Name: direct-coupled electroretinogram (dc-erg) for recording the light-evoked electrical responses of the mouse retinal pigment epithelium
Uploaded: 2020-07-14T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct-Coupled Electroretinogram DC-ERG for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Detta arbete stöddes av NEI intramural fonder. Författarna erkänner uppriktigt Dr Sheldon Miller för hans vetenskapliga vägledning, teknisk rådgivning och expertis inom RPE fysiologi och sjukdom. Författarna tackar Megan Kopera och djurvårdspersonal för att hantera musen kolonier, och Dr Tarun Bansal, Raymond Zhou, och Yuan Wang för tekniskt stöd.

Detta protokoll följer de riktlinjer för djurvård som beskrivs i djurstudieprotokollet som godkänts av Animal Care and Use Committee of the National Eye Institute.
1. Importerande ljusstimuleringsprotokoll för DC-ERG
OBS: Följ anvisningarna nedan för att importera protokollen för ljusstimulering för DC-ERG till ERG-systemets programvara (Table of Materials). Protokollet består av en 0,5 min pre-stimulus intervall, följt av ett steg av ljus ...

<ol>
	<li>Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+the+retinal+pigment+epithelium+and+the+neural+retina.">Interactions between the retinal pigment epithelium and the neural retina.</a> Documenta Ophthalmologica. 60 (4), 327-346 (1985).</li><li>Sahu, B., Maeda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RPE+Visual+Cycle+and+Biochemical+Phenotypes+of+Mutant+Mouse+Models.">RPE Visual Cycle and Biochemical Phenotypes of Mutant Mouse Models.</a> Methods in Molecular Biology. 1753, 89-102 (2018).</li><li>Mazzoni, F., Safa, H., Finnemann, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+photoreceptor+outer+segment+phagocytosis:+use+and+utility+of+RPE+cells+in+culture.">Understanding photoreceptor outer segment phagocytosis: use and utility of RPE cells in culture.</a> Experimental Eye Resarch. 126, 51-60 (2014).</li><li>Wimmers, S., Karl, M. O., Strauss, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+channels+in+the+RPE.">Ion channels in the RPE.</a> Progress in Retinal Eye Research. 26 (3), 263-301 (2007).</li><li>Gundersen, D., Orlowski, J., Rodriguez-Boulan, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+polarity+of+Na,K-ATPase+in+retinal+pigment+epithelium+is+linked+to+a+reversal+of+the+ankyrin-fodrin+submembrane+cytoskeleton.">Apical polarity of Na,K-ATPase in retinal pigment epithelium is linked to a reversal of the ankyrin-fodrin submembrane cytoskeleton.</a> Journal of Cell Biology. 112 (5), 863-872 (1991).</li><li>Fletcher, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studying+age-related+macular+degeneration+using+animal+models.">Studying age-related macular degeneration using animal models.</a> Optometry and Vision Science. 91 (8), 878-886 (2014).</li><li>Gu, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+RPE65+cause+autosomal+recessive+childhood-onset+severe+retinal+dystrophy.">Mutations in RPE65 cause autosomal recessive childhood-onset severe retinal dystrophy.</a> Nature Genetics. 17 (2), 194-197 (1997).</li><li>Marlhens, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+RPE65+cause+Leber's+congenital+amaurosis.">Mutations in RPE65 cause Leber's congenital amaurosis.</a> Nature Genetics. 17 (2), 139-141 (1997).</li><li>Marmorstein, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=the+product+of+the+Best+vitelliform+macular+dystrophy+gene+(VMD2),+localizes+to+the+basolateral+plasma+membrane+of+the+retinal+pigment+epithelium.">the product of the Best vitelliform macular dystrophy gene (VMD2), localizes to the basolateral plasma membrane of the retinal pigment epithelium.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (23), 12758-12763 (2000).</li><li>Chang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+for+studies+of+retinal+degeneration+and+diseases.">Mouse models for studies of retinal degeneration and diseases.</a> Methods in Molecular Biology. 935, 27-39 (2013).</li><li>Collin, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Models+of+Inherited+Retinal+Degeneration+with+Photoreceptor+Cell+Loss.">Mouse Models of Inherited Retinal Degeneration with Photoreceptor Cell Loss.</a> Cells. 9 (4), (2020).</li><li>Shrock, E., G&#252;ell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+in+Animals+and+Animal+Models.">CRISPR in Animals and Animal Models.</a> Progress in Molecular Biology and Translational Science. 152, 95-114 (2017).</li><li>Smalley, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+mouse+model+boom,+rat+model+renaissance.">CRISPR mouse model boom, rat model renaissance.</a> Nature Biotechnology. 34 (9), 893-894 (2016).</li><li>Benchorin, G., Calton, M. A., Beaulieu, M. O., Vollrath, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+Murine+Retinal+Function+by+Electroretinography.">Assessment of Murine Retinal Function by Electroretinography.</a> Bio Protocol. 7 (7), (2017).