Name: extraction and quantification of soluble, radiolabeled inositol polyphosphates from different plant species using sax-hplc
Uploaded: 2020-06-26T15:00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC at JoVE.com

تم تمويل هذا العمل من قبل دويتشه فورشونججسماينشافت (DFG، مؤسسة البحوث الألمانية) في إطار استراتيجية التميز في ألمانيا - EXC-2070 - 390732324 (PhenoRob)، ومجموعة التدريب البحثية GRK2064 ومنح البحوث الفردية SCHA1274/4-1 و SCHA1274/5-1 إلى G.S.. كما نشكر لي شلوتر وبريجيت أويبرباخ على المساعدة التقنية.

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

هنا نقدم طريقة متعددة وحساسية لقياس Insps بما في ذلك PP-InsPs في المستخلصات النباتية وتقديم نصائح عملية حول كيفية الحصول على هذه الطريقة المنشأة. على الرغم من أن البروتوكول هو قوي عموما، يمكن أن يحدث تشغيل دون المستوى الأمثل والتحليلات. في معظم الحالات، يمكن تحديد تلك أشواط من قبل تخفيض قوي أو حتى خسارة كاملة من InsPs الفوسفورية للغاية، وخاصة الأنواع PP-InsPInsP 7 و INSP8. ويمكن أن تكون الأسباب المحتملة هي التلوث الميكروبي للمواد النباتية وعدم كفاية تعطيل المياه النباتية المنشأة من نوع PP-InsP أثناء الاستخراج بسبب عدم كفاية طحن وذوبان المواد النباتية التي لن تكون على اتصال فوري مع حاجز الاستخراج. وتشمل الأسباب الأخرى عدم دقة ضبط الـ PH بإضافة غير كافية أو زائدة من عازلة التحييد، أو ببساطة عدم كفاية مواد العينة. ويمكن أن تجعل هذه الأخيرة من الصعب الكشف عن PP-InsPs، لأن تلك غالبا ما تكون موجودة بكميات منخفضة جدا في الخلايا. قد يؤدي فائض مادة العينة أو التجفيف غير الفعال خلال الخطوة 3.5 إلى تخفيف حمض البيركلوريك، مما يؤدي أيضاً إلى عدم كفاية تعطيل الإنزيم وفقدان محدد لـ InsP6 و PP-InsPs. وقد تم تحسين كمية المواد النباتية، وكذلك الشعاعي المستخدمة في هذا البروتوكول على أساس التكاليف والأداء، وبالتالي فهي قريبة من أقل كمية لا تزال كافية لتوفير أفضل النتائج. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الراتنج العمود تدريجيا فضفاضة قدرتها على حل. أول علامة على هذه العملية (لأسباب ليست واضحة تماما للمؤلفين) خسارة محددة من أعلى الفوسفورية InsP الأنواع مثل PP-InsPs في الطيف HPLC. مع مزيد من الشيخوخة، وحتى InsP6 لن يتم حلها بشكل صحيح من قبل العمود (الشكل 1D). لذلك، فإن استخدام عمود مناسب، فضلا عن التعامل الدقيق مع العينة والصيانة السليمة لمكونات HPLC أمر بالغ الأهمية لضمان نتائج دقيقة.
عند مقارنة العينات وتشغيل، وخصوصا عندما ولدت مع معدات مختلفة (على سبيل المثال، أنظمة HPLC والأعمدة) أو في أيام مختلفة، فمن الأهمية بمكان تطبيع العينات لبعضها البعض (كما هو موضح في الخطوة 7.3) وتحليلها بنفس الطريقة. فقط من خلال التطبيع من الممكن ودقيقة لإظهار عينات متعددة في نفس الرسم البياني (الشكل 3). بالنسبة لتحديد كمية الـ InsPs الفردية بالنسبة إلى إجمالي InsPs أو أنواع معينة أخرى من InsP ، ليس من الضروري تطبيعها ، طالما يتم عرض القيم النسبية فقط وليس القيم المطلقة. من الناحية المثالية ، يتم عرض كل من ملفات InsP والكمية. ومع ذلك، في بعض الحالات لا يمكن إظهار تشغيلين أو أكثر بشكل مناسب في نفس الرسم البياني. يمكن أن تجعل أوقات الاحتفاظ المختلفة أو مستويات مختلفة من نشاط الخلفية من الصعب مقارنة ملفات تعريف SAX-HPLC غير المُحصَّنة وحدها. نفس الشيء هو الصحيح عندما العديد من العينات تحتاج إلى مقارنة. وفي مثل هذه الحالات، يلزم إجراء تقييم آخر باستخدام برنامج حاسوبي إضافي (مثل الأصل) من أجل تحديد مقدار الذروة الفردية.
