puede definir cómo cambian las propiedades de respuesta del RPE con la degeneración de la retina15,16,17 o si la disfunción del RPE precede a la pérdida del fotorreceptor. Este protocolo describe un método adaptado del trabajo de Marmorstein, Peachey y sus colegas que desarrollaron por primera vez la técnica DC-ERG16,18,19,20 y mejora la reproducibilidad y facilidad de uso.
La grabación DC-ERG es difícil de realizar debido al largo tiempo de adquisición (9 min) durante el cual cualquier interrupción o introducción de ruido puede complicar la interpretación de los datos. La ventaja de este nuevo método es que las líneas de base alcanzan un estado estable en un período de tiempo más corto reduciendo la probabilidad de que el animal despierte prematuramente de la anestesia y sea menos propenso a la formación de burbujas en los electrodos capilares.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ag/AgCl (mouth) Electrode</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>EP1</td>
			<td>Mouth reference electrode for mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Tile</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>CTS</td>
			<td>Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Cleaning Stick</td>
			<td>Puritan Medical Products</td>
			<td>867-WC No Glue</td>
			<td>To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroretinogram (ERG) System</td>
			<td>Diagnosys LLC</td>
			<td>E3 System</td>
			<td>Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen Burner</td>
			<td>Argos Technologies</td>
			<td>BW20002460</td>
			<td>Or equivlaent to shape glass under flame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary Tube (1.5 mm)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF150-75</td>
			<td>For filling with HBSS and making contact to the cornea</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Buffered Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>14175-095</td>
			<td>Commercially available. Maintain at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Line Filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>6722-5001</td>
			<td>To protect vacuum pump from aerosols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Noise Cable for Microelectrode Holders</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>5372</td>
			<td>Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Ball Joint</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>500871</td>
			<td>For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>MatLab: For editing the analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab Curvefit Toolbox</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab Compiler</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab Runtime version 9.5</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2018b (9.5)</td>
			<td>Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Holders (45 degrees)</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>MEH345-15</td>
			<td>For holding the capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle (25 ga)</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8881250313</td>
			<td>For filling the capillary tubes with HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle (ground) electrode</td>
			<td>Rhythmlink</td>
			<td>13mm - one elctrode</td>
			<td>Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regulator/Power Conditioner</td>
			<td>Furman</td>
			<td>P-1800</td>
			<td>Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (12 mL)</td>
			<td>Monoject</td>
			<td>1181200777</td>
			<td>For filling the capillary tubes with HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-clip</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06852-20</td>
			<td>For electrode holder assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>420120000</td>
			<td>Clear polycarbonate bottom &#38; cover</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmacological treatment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant eye gel</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>0078-0429-47</td>
			<td>Helps lubricates corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine Hydrochloride 2.5%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>17478-201-15</td>
			<td>Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proparacaine Hydrochloride 0.5%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>17478-263-12</td>
			<td>Local anesthetic for ophthalmic instillation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide 0.5%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>17478-101-12</td>
			<td>Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>AnaSed</td>
			<td>sc-362949Rx</td>
			<td>Analgesic and muscle relaxant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetamine (Ketamine HCl)</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>501072</td>
			<td>Anesthetic for intramuscular injections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct-coupled electroretinogram (dc-erg) for recording the light-evoked electrical responses of the mouse retinal pigment epithelium