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+phagolysosomal+activity+by+miR-204+critically+influences+structure+and+function+of+retinal+pigment+epithelium/retina.">Regulation of phagolysosomal activity by miR-204 critically influences structure and function of retinal pigment epithelium/retina.</a> Human Molecular Genetics. 28 (20), 3355-3368 (2019).</li><li>Samuels, I. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+responses+of+the+retinal+pigment+epithelium:+changes+accompanying+photoreceptor+loss+in+the+mouse.">Light-evoked responses of the retinal pigment epithelium: changes accompanying photoreceptor loss in the mouse.</a> Journal of Neurophysiology. 104 (1), 391-402 (2010).</li><li>Wu, J., Marmorstein, A. D., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+abnormalities+in+the+retinal+pigment+epithelium+of+CFTR+mutant+mice.">Functional abnormalities in the retinal pigment epithelium of CFTR mutant mice.</a> Experimental Eye Research. 83 (2), 424-428 (2006).</li><li>Wu, J., Peachey, N. S., Marmorstein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+responses+of+the+mouse+retinal+pigment+epithelium.">Light-evoked responses of the mouse retinal pigment epithelium.</a> Journal of Neurophysiology. 91 (3), 1134-1142 (2004).</li><li>Peachey, N. S., Stanton, J. B., Marmorstein, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+recording+and+response+characteristics+of+the+rat+dc-electroretinogram.">Noninvasive recording and response characteristics of the rat dc-electroretinogram.</a> Visual Neuroscience. 19 (6), 693-701 (2002).</li><li>Samuels, I. S., Bell, B. A., Pereira, A., Saxon, J., Peachey, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+retinal+pigment+epithelium+dysfunction+is+concomitant+with+hyperglycemia+in+mouse+models+of+type+1+and+type+2+diabetes.">Early retinal pigment epithelium dysfunction is concomitant with hyperglycemia in mouse models of type 1 and type 2 diabetes.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1085-1099 (2015).</li><li>Marmorstein, L. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+light+peak+of+the+electroretinogram+is+dependent+on+voltage-gated+calcium+channels+and+antagonized+by+bestrophin+(best-1).">The light peak of the electroretinogram is dependent on voltage-gated calcium channels and antagonized by bestrophin (best-1).</a> Journal of General Physiology. 127 (5), 577-589 (2006).</li><li>Zhang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invest.+Ophtalmol.+Vis.+Sci.">Invest. Ophtalmol. Vis. Sci.</a> Annual Meeting for the Association for Research in Vision and Ophthalmology. , 3568 (2017).</li><li>Iacovelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Cre+transgenic+mice+with+postnatal+RPE-specific+ocular+expression.">Generation of Cre transgenic mice with postnatal RPE-specific ocular expression.</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 52 (3), 1378-1383 (2011).</li><li>Wang, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-204/211+alters+epithelial+physiology.">MicroRNA-204/211 alters epithelial physiology.</a> FASEB Journal. 24 (5), 1552-1571 (2010).</li><li>He, L., Marioutina, M., Dunaief, J. L., Marneros, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-+and+gene-dosage-dependent+cre-induced+abnormalities+in+the+retinal+pigment+epithelium.">Age- and gene-dosage-dependent cre-induced abnormalities in the retinal pigment epithelium.</a> American Journal of Pathology. 184 (6), 1660-1667 (2014).</li><li>Gallemore, R. P., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-evoked+modulation+of+basolateral+membrane+Cl-+conductance+in+chick+retinal+pigment+epithelium:+the+light+peak+and+fast+oscillation.">Light-evoked modulation of basolateral membrane Cl- conductance in chick retinal pigment epithelium: the light peak and fast oscillation.</a> Journal of Neurophysiology. 70 (4), 1669-1680 (1993).</li><li>Blaug, S., Quinn, R., Quong, J., Jalickee, S., Miller, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinal+pigment+epithelial+function:+a+role+for+CFTR.">Retinal pigment epithelial function: a role for CFTR.</a> Documenta Ophthalmologica. 106 (1), 43-50 (2003).</li><li>Gallemore, R. P., Griff, E. R., Steinberg, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+in+support+of+a+photoreceptoral+origin+for+the+"light-peak+substance".">Evidence in support of a photoreceptoral origin for the "light-peak substance".</a> Investigative Ophthalmology and Visual Science. 29 (4), 566-571 (1988).</li><li>Shahi, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+Electroretinogram+after+Kir7.1+Channel+Suppression+Suggests+Role+in+Retinal+Electrophysiology.">Abnormal Electroretinogram after Kir7.1 Channel Suppression Suggests Role in Retinal Electrophysiology.</a> Science Reports. 7 (1), 10651 (2017).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+human+RPE65+P25L+hypomorph+resembles+wild+type+under+normal+light+rearing+but+is+fully+resistant+to+acute+light+damage.">Mouse model of human RPE65 P25L hypomorph resembles wild type under normal light rearing but is fully resistant to acute light damage.</a> Human Molecular Genetics. 24 (15), 4417-4428 (2015).</li></ol>