يدرك المؤلفون أن البروتوكول الموصوف هنا يمكن أن يكون الأمثل ويحتاج إلى تكييفه مع كل سؤال بحثي فردي. على الرغم من أن يجري الأمثل لعربيدوبسيس مقتطفات7،17 في هذا البروتوكول ، وهذا الأسلوب هو تنوعا ويمكن أن تساعد في تحديد ملامح InsP من الأنواع النباتية الأخرى أيضا. هنا نحن مثال على هذا الاحتمال من خلال تقديم لأول مرة ملف InsP لL. japonicus، والتي تتطلب أي تعديلات على شروط وضع العلامات ، استخراج InsP أو تشغيل SAX -HPLC (الشكل 2). وتجدر الإشارة إلى أنه في حين أن التشابه العام، لوحظ وجود اختلافات بين ملفات تعريف L. japonicus و Arabidopsis InsP. على سبيل المثال، في L. japonicus InsP5 [4-OH] أو شكله enantiomericInsP 5 [6-OH] أكثر وفرة من InsP5 [1-OH] أو شكله enantiomeric InsP5 [3-OH] بالمقارنة مع Arabidopsis، حيث InsP5 [1-OH] أو شكله enantiomeric InsP5 [3-OH] هي الأنواع المهيمنة InsP5. وبالمثل، فإننا نتوقع أن التغييرات في تكوين وسائل الإعلام،[3H]- ميو-الإينوزيتول التركيز، عمر النبات، الظروف البيئية (على سبيل المثال، الضوء ودرجة الحرارة)، إضافة المركبات الكيميائية أو تحليلات التفاعلات النباتية الميكروبية من بين عوامل أخرى، قد تحتاج إلى اختبار وتكييفها.myo
أحد العيوب الهامة لهذه الطريقة التي يجب النظر فيها هو أن يتم وضع العلامات في ثقافة سائلة (عقيمة) ، والتي لا تمثل بيئة فسيولوجية لمعظم النباتات الأرضية. بالإضافة إلى ذلك ، نظرًا لارتفاع تكاليف [ΟH] -ميو- إينوزيتول ، فإن حجم محلول وضع العلامات وحجم الوعاء الثقافي محدود بشكل عام ، مما يحد أيضًا من حجم النباتات التي يمكن استخدامها. ويمكن تجنب زراعة في الثقافة السائلة عن طريق التسلل مباشرة على سبيل المثال أوراق النباتات التي تزرع التربة مع [³H]-ميو-إينوزيتول وبعد ذلك بعد البروتوكول الموصوف هنا، كما ذكرت سابقا10.
هناك عدة عيوب لهذا البروتوكول بالمقارنة مع الطرق البديلة، مثل تيو2 سحب لأسفل متبوعة بالتقنيات المستندة إلى PAGE أو قياس الطيف الكتلي. نظرا ل [3H]-ميو-اينوزيتول وضع العلامات, فقط الأنواع InsP التي تنشأ مباشرة من ميو-الإينوزيتول سيتم الكشف عنها في نهاية المطاف. myo الطريقة الموصوفة هنا هي عمياء عن ايزومرات Ins الأخرى مثل scyllo-إينوزيتول وغيرها من الايزومرات التي تم تحديد بعض منها في بعض النباتات44. وعلاوة على ذلك، سيتم استبعاد ميو-InsPsالمستمدة من مسارات أخرى، بما في ذلك تلك التي تم تصنيعها من قبل دي نوفو توليف ميو-إينوزيتول وميو-إينوزيتول-3-الفوسفات عن طريق الأيزوميري من الجلوكوز-6-الفوسفات، حفزت من قبل ميو-إينوزيتول-3-فوسفات سينثاز (MIPS) البروتينات45. myo على الرغم من أن [32P] أو [33P] -ortho-phosphateيمكن استخدامها كتسميات بديلة ، فإن استخدامها يشكل عيبًا كبيرًا ، حيث سيتم تسمية كل جزيء يحتوي على الفوسفات ، بما في ذلك النيوكليوتيدات الوفيرة ومشتقاته. ويمكن أيضا استخراج تلك الجزيئات مع هذا البروتوكول وربط عمود SAX، والتي سوف تؤدي إلى مستوى عال من النشاط الخلفية التي سوف تتداخل مع تحديد الفردية InsP قمم5. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تتأثر بشدة القياس الكمي ل [32ف] - أو [33P] - المسمى Insps وPP-InsPs من قبل الفوسفات و pyrophosphate مويتي دوران وقد لا الإبلاغ عن قراءات الشامل لأنواع إينوزيتول.