El epitelio pigmentario de la retina (RPE) es una monocapa especializada de células ubicadas estratégicamente entre la retina y los coriocapillaris que mantienen la salud general y la integridad estructural de los fotorreceptores. El RPE está polarizado, exhibiendo receptores o canales ubicados de manera apóptica y basal, y realiza el transporte vectorial de agua, iones, metabolitos y secreta varias citoquinas.
Las mediciones in vivo no invasivas de la función RPE se pueden realizar utilizando ERG de acoplamiento directo (DC-ERG). La metodología detrás del DC-ERG fue pionera por Marmorstein, Peachey y sus colegas utilizando un sistema de grabación de estimulación personalizado y más tarde demostrado utilizando un sistema disponible comercialmente. La técnica DC-ERG utiliza capilares de vidrio llenos de solución de sal tamponada de Hank (HBSS) para medir las respuestas eléctricas más lentas del RPE provocadas por cambios de concentración evocados por la luz en el espacio subretinal debido a la actividad del fotorreceptor. El prolongado estímulo de luz y la duración de la grabación DC-ERG lo hacen vulnerable a la deriva y al ruido, lo que resulta en un bajo rendimiento de grabaciones utilizables. Aquí, presentamos un método rápido y confiable para mejorar la estabilidad de las grabaciones al tiempo que reduce el ruido mediante el uso de la presión de vacío para reducir / eliminar las burbujas que resultan de la desgasificación del HBSS y el soporte del electrodo. Además, los artefactos de la línea de alimentación se atenúan mediante un regulador de voltaje/acondicionador de potencia. Incluimos los protocolos de estimulación de la luz necesarios para un sistema ERG disponible comercialmente, así como scripts para el análisis de los componentes DC-ERG: onda c, oscilación rápida, pico de luz y respuesta desactivada. Debido a la mayor facilidad de grabaciones y el flujo de trabajo de análisis rápido, este protocolo simplificado es particularmente útil para medir los cambios relacionados con la edad en la función de RPE, la progresión de la enfermedad y en la evaluación de la intervención farmacológica.

La Figura 2 es un conjunto de datos de muestra de miR-204 ko/ko cre/+ (KO condicional) y ratones de tipo salvaje (WT). MiR-204 ko/ko cre/+ son ratones con un nocaut condicional de microRNA 204 en el epitelio pigmentario de la retina. Estos ratones se generan cruzando ratones miR-204 con floxed (producidos por NEIGEF)22 con ratones VMD2-CRE23. MiR-204 se expresa en gran medida en el RPE donde regula la expresión de proteínas críticas para la ...

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Direct-Coupled Electroretinogram DC-ERG for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Aquí, presentamos un método para registrar las respuestas eléctricas evocadas por la luz del epitelio pigmentario de la retina (RPE) en ratones utilizando una técnica conocida como DC-ERGs descrita por primera vez por Marmorstein, Peachey y sus colegas a principios de la década de 2000.

Electroretinograma de acoplamiento directo (DC-ERG) para registrar las respuestas eléctricas evocadas por la luz del epitelio del pigmento retinivo del ratón

The retinal pigment epithelium (RPE) is a specialized monolayer of cells strategically located between the retina and the choriocapillaris that maintain ...