Kritiska steg
En bra DC-ERG-inspelning kräver stabila elektroder som är fria från bubblor som skapar artefakter och oönskad drift då de är extremt känsliga för utgasning och temperaturförändringar. Det är väsentligt att en stabil baslinje uppnås när elektroderna placeras i HBSS-badlösningen innan man går vidare med musinspelningen. Små bubblor tenderar att samla vid basen av kapillärelektroden eller runt silikonpackningen och är svåra att se när elektrodh?...

Den näthinnans pigment epitel (RPE) är en monolayer av specialiserade celler som linje den bakre delen av ögat och utöva kritiska funktioner för att upprätthålla näthinnans homeostas1. Den RPE stöder fotoreceptorer genom att regenerera deras foton-fånga visuella pigment i en process som kallas den visuellacykeln 2, genom att delta i dagaktiva fagocytos av skjul yttre segment tips3, och i transporten av näringsämnen och metaboliska produkter mellan fotoreceptorer och choriocapillaris4,5. Avvikelser i RPE funktion ligger bakom ett flertal mänskliga näthinnesjukdomar, såsom åldersrelaterad makuladegeneration6, Lebers medfödda amaurosis7,8 och Bästa vitelliform makuladystrofi9. Eftersom donatorögonvävnader ofta är svåra att få enbart för forskningsändamål kan djurmodeller med genetiska modifieringar ge ett alternativt sätt att studera utvecklingen av näthinnesjukdomar10,11. Dessutom tillåter framväxten och tillämpningen av CRISPR cas9-tekniken nu genomiska introduktioner (knock-in) eller strykningar (knock-out) i en enkel enstegsprocess som överträffar begränsningarna av tidigare geninriktningsteknik12. Bommen i tillgången på nya musmodeller13 nödvändiggör ett effektivare inspelningsprotokoll för att icke-invasivt utvärdera RPE-funktionen.
Mätning av de ljusuppmanade elektriska svaren från RPE kan uppnås med hjälp av en direktkoppling elektroretinogram (DC-ERG) teknik. När de används i kombination med konventionella ERG-inspelningar som mäter fotoreceptorn (a-wave) och bipolär (b-wave) cellsvar14, kan DC-ERG definiera hur RPE-nas responsegenskaper förändras med retinal degeneration15,16,17 eller om RPE-dysfunktion föregår fotoreceptorförlust. Detta protokoll beskriver en metod som anpassas från arbetet av Marmorstein, Peachey, och kollegor som först framkallade DC-ERG-tekniken16,18,19,20 och förbättrar på reproducerbarheten och lindrar av bruk.
DC-ERG-inspelningen är svår att utföra på grund av den långa förvärvstiden (9 min) under vilken eventuella avbrott eller införande av buller kan försvåra tolkningen av uppgifterna. Fördelen med denna nya metod är att baslinjerna når steady state inom en kortare tid som minskar sannolikheten för att djuret kommer att vakna i förtid från anestesi och är mindre benägna att bubbla bildas i kapillärelektroderna.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ag/AgCl (mouth) Electrode</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>EP1</td>
			<td>Mouth reference electrode for mouse</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic Tile</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>CTS</td>
			<td>Used to cut the glass capillary tube to an appropriate size</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton Tipped Cleaning Stick</td>
			<td>Puritan Medical Products</td>
			<td>867-WC No Glue</td>
			<td>To be used as a spacer to improve the fit of the electrode holder assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electroretinogram (ERG) System</td>
			<td>Diagnosys LLC</td>
			<td>E3 System</td>
			<td>Visual electrophysiology system to diagnose ophthalmic conditions in vision research and drug trials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bunsen Burner</td>
			<td>Argos Technologies</td>
			<td>BW20002460</td>
			<td>Or equivlaent to shape glass under flame</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Capillary Tube (1.5 mm)</td>
			<td>Sutter Instruments</td>
			<td>BF150-75</td>
			<td>For filling with HBSS and making contact to the cornea</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Buffered Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc</td>
			<td>14175-095</td>
			<td>Commercially available. Maintain at RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In-Line Filter</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>6722-5001</td>
			<td>To protect vacuum pump from aerosols</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Noise Cable for Microelectrode Holders</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>5372</td>
			<td>Suggested for improving the length and placement of the cables and electrode holder assemblies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic Ball Joint</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>500871</td>
			<td>For magnetically positioning the electrode holder assembly on the stage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>MatLab: For editing the analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab Curvefit Toolbox</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Toolbox for MatLab (only required for editing the analysis software)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab Compiler</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td></td>
			<td>Toolbox for MatLab (only required for editing and re-releasing the analysis software)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MatLab Runtime version 9.5</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>R2018b (9.5)</td>
			<td>Required to run the analysis software: https://www.mathworks.com/products/compiler/matlab-runtime.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microelectrode Holders (45 degrees)</td>
			<td>WPI Inc</td>
			<td>MEH345-15</td>
			<td>For holding the capillaries</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needle (25 ga)</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>8881250313</td>
			<td>For filling the capillary tubes with HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>needle (ground) electrode</td>
			<td>Rhythmlink</td>
			<td>13mm - one elctrode</td>
			<td>Subdermal needle electrode (ground) for mouse (13mm long, 0.4mm diameter needle, 1.5m leadwire)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regulator/Power Conditioner</td>
			<td>Furman</td>
			<td>P-1800</td>
			<td>Or equivalent to remove DC-offset from noise introduced through power line</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe (12 mL)</td>
			<td>Monoject</td>
			<td>1181200777</td>
			<td>For filling the capillary tubes with HBSS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-clip</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06852-20</td>
			<td>For electrode holder assembly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum Desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>420120000</td>
			<td>Clear polycarbonate bottom &#38; cover</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pharmacological treatment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lubricant eye gel</td>
			<td>Alcon</td>
			<td>0078-0429-47</td>
			<td>Helps lubricates corneal surface and maintain electrical contact with capillary electrodes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylephrine Hydrochloride 2.5%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>17478-201-15</td>
			<td>Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proparacaine Hydrochloride 0.5%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>17478-263-12</td>
			<td>Local anesthetic for ophthalmic instillation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tropicamide 0.5%</td>
			<td>Akorn</td>
			<td>17478-101-12</td>
			<td>Short acting mydriatic eye drops (for pupil dilation)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylazine</td>
			<td>AnaSed</td>
			<td>sc-362949Rx</td>
			<td>Analgesic and muscle relaxant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zetamine (Ketamine HCl)</td>
			<td>VetOne</td>
			<td>501072</td>
			<td>Anesthetic for intramuscular injections</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct-coupled electroretinogram (dc-erg) for recording the light-evoked electrical responses of the mouse retinal pigment epithelium