من ناحية أخرى, [3H]-ميو-إينوزيتول تسميات ميوعلى وجه التحديد -الجزيئات المحتوية على إينوزيتول. InsPs, الدهنيات المحتوية على الإينوزيتول, مثل فوسفينوسيتيديس, وغالاكتينول هي في هذه الحالة وصفت. ومع ذلك، سيتم تحليل InsPs فقط مع هذا البروتوكول، منذ الدهون غير قابلة للذوبان في العازلة استخراج وgalctinol لا يرتبط عمود SAX.
حتى الآن، فإن الاختلافات من مصنع InsP التشكيل الجانبي التي تم إنشاؤها بواسطة [3H]-ميو -إينوزيتول وضع العلامات مقارنة مع واحد يحددها تيو2 الإنزال / PAGE لا تزال غير معروفة، لأن هذه المقارنات لم يتم تنفيذها في النباتات.myo تناولت دراسة حديثة في الخلايا الحيوانية هذا السؤال46. في هذا العمل، تم تحديد مجموعة من InsP6 غير مرئية من قبل [3H]-ميو-وضع العلامات الإينوزيتول، والتي ينبغي بالتالي أن تكون مشتقة مباشرة من الجلوكوز-6-الفوسفات، من خلال مقارنة SAX-HPLC ملامح مع جلية الصفحة من خطوط خلايا الثدييات. 24 ساعة من الفوسفات المجاعة أدى إلى زيادة 150٪ من InsP6 عند تحديد كمي جلي الصفحة من InsPs تنقيتها باستخدام تيو2 الانسحاب. SAX-HPLC تحليلات [3H]-ميو-إينوزيتول- تسمية الخلايا التي تم التعامل معها بشكل متطابق فقط أظهرت زيادة بنسبة 15٪ من [3H]-InsP6. كما ذكر سابقاً، InsPs أقل منInsP 5 غير قابل للكشف مع تحليل PAGE في معظم الحالات. يبدو أن التسمية الراديوية تليها SAX-HPLC هي الطريقة المفضلة، طالما لم يتم تحسين بروتوكولات الطيف الشامل للكشف عن هذه المجموعة من الجزيئات المشحونة بشكل سلبي للغاية.
وثمة تحد آخر المتبقي هو التمييز بين enantiomers في تحليلات SAX -HPLC (أو في أي طريقة أخرى لتحليل InsP)10،17. ويمكن معالجة هذا التحدي من خلال إضافة محددات chiral، أي، مركبات enantiopure مثل L-أرجينين أميد التي تتفاعل مع الجزيئات enantiomeric على حده لتشكيل مجمعات diastereomeric التي يمكنفصلها 10. على حد علمنا ، تم تنفيذ هذا النهج فقط للتمييز بين enantiomeric InsP5 ايزومر InsP5 [1-OH] و INSP5 [3-OH] من قبل NMR تحليلات10. ولم يتم الإبلاغ بعد عن التمييز في أزواج أخرى من أشكال الجنسين أو التمييز الناجح ضد الأناتيومرات بواسطة تحليل الـ chiral SAX-HPLC أو الأساليب القائمة على شبكة "تشيرال" PAGE، وينبغي مواصلة تطويرها. وبالنظر إلى التوليف المحفوظة والقواعد المحفوظة PP-InsPs من قبل توافر الفوسفور، ونحن نتصور أن أساليب غير مشعة خاصة مثل PAGE أو الأساليب القائمة على MS، جنبا إلى جنب مع تحليلات المغذيات، وسوف تساعد على الأرض الحقيقة الجهود لمعايرة بيانات الاستشعار عن بعد المصممة لتشخيص أوجه القصور في المواد الغذائية في المحاصيل17،18،24،25. ومع ذلك، الطريقة المعروضة هنا لا يزال يمكن اعتبارها في الوقت الراهن المعيار الذهبي لتحليلات InsP وسوف تكون مفيدة لاكتشاف وظائف جديدة لهذه الرسل مثيرة للاهتمام في النباتات.