La técnica DC-ERG se puede utilizar para la evaluación no evasiva de la función de epitelio pigmentario de la retina para monitorear los cambios relacionados con la edad o la progresión de la enfermedad y para evaluar los efectos de la intervención farmacológica. Esta técnica mejora la capacidad de reproducción de DC-ERG y la facilidad de uso simplificando la preparación del electrodo capilar. También se puede complementar con una aplicación de software ohm estándar para facilitar el análisis.Comience deslizando cuidadosamente una aguja de jeringa de calibre 25 a través de la junta de goma de silicona hasta la pared posterior del soporte del electrodo. Llene la base del soporte del electrodo con HBSS desgasificación mientras retrae lentamente la aguja, teniendo cuidado de no introducir burbujas, y reemplace la tapa roscada sin apretar. Vuelva a insertar la aguja de la jeringa para llenar el espacio vacío dentro del espacio con HBSS y sostenga el capilar horizontalmente mientras se llena para evitar que la solución escape del otro extremo.Sujetando el capilar lleno en el extremo doblado, inserte lentamente el otro extremo a través de la tapa aflojada y apriete la tapa del tornillo en su lugar. Incline los soportes de electrodos con los electrodos capilares hacia arriba para permitir que las burbujas fluyan y desgasiquen los capilares en una cámara de vacío durante cinco a 10 minutos. A continuación, suelte lentamente el vacío y rellene los soportes de electrodos y capilares de vidrio, como se ha demostrado.Para hacer un soporte personalizado para el soporte de microelectrodo, retire los clips poliacetales negros de un lado de un clip en T número ocho y utilice una base de cilindro con juntas magnéticas de bolas mecanizadas por la mitad para ajustar la altura. Fije los clips en T modificados a los tornillos magnéticos de montaje de bolas con tuercas de tamaño M3 y un portaobjetos en un mango de madera cónico de aproximadamente una pulgada, modificado desde un palo de limpieza de punta de algodón, en el soporte en un ángulo para fijar el soporte de microelectrodo en el soporte de junta magnética de bola magnética T-clip hecho a medida. A continuación, utilice la base del cilindro de imanes de tierras raras para colocar de forma segura el soporte de electrodo personalizado en la placa metálica del escenario, lo que permite una rotación de 360 grados en un eje de 180 grados.Para realizar una prueba de electrodos, primero, baje suavemente los microelectrodos capilares llenos de HBSS completamente ensamblados en un pequeño recipiente de HBSS. Coloque el electrodo de tierra de la aguja y el electrodo de referencia de pellet centrado en cloruro de plata en el mismo HBSS para completar el circuito y seleccionar o crear un identificador adecuado para describir el ratón que se va a probar. Para seleccionar el protocolo de electroretinograma acoplado directo que se va a realizar, haga clic en los protocolos y seleccione DC-ERG.Haga clic en Ejecutar. Aparecerá un cuadro de diálogo con la información del paciente. Si la información es correcta, haga clic en Sí y continúe con los pasos uno de seis.Cierre las puertas de la jaula de Faraday y haga clic en la impedancia para mostrar el modo de impedancia. Compruebe que los valores de la referencia de la boca, el suelo de cola y los electrodos de grabación son aceptables y haga clic en el paso para continuar con el paso cuatro de seis para probar la estabilidad de línea de base. Para comenzar a ver los seguimientos, haga clic en vista previa.Las trazas deben ser de bajo ruido con una amplitud pico a pico de menos de 200 microvoltas. Para colocar el ratón y los electrodos para un experimento, anestesia la córnea de un ratón sedado con una gota de 5%ácido clorhídrico proparacaína antes de dilatar la córnea con una gota de 2,5% fenilefrina HCL y 5%tropicamida. En el software del sistema ERG, verifique que el paciente correcto esté seleccionado.Haga clic en protocolos. En Descripción del protocolo, seleccione DC-ERG y haga clic en Ejecutar. Haga clic en Sí para comprobar que se está realizando la prueba correcta.Utilice el paso uno de seis para encender una luz roja tenue dentro de la cúpula y coloque el ratón sobre una mesa de grabación con calefacción. Use fórceps para comprar cuidadosamente la piel de la pierna trasera. Y usando una mano para sujetar firmemente el electrodo de la aguja, utilice la otra mano para insertar el electrodo por vía subcutánea en la pierna trasera para asegurar el electrodo en su lugar.Coloque la plata de referencia, electrodo de cloruro de plata en la boca del animal para que el pellet centrado se apoya a lo largo de la mejilla posterior y se mantiene en su lugar detrás de los dientes. Antes de colocar los electrodos capilares en el ojo, coloque el soporte del electrodo con los capilares de vidrio orientados verticalmente y deslice el soporte del electrodo con un dedo índice para eliminar cualquier burbuja que pueda haber sido introducida. Utilice una aguja de calibre 25 para llenar las puntas capilares con HBSS e inspeccione los capilares para asegurarse de que no haya burbujas de aire atrapadas en las puntas.Coloque el soporte del soporte del electrodo de modo que las puntas abiertas de los capilares llenos de HBSS estén en contacto suave con la córnea. Y teniendo cuidado de evitar la introducción de burbujas, invierta el dispensador de gel para los ojos lubricante para desechar las gotas iniciales. A continuación, coloque una gota de gel lubricante para los ojos en cada ojo para mantener la conductividad y evitar la desceración durante la grabación.Para grabar los DC-ERG, haga clic en el paso para seleccionar el paso cinco de seis y haga clic en la impedancia para utilizar la pantalla de comprobación de impedancia para examinar las resistencias de los ojos izquierdo y derecho. Los valores de impedancia para los electrodos de grabación en cada ojo deben ser similares. Y los valores de impedancia para los electrodos de tierra y de referencia deben ser inferiores a 10 kilohms.Haga clic en vista previa para ver los trazos de los ojos izquierdo y derecho y espere hasta 10 minutos para que se logre una línea base estable. A continuación, haga clic en Detener para salir de la vista previa de seguimiento y haga clic en Ejecutar para iniciar la grabación. Aquí, se muestra un conjunto de datos de ejemplo de ratones condicionales knockout y de tipo salvaje.En este análisis, el rastro sufría de burbujas di minutos en el electrodo. Aumentó el ruido pico a pico en la traza. En un análisis separado, las burbujas se eliminaron utilizando la cámara de vacío antes de ensamblar los microelectrodos dentro de los soportes del soporte del electrodo.Se pueden calcular las mejores líneas de ajuste a los 25 segundos iniciales, lo que permite volver a trazar las respuestas corregidas por deriva y identificar las amplitudes de los componentes DC-ERG. Como era de esperar, la reducción de la expresión de los canales de potasio de cura 7.1 en el RPE atenúa en gran medida la onda c y la oscilación rápida, lo que indica un deterioro significativo de las propiedades eléctricas del epitelio pigmentario de la retina. Aquí, se muestran las amplitudes relativas de los componentes DC-ERG, normalizados a de tipo salvaje y trazados contra las dos amplitudes de onda a evocadas por luz más grandes.Esta forma de análisis puede determinar si las respuestas eléctricas reducidas del IR se pueden tener en cuenta mediante la reducción de la actividad del fotorreceptor solo. O si hay un defecto subyacente que se origina en el RPE. Recuerde lograr una línea de base estable antes de pasar a la grabación del ratón y volver a insertar los electrodos periódicamente para las burbujas que pueden haber sido introducidas.Los ERG adaptados a la oscuridad se pueden grabar antes del DC-ERG para medir la función de retina impulsada por el cono. Los ERG adaptados a la luz también se pueden realizar después del DC-ERG para evaluar las respuestas de la retina impulsadas por el cono.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium

LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations

LabVIEW operado Novela Osmometer nanolitros de Investigaciones de hielo de fijación con proteínas

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition ...

Investigación

Química

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

La producción de disulfuro estabilizados complejos transmembrana de péptidos de Estudios Estructurales

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

A High-throughput-compatible FRET-based Platform for Identification and Characterization of Botulinum Neurotoxin Light Chain Modulators

Botulinum neurotoxin (BoNT) is a potent and potentially lethal bacterial toxin that binds to host motor neurons, is internalized into the cell, and ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Formación de estructuras biomoleculares ordenada por el auto-ensamblaje de péptidos cortos

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Optimization of Synthetic Proteins: Identification of Interpositional Dependencies Indicating Structurally and/or Functionally Linked Residues

Optimización de las proteínas sintéticas: Identificación de interposicional Dependencias de indicación Estructuralmente y / o Residuos Funcionalmente Vinculados

Protein alignments are commonly used to evaluate the similarity of protein residues, and the derived consensus sequence used for identifying functional ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

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Síntesis de Proteínas bioconjugados<em&gt; vía</em&gt; Química cisteína-maleimida

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Síntesis Facile de micelas similares a gusanos de luz visible mediada por dispersión Polimerización con catalizador Photoredox

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

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Utilizando electroforesis capilar para cuantificar ácidos orgánicos a partir de Tejidos Vegetales: Un caso de prueba del examen<em&gt; Coffea arabica</em&gt; Semillas

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

Miradas en torno a las interacciones de los aminoácidos y péptidos con materiales inorgánicos Uso de una sola molécula de la Fuerza Espectroscopia

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...