Näthinnans pigmentepitelet (RPE) är en specialiserad monolayer av celler som är strategiskt placerade mellan näthinnan och choriocapillaris som upprätthåller fotoreceptorernas allmänna hälsa och strukturella integritet. Den RPE är polariserad, uppvisar apiskt och basalt belägna receptorer eller kanaler, och utför vektorala transporter av vatten, joner, metaboliter, och utsöndrar flera cytokiner.
In vivo noninvasive mätningar av RPE-funktionen kan göras med hjälp av direkt-kopplade ERGs (DC-ERGs). Metoden bakom DC-ERG var pionjärer marmorstein, Peachey, och kollegor med hjälp av en specialbyggd stimulering inspelningssystem och senare visat med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt system. DC-ERG-tekniken använder glaskapillärer fyllda med Hanks buffrade saltlösning (HBSS) för att mäta de långsammare elektriska svaren från RPE som framkallas från ljusuppmanade koncentrationsförändringar i det subretinala utrymmet på grund av fotoreceptoraktivitet. Den långvariga ljusstimulansen och längden på DC-ERG-inspelningen gör den sårbar för drift och buller vilket resulterar i en låg avkastning på användbara inspelningar. Här presenterar vi en snabb, tillförlitlig metod för att förbättra stabiliteten i inspelningarna samtidigt som du minskar bullret genom att använda vakuumtryck för att minska/eliminera bubblor som resulterar från utgasning av HBSS och elektrodhållaren. Dessutom är kraftledningsartefakter försvagade med hjälp av en spänningsregulator / power-balsam. Vi inkluderar nödvändiga protokoll för ljusstimulering för ett kommersiellt tillgängligt ERG-system samt skript för analys av DC-ERG-komponenterna: c-wave, snabb svängning, ljustopp och off-respons. På grund av den förbättrade lätt för inspelningar och snabb analys arbetsflöde, detta förenklade protokollet är särskilt användbart för att mäta åldersrelaterade förändringar i RPE funktion, sjukdomsprogression, och i bedömningen av farmakologiska intervention.

Figur 2 är en exempeldatauppsättning från möss med MIR-204 ko/ko cre/+ (villkorlig KO) och vildtyp (WT). MiR-204 ko/ko cre/+ är möss med villkorlig knockout av mikroRNA 204 i näthinnepigmentepitel. Dessa möss genereras genom att korsa floxed miR-204 möss (producerad av NEIGEF)22 med VMD2-CRE möss23. MiR-204 uttrycks högt i RPE där den reglerar uttrycket av proteiner som är kritiska för epitelfunktion som upprätthåller stram junc...

Watch this Scientific Journal Video about Direct-Coupled Electroretinogram DC-ERG for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium at JoVE.com

Direct-Coupled Electroretinogram DC-ERG for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium

Här presenterar vi en metod för att registrera ljus-evoked elektriska svar av retinal pigment epitel (RPE) i möss med hjälp av en teknik som kallas DC-ERGs först beskrivs av Marmorstein, Peachey, och kollegor i början av 2000-talet.

Direkt-kopplade elektroretinogram (DC-ERG) för inspelning av ljus-evoked elektriska svar av musen Retinal Pigment Epitel

The retinal pigment epithelium (RPE) is a specialized monolayer of cells strategically located between the retina and the choriocapillaris that maintain ...