منذ أربعة عقود تقريباً، ظهر الفوسفات الإينوزيتول (InsPs) كجزيئات إشارة، بعد أن تم تحديد Ins(1,4,5) P3 (InsP3)كرسول ثان ينشط إطلاق سراح Ca2+ بوساطة المستقبلات في الخلايا الحيوانية1،2. حتى الآن، لم يتم تحديد مستقبلات InsP3 (IP3-R) في النباتات، والتي الأسئلة دور إشارة مباشرة ل InsP3 في الخلايا النباتية3. بغض النظر عن ذلك ، InsP3 بمثابة مقدمة ل InsPs الأخرى المشاركة في العديد من العمليات التنموية النباتية ، بما في ذلك تنظيم مسارات إشارة محددة3،4،5،6،7،8. على سبيل المثال، InsP3 يمكن أن يكون مزيد من الفوسفور إلى InsP6، المعروف أيضا باسم "حمض فيتيك"، الذي يمثل مصدرا رئيسيا للفوسفات، ميو-إينوزيتولوالاتيات، وكان أظهرت للعب أدوار رئيسية في الدفاع النباتي ضد مسببات الأمراض، تصدير مرنا والفوسفات5،9,10،11،12.
Inositol pyrophosphates (PP-InsPs) هي فئة من InsPs التي تحتوي على واحد على الأقل من السندات دي فوسفو عالية الطاقة، التي تم تحديدها في البداية في الخلايا الحيوانية، الأميبا والخميرة، حيث أنها تلعب أدوارا حاسمة في مختلف العمليات الخلوية13،14،15. على الرغم من العمل المنوي على PP-InsPs في النباتات16,17,18,19,21,,22,23,24,25,26, الوظائف البيولوجية والهوية الايزومر من هذه الجزيئات لا تزال غامضة إلى حد كبير.21 في مصنع نموذج Arabidopsis thaliana، تم اقتراح InsPالخلوية 8 لتنظيم الدفاعات ضد الحيوانات العاشبة الحشرات والفطريات necrotrophic عن طريق الكشف عن صدفة من InsP8 و jasmonate النشطة من قبل مجمع مستقبلات ASK1-COI1-JAZ17. وعلاوة على ذلك، وقد اقترحت أدوار InsP8 وغيرها PP-InsPs في التوازن الطاقة واستشعار المغذيات، وكذلك هووستاسيس الفوسفات17،23،24،25،26.
وبغض النظر عن النظام البيولوجي المستخدم، فإن أحد التحديات المنهجية الرئيسية عند دراسة الـ InsPs هو الكشف الموثوق والدقيق لهذه الجزيئات. وقد استخدمت الأساليب المستندة إلى قياس الطيف الكتلي للكشف عن InsPs، بما في ذلك PP-InsPs، من مستخلصات الخلايا. ومع ذلك، فشلت تلك الدراسات في التفريق بين ايزومرات متميزة26،27. نهج آخر لتحليل InsPs توظف سحب لأسفل من InsPs من lysates الخلية باستخدام حبات TiO2 ، تليها polyacrylamide هلام الكهرباء (PAGE) من InsPs مائل. ويمكن أن تكون الملطخة InsPs من قبل إما الأزرق toluidine أو DAPI24،28،29. ومع ذلك، فإنه حتى الآن من غير الممكن للكشف بشكل موثوق InsPs أقل من InsP5 من مستخلصات النباتات باستخدام هذا الأسلوب. في الآونة الأخيرة، تم نشر طريقة باستخدام [13C]-ميو-إينوزيتول للرنين المغناطيسي النووي (NMR) تحليل InsPs كبديل لتبادل قوي anion عالية الأداء الكروماتوغرافيا السائلة (SAX-HPLC)30. وقد أبلغ عن هذه التقنية لتحقيق حساسية مماثلة بالمقارنة مع SAX -HPLC والسماح للكشف عن 5-InsP7، فضلا عن التمييز بين مختلف غير enantiomeric InsP5 ايزومرات من مقتطفات الخلية. ومع ذلك، يتطلب تنفيذ طريقة NMR القائم على كيميائيا توليفها وتجاريا لا تتوفر [13C] -ميو-إينوزيتول. ولذلك، فإن الطريقة المستخدمة في معظم الحالات هي عينات radiolabeling مع [3H]-ميو-إينوزيتول، تليها SAX-HPLC31،32،33. ويستند هذا الأسلوب على امتصاص ميوالمشع -إينوزيتول في المصنع وتحويلها إلى InsPs مختلفة من خلال النشاط المشترك من كينازات الخلوية المكرسة والفوسفاتات.
ثم يتم استخراج الـ [3H] المسمى InsPs وتجزئة الحمض باستخدام SAX-HPLC. وبسبب الشحنة السلبية الخاصة بهم، يتفاعل InsPs بقوة مع المرحلة الثابتة المشحونة بشكل إيجابي من عمود SAX-HPLC ويمكن أن يتم االلتقم بتدرج عازل يحتوي على زيادة تركيزات الفوسفات لاتوام InsPs من العمود. يعتمد أزهون أوقات لذلك على شحن وهندسة من ال إنسب أنواع أن يكون فصلت. في حالة عدم وجود أعمدة الشيرال، يمكن فقط الايزومرات غير المضادة للانتينية بواسطة فصل بواسطة هذا البروتوكول. ومع ذلك، يمكن استخدام المعايير ذات علامة إشعاعية لتعيين الطبيعة الأيزوميرتية لذروة InsP محددة. وقد ساعدت الجهود المتعددة في الماضي من قبل مختبرات مختلفة لتوليد معايير وصفت وغير المسمى مع (البيولوجية) الأساليب الكيميائية أو لتنقيتها من مختلف الخلايا والكائنات الحية تعيين قمم لبعض أنواع InsP، وأيضا لتضييق الهوية الأيزوميرية الفردية InsP الأنواع5،7،21،34،35،36،37،38،39،40،4141،42،43. أيضا ، فإن توضيح مؤخرا من مسارات انزيمية مما يؤدي إلى تشكيل PP - InsPs في النباتات ، فضلا عن اكتشاف البكتيريا من النوع الثالث effector مع نشاط محدد 1 -phytase ، وتوفير معلومات عن كيفية توليد معايير مفيدة لهذه التحليلات10،17،18،22،23.
ويمكن قياس الكسور الناتجة في عداد التلألؤ السائل بسبب β اضمحلال التريتيوم(3H). مع زيادة الوقت وضع العلامات، يتم التوصل إلى توازن النظائر ثابت الحالة، وبعد ذلك ينبغي أن تمثل التشكيلات InsP التي تم الحصول عليها حالة InsP من المصنع31. وتتمثل الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول بالمقارنة مع التقنيات الأخرى المتاحة في الحساسية العالية التي يحققها استخدام السلائف المباشرة للانبس وقياس الإشارة المشعة.
SAX-HPLC من العينات المستخرجة من [3H]-ميو-النباتات المسماة الإينوزيتول أو الكائنات الحية الأخرى يستخدم عادة للكشف عن وتكميم InsPs تتراوح بين أقل الأنواع InsP PP-InsPs, تمثل أداة قيمة لفهم أفضل لعملية التمثيل الغذائي, وظيفة وأساليب عمل InsPs. حتى الآن، هذه الطريقة هي أيضا الخيار الأنسب للباحثين ذوي الاهتمام الخاص في أقل الأنواع InsP. في حين أن أساسيات هذا الإجراء ، الذي يستند إليه البروتوكول الموصوف هنا ، تم وصفه سابقًا7،21،31،34، لا يزال هناك بروتوكول مفصل مصمم خصيصًا لتحليل InsPs المشتقة من النباتات وخاصة PP-InsPs مفقود. المنشورات السابقة ذكرت صعوبات في الكشف عن موثوق بها في وفرة PP -InsPs ، وخاصة InsP8، بسبب واحد أو أكثر من العوامل التالية : كميات منخفضة نسبيا من المواد النباتية ، [3H]-ميو-إينوزيتول مع نشاط محدد منخفض (> 20 Ci/mmol)، واستخدام مخازن الاستخراج التي إما لا تستند إلى حمض البيركلوريك أو أقل تركيزا من 1 M، ومخازن مختلفة تحييد، فضلا عن التدرجات دون الأمثل أو الكشف عن [3H] مع كاشف على الخط. بالمقارنة مع تلك الدراسات ، تم تصميم البروتوكول المقدم هنا للكشف الموثوق بها من PP - InsPs7،21،34.