DC-ERG-tekniken kan användas för icke-undvikande utvärdering av näthinnans pigmentepitetelfunktion för att övervaka åldersrelaterade förändringar eller sjukdomsprogression och för att bedöma farmakologiska interventionseffekter. Denna teknik förbättrar på DC-ERG reproducera förmåga och den lättanvända genom att förenkla kapillärelektrod preparatet. Det kan också kompletteras med en standard ohm mjukvaruapplikation för att underlätta analys.Börja med att försiktigt skjuta en 25-gauge spruta nål genom silikongummi packning till den bakre väggen av elektrodhållare. Fyll elektrodhållarens bas med avgasad HBSS medan du långsamt drar tillbaka nålen, var noga med att inte införa bubblor och sätt tillbaka det gängade locket utan att dra åt. Sätt in sprutnålen igen för att fylla det tomma utrymmet i gapet med HBSS och håll kapillären horisontellt medan du fyller för att förhindra att lösning strömmar ut från den andra änden.Greppa den fyllda kapillären i den böjda änden, för långsamt in den andra änden genom det lossade locket och dra åt skruvlocket på plats. Luta elektrodhållarna med kapillärelektroderna uppåt för att låta eventuella bubblor flöda ut och avgasa kapillärerna i en vakuumkammare i fem till tio minuter. Sedan, långsamt släppa vakuum och fylla på elektrodhållarna och glas kapillärer, som visats.För att göra en anpassad stå för mikroelektrod hållaren, ta bort den svarta polyacetal klipp från ena sidan av en siffra åtta T-klipp och använda en cylinder bas med magnetiska kulleder bearbetas på mitten för att justera höjden. Säkra de modifierade T-clipsen på de magnetiska kulmonteringsskruvarna med muttrar av M3-storlek och en glidning i ungefär en tum avsmalnande trähandtag, modifierat från en rengöringspinne av bomullsspets, i stativet i vinkel för att säkra mikroelektrodhållaren i det specialtillverkade magnetkulsstaketet med T-clip. Använd sedan den sällsynta jordartsmetaller magneter cylinderbas för att säkert placera den anpassade elektrodhållaren står på metallplattan på scenen, vilket möjliggör en 360-graders rotation på en 180-graders axel.För att utföra ett elektrodtest, sänk först försiktigt de helmonterade HBSS-fyllda kapillärmikrobelektroderna i en liten behållare av HBSS. Placera nålen marken elektrod och silver, silverklorid centrerad pellet referenselektrod i samma HBSS att slutföra kretsen och välja eller skapa en lämplig identifierare för att beskriva musen som skall testas. Om du vill välja det direkt kopplade elektroretinogramprotokollet som ska utföras klickar du på protokoll och väljer DC-ERG.Klicka på kör. En dialogruta kommer att dyka upp med patientinformationen. Om informationen är korrekt klickar du på ja och fortsätter till steg ett av sex.Stäng dörrarna till Faraday-buren och klicka på impedans för att visa impedansläget. Verifiera att värdena för munnens referens, svans marken och inspelning elektroder är godtagbara och klicka steg för att gå vidare till steg fyra av sex för att testa baslinjen stabilitet. Om du vill börja visa spårningarna klickar du på förhandsgranskning.Spåren bör vara låg ljudnivå med en topp-till-topp-amplitud på mindre än 200 mikrovolt. För att placera musen och elektroder för ett experiment, bedöva hornhinnan av en sövd mus med en droppe 5%proparakain saltsyra innan dilating hornhinnan med en droppe 2,5%fenylefrin HCL och 5%tropicamide. I erg-systemets programvara, verifiera att rätt patient är vald.Klicka på protokoll. Välj