هنا نقدم سير عمل مفصل، بدءا من إعداد المعدات لزراعة النباتات ووضع العلامات، استخراج InsP وتشغيل SAX-HPLC نفسها. على الرغم من أن الطريقة كانت الأمثل لنموذج النبات A. thaliana، فإنه يمكن تعديلها بسهولة لدراسة الأنواع النباتية الأخرى ، كما هو مبين هنا مع أول تقرير InsP لمحة عن نموذج البقولية لوتس japonicus. على الرغم من أن استخدام أنواع نباتية مختلفة قد يتطلب بعض التحسين ، فإننا نتصور أن تكون هذه الأنواع طفيفة ، مما يجعل هذا البروتوكول نقطة انطلاق جيدة لمزيد من الأبحاث في InsPs النباتية. من أجل تسهيل التحسينات الممكنة، فإننا نشير إلى كل خطوة في البروتوكول الذي يمكن إجراء تعديلات فيه، وكذلك جميع الخطوات الهامة التي قد تكون صعبة عند إنشاء الأسلوب للمرة الأولى. بالإضافة إلى ذلك، فإننا نبلغ عن كيفية استخدام البيانات التي تم الحصول عليها بواسطة هذه الطريقة في تحديد كمية InsPs معينة وكيفية تحليل عينات مختلفة ومقارنتها.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>model: 5430 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diammonium hydrogen phosphate, &#8805;97 %</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0268.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate, &#8805;99 %, p.a., ACS</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>8043.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 12-well clear flat bottom TC-treated multiwell cell culture plate, with lid, individually wrapped, sterile</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>LAMBDA Instruments GmbH</td>
			<td>model: OMNICOLL single channel collector</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth incubator</td>
			<td>poly klima GmbH</td>
			<td>model: PK 520-LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC pumps</td>
			<td>Kontron Instruments</td>
			<td>model: 420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC syringe for Rheodyne valves, 1 mL</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injector for HPLC</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>model: Rheodyne 9725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inositol, myo-[1,2-3H(N)]</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals Inc.</td>
			<td>ART 0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>University, Chemistry Department</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation counter</td>
			<td>PerkinElmer Inc</td>
			<td>model: TRI-CARB 2900TR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pestle</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>CXH7.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixed cellulose Eester filter, ME range (ME 24), plain, 0.2 &#181;m pore size, 47 mm circle</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>10401770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer for HPLC</td>
			<td>Kontron Instruments</td>
			<td>model: M 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog medium, salt mixture</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro software</td>
			<td>OriginLab Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orthophosphoric acid, &#8805;85 %, p.a., ISO</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>6366.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Partisphere 5 &#181;m SAX cartridge column, 125 x 4.6 mm</td>
			<td>Hichrom Limited</td>
			<td>4621-0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perchloric acid, 70 %, 99.999 % trace metals basis</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>311421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile</td>
			<td>Greiner Bio One International GmbH</td>
			<td>688161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-indicator paper pH 5.5 - 9.0, Neutralit</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>109564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium carbonate</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>P743.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample loop for 9725 injectors, volume 2 mL, PEEK</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>57648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNAPTWIST scintillation vial, 6.5 mL</td>
			<td>Simport Scientific Inc.</td>
			<td>S207-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile bench</td>
			<td>LaboGene</td>
			<td>model: ScanLaf MARS 900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, &#8805;99,5 %, p.a.</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultima-Flo AP liquid scintillation cocktail</td>
			<td>PerkinElmer Inc</td>
			<td>6013599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure deionized water</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wrenchless WVS End Fitting Kit</td>
			<td>Hichrom Limited</td>
			<td>4631-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and quantification of soluble, radiolabeled inositol polyphosphates from different plant species using sax-hplc

استرات الفوسفات من ميو-إينوزيتول, كما يطلق عليه الفوسفات إينوزيتول (InsPs), هي فئة من المنظمين الخلويين تلعب أدوارا هامة في فسيولوجيا النبات. بسبب الشحنة السلبية، وانخفاض وفرة والتعرض للأنشطة المائية، والكشف عن وكمية هذه الجزيئات أمر صعب. وهذا هو الحال بشكل خاص بالنسبة للأشكال ذات الفوسفور الشديد التي تحتوي على سندات ثنائي فوسفو "عالية الطاقة" ، التي يطلق عليها أيضًا الإينوزيتول pyrophosphates (PP-InsPs). نظرا لحساسية عالية، قوية anion تبادل عالية الأداء الكروماتوغرافيا السائل (ساكس-HPLC) من النباتات المسمى مع [3H]-ميو-إينوزيتول حاليا هو الأسلوب المفضل لتحليل هذه الجزيئات.myo باستخدام [3H]-ميو-إينوزيتول إلى شتلات النباتات radiolabel, مختلف أنواع InsP بما في ذلك العديد من الأيزومرات غير المضادة للانانياتية يمكن الكشف عنها والتمييز مع حساسية عالية. هنا ، يتم وصف إعداد نظام SAX -HPLC مناسب ، بالإضافة إلى سير العمل الكامل من زراعة النباتات ، واستخراج الأشعة والـ InsP إلى SAX -HPLC وتحليل البيانات اللاحقة. البروتوكول المعروض هنا يسمح بالتمييز والكمية لمختلف أنواع InsP، بما في ذلك العديد من الايزومرات غير الأنانتية وPP-InsPs، InsP7 و InsP8،ويمكن تكييفها بسهولة مع أنواع نباتية أخرى. وكمثال على ذلك، يتم إجراء تحليلات SAX-HPLC لـ Arabidopsis thaliana و Lotus japonicus و يتم عرض ملفات تعريف InsP الكاملة ومناقشتها. وتمثل الطريقة الموصوفة هنا أداة واعدة لفهم أفضل للأدوار البيولوجية للـ InsPs في النباتات.

وتهدف النتائج المبينة هنا إلى توضيح النتائج المحتملة التي تم الحصول عليها وفقاً للتغيرات على المستويين التقني والبيولوجي. يتمثل الأول في التحليلات باستخدام أعمدة جديدة مقابل أعمدة مسنة(الشكل 1)وعينات جديدة مقابل عينات مخزنة (الشكل 3)، والثانية من خلال تقييم مقتطفات من نظامين نباتيين مختلفين هما A. thaliana (الشكل 1، الشكل 3) وL. japonicus (الشكل 2).
يتم تصوير تشغيل SAX-HPLC الأمثل على الشكل 1A\u2012C, الذي يظهر كامل الاينوزيتول متعدد الفوسفات الطيف التي تم الحصول عليها من مقتطفات A. ثاليانا بعد عد التلألؤ. لاحظ أن القمم يتم فصلها بشكل جيد ويمكن تعيينها إلى الأيزومرات المختلفة (أو أزواج اانتائي) على أساس التنقل الكروماتوغرافي الموصوفة في وقت سابق5،7.
ويبين الشكل 2 النتيجة التمثيلية لتحليل SAX-HPLC لشتلات L. japonicus التي نمت وتوصف في ظل نفس الظروف مثل شتلات Arabidopsis. في حين يفترض أن جميع الأنواع والذروات InsP التي تعرف من Arabidopsis يمكن أن ينظر إليها، هناك اختلافات كبيرة فيما يتعلق النسبية (على سبيل المثال، النسب بين ايزومر) كمية من ايزومرات InsP محددة، عند مقارنة ملامح كلا النوعين. على سبيل المثال، أظهرت مقتطفات لوتس زيادة InsP3c،InsP4b،InsP5b، وخفض InsP3a،InsP4a،InsP5a و InsP5c مقارنة Arabidopsis مما يترك مجالا لمزيد من التحقيقات. يوضح الشكل 2D النسب المختلفة بين ايزومرات InsP بين Arabidopsis و Lotus.
ويبين الشكل 3 اثنين من ملامح InsP من عينة التي تم تقسيمها بعد الاستخراج. تم تحليل النصف الأول على الفور والنصف الثاني بعد يوم واحد، بعد التخزين في -80 درجة مئوية. لاحظ أن الاختلافات الطفيفة فقط لوحظت بين العينات المختلفة (أي خطوط سوداء وحمراء على الشكل 3A\u2012C، والشكل 3D). وهذا يوضح أن دورة التجميد-ذوبان واحدة لا تضر العينة وأن الطريقة نفسها تولد نتائج قابلة للاستنساخ.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig01.jpg"> الشكل 1: التشكيل الجانبي InsP نموذجي من ناجحة وتحليل SAX HPLC غير ناجحة تنفيذها مع هذا البروتوكول. (A\u2012C) SAX-HPLC الشخصية من 17 يوما من نوع البرية (كول-0) شتلات Arabidopsis radiolabeled مع [3H]-ميو-إينوزيتول. تم تنفيذ استخراج InsP العالمية وتشغيل SAX-HPLC في نفس اليوم. (A) الأطياف الكاملة؛ (B, C) تكبير/تصغير ملف التعريف المعروض في A. يتم تمييز جميع القمم المرئية وتعيينها لأنواع InsP المقابلة. استنادا إلى نشر التنقل الكروماتوغرافي5,7, InsP4a يمثل المرجح Ins(1,4,5,6)P4 أو Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a يمثل InsP5 [2] -OH], InsP5b يمثل InsP5 [4-OH] أو نموذجها enantiomeric InsP5 [6-OH] ، و InsP5c يمثل InsP5 [1-OH] أو شكله enantiomeric InsP5 [3-OH]. لا تزال طبائع isomeric InsP3a-c، InsP4b، InsP7، و InsP8 غير معروفة. لوحة (D) يعرض SAX-HPLC ملف تعريف من النباتات التي نمت بشكل متطابق ولكن باستخدام عمود العمر (> 40 أشواط). وهناك انخفاض واضح من InsP6 بالمقارنة مع الأنواع الأخرى InsP وعدم وجود PP-InsPs مرئية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig2v2.jpg"> الشكل 2: نبذة عن InsP التمثيلية لمحطات L. japonicus. SAX-HPLC الشخصي (A\u2012C) من 17 يوما من نوع البرية (Gifu) L. japonicus الشتلات radiolas مع [3H]-ميو -إينوزيتول.myo (A) الأطياف الكاملة؛ (B, C) تكبير/تصغير ملف التعريف المعروض في A. يتم تمييز جميع القمم المرئية وتعيينها لأنواع InsP المقابلة. استنادا إلى نشر التنقلات الكروماتوغرافي5,7, InsP4a