DC-ERG under protokollbeskrivning och klicka på kör. Klicka på ja för att kontrollera att rätt test utförs.Använd steg ett av sex för att slå på ett svagt rött ljus inuti kupolen och placera musen på ett uppvärmt inspelningsbord. Använd forceps för att noggrant tälta huden på det bakre benet. Och med hjälp av ena handen för att stadigt hålla nålelektroden, använd den andra handen för att föra in elektroden subkutant i det bakre benet för att säkra elektroden på plats.Placera referenssilver, silverkloridelektrod i djurets mun så att den centrerade pelleten vilar längs bakkinden och hålls på plats bakom tänderna. Innan kapillärelektroderna placeras på ögat, placera elektrodhållaren med glaskusillärerna orienterade vertikalt och snärta elektrodhållaren med ett pekfinger för att avlägsna eventuella bubblor som kan ha införts. Använd en nål med 25 gauge för att fylla kapillärspetsarna med HBSS och inspektera kapillärerna för att säkerställa att det inte finns några luftbubblor fångade i spetsarna.Placera elektrodhållarstativ så att de öppna spetsarna på de HBSS-fyllda kapillärerna är i skonsam kontakt med hornhinnan. Och var noga med att undvika att införa bubblor, invertera smörjmedel ögat gel dispenser att kasta de första dropparna. Placera sedan en droppe smörjmedelsögongel på varje öga för att upprätthålla ledningsförmåga och för att förhindra uttorkning under inspelningen.Om du vill spela in DC-ERGs klickar du på steg för att välja steg fem av sex och klickar på impedans för att använda impedanskontrollskärmen för att undersöka motståndet från vänster och höger ögon. Impedansvärdena för de registrerande elektroderna vid varje öga bör vara likartade. Och impedansvärdena för både marken och referenselektroder bör vara mindre än 10 kilohms.Klicka på förhandsgranskning om du vill visa spåren för vänster och höger ögon och vänta upp till 10 minuter för att en stabil baslinje ska uppnås. Klicka sedan på stopp för att avsluta spårningsförhandsgranskningen och klicka på kör för att starta inspelningen. Här visas en exempeldatauppsättning från villkorlig knockout och möss av vildtyp.I denna analys led spåren av småbubblor i elektroden. Det ökade topp-till-topp buller i spårningen. I en separat analys eliminerades bubblorna med hjälp av vakuumkammaren innan mikroelektroderna monterades inom elektrodhållarstativen.De bästa passningslinjerna till de första 25 sekunderna kan beräknas, vilket gör att de drift-korrigerade svaren kan omlottas och amplituderna på DC-ERG-komponenterna identifieras. Som väntat, minskat uttryck för bota 7.1 kalium kanaler i RPE dämpar kraftigt c-våg och snabb svängning, vilket tyder på en betydande försämring av retinal pigment epitel elektriska egenskaper. Här visas de relativa amplituderna för DC-ERG-komponenterna, normaliserade till vildtyp och plottade mot de relativt två största ljusormantlade avågsamplituderna.Denna analysform kan avgöra om de minskade elektriska svaren från RPE kan redovisas genom en minskning av fotoreceptoraktiviteten ensam. Eller om det finns en underliggande defekt som har sitt ursprung i RPE. Kom ihåg att uppnå en stabil baslinje innan du går vidare till musinspelningen och att återspesta elektroderna periodiskt för bubblor som kan ha införts.Mörkanpassade ERGs kan registreras före DC-ERG för att mäta den kondrivna näthinnans funktion. Ljusanpassade ERGs kan också utföras efter DC-ERG för att utvärdera de kondrivna retinala svaren.

Research

JoVE Journal

Chemistry

Direct-Coupled Electroretinogram (DC-ERG) for Recording the Light-Evoked Electrical Responses of the Mouse Retinal Pigment Epithelium

LabVIEW-operated Novel Nanoliter Osmometer for Ice Binding Protein Investigations

LabVIEW som drivs Novel nanoliter Osmometer för Ice protein Undersökningar

Ice-binding proteins (IBPs), including antifreeze proteins, ice structuring proteins, thermal hysteresis proteins, and ice recrystallization inhibition ...

Production of Disulfide-stabilized Transmembrane Peptide Complexes for Structural Studies

Produktion av disulfid-stabiliserade transmembran peptidkomplex för strukturstudier

Physical  interactions among the lipid-embedded alpha-helical domains of membrane  proteins play a crucial role in folding and assembly of membrane ...

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Struktur och samordning Fastställande av peptid-metallkomplex Använda 1D och 2D<sup&gt; 1</sup&gt; H-NMR

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

A High-throughput-compatible FRET-based Platform for Identification and Characterization of Botulinum Neurotoxin Light Chain Modulators

Botulinum neurotoxin (BoNT) is a potent and potentially lethal bacterial toxin that binds to host motor neurons, is internalized into the cell, and ...

Formation of Ordered Biomolecular Structures by the Self-assembly of Short Peptides

Bildning av Beställda Biomolecular Structures av självorganisering av korta peptider

In nature, complex functional structures are formed by the self-assembly of biomolecules under mild conditions. Understanding the forces that control ...

Optimization of Synthetic Proteins: Identification of Interpositional Dependencies Indicating Structurally and/or Functionally Linked Residues

Optimering av syntetiska proteiner: Namnet på Interpositional beroenden Indikerings strukturellt och / eller funktionellt knutna Stoder

Protein alignments are commonly used to evaluate the similarity of protein residues, and the derived consensus sequence used for identifying functional ...

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

Syntesen av protein biokonjugat<em&gt; via</em&gt; Cystein-maleimid Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Facile Synthesis of Worm-like Micelles by Visible Light Mediated Dispersion Polymerization Using Photoredox Catalyst

Facile Syntes av maskliknande Miceller med synligt ljus medierad dispersionspolymerisation Använda Photoredox Catalyst

Presented herein is a protocol for the facile synthesis of worm-like micelles by visible light mediated dispersion polymerization. This approach begins ...

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

Använda kapillärelektrofores att kvantifiera organiska syror från växtvävnad: ett pilotfall Undersöka<em&gt; Coffea arabica</em&gt; Frön

Carboxylic acids are organic acids containing one or more terminal carboxyl (COOH) functional groups. Short chain carboxylic acids (SCCAs; carboxylic ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

Insikter Interaktioner av aminosyror och peptider med oorganiska material med hjälp av enda molekyl Force spektroskopi

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...