يمثل المرجح Ins(1,4,5,6)P4 أو Ins(3,4,5,6)P4, InsP5b المرجح يمثل InsP5 [4-OH] أو شكله enantiomeric InsP5 [6-OH] ، و InsP5c يمثل على الأرجحInsP 5 [1-OH] أو شكله enantiomeric InsP5 [3-OH]. طبائع isomeric من InsP3a-c، InsP4b، InsP7، و InsP8 غير معروفة. (D) مقارنة بين الأنواع InsP الفردية (في ٪ من إجمالي النشاط من elution 25\u201296) من A. الثاليانا (بيانات من الشكل 1A\u2012C) وL. japonicus (البيانات من الشكل 2A-C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig2v2large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig03.jpg"> الشكل 3: لمحات InsP لعينة مقسمة توضح إمكانية استنساخ تحليلات SAX-HPLC. (A\u2012C) SAX-HPLC من 17 يوما من نوع البرية (كول-0) شتلات Arabidopsis radiolabeled مع [3H]-ميو-إينوزيتول. قبل المدى، تم تقسيم العينة ونصف تشغيل على الفور ونصف واحد واحد في وقت لاحق بعد يوم واحد بعد التخزين في -80 درجة مئوية (A) كامل الأطياف؛ (B, C) تكبير/تصغير ملف التعريف المعروض في A. يتم تمييز جميع القمم المرئية وتعيينها لأنواع InsP المقابلة. استنادا إلى نشر التنقلات الكروماتوغرافي5,7, InsP4a يمثل المرجح Ins(1,4,5,6)P4 أو Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a يمثل InsP5 [2-OH], InsP5a يمثل InsP5 [2-OH], InsP5b يمثل InsP5 [4-OH] أو نموذجها enantiomeric InsP5 [6-OH], و InsP5c يمثل InsP5 [1-OH] أو شكله enantiomeric InsP5 [3-OH]. لا تزال طبائع isomeric InsP3a-c، InsP4b، InsP7، و InsP8 غير معروفة. يعرض اللوحة D القياس الكمي لـ InsP6 و PP-InsPs InsP7 و InsP8 من كلا التشغيلين. تمثل القيم المبلغ (في%) من الأنواع InsP المعنية بالنسبة لجميع InsP (النشاط الكلي من elution 25-96). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig03large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
الشكل التكميلي 1: إعدادات البرامج للمسح السائل باستخدام عداد التلألؤ الخفيف. لقطات تظهر إصدار البرنامج، وكذلك الإعدادات المستخدمة في عد التلألؤ من [3ح] يتم تصوير العينات التي تم تنفيذها مع هذا البروتوكول. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig01.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.</a>
الشكل التكميلي 2: مثال تمثيلي لتطبيع البيانات. لقطة شاشة لورقة عمل تعرض جميع الخطوات والصيغ المستخدمة لتطبيع عمليات SAX-HPLC مع بعضها البعض. للتبسيط، يتم عرض الكسور فقط 25-35 من العينات. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig02.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.</a>
الشكل التكميلي 3: تحديد الذروة، والطرح الخلفية والتكامل باستخدام برامج التحليل. (أ)يتم تحميل البيانات من تحليل SAX-HPLC في البرنامج (دقائق 28-96) ويتم تحديد أداة محلل الذروة. (B\u2012E) يتم تعريف الخط الأساسي يدوياً عن طريق تعيين النقاط بين القمم الفردية ويتم طرح الخلفية. (F) يتم تحديد القمم يدويا على أساس المظهر ونشر التنقلات الكروماتوغرافية5,7. (G) يتم تعريف نطاقات الذروة يدويًا بواسطة قيم cpm. (H) يتم دمج القمم وحسابها كنسبة مئوية من جميع القمم. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig03.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC at JoVE.com

Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC

هنا نحن وصف قوية anion تبادل عالية الأداء الكروماتوغرافيا السائلة من [3H]-ميو-الإينوزيتول- التسمية الشتلات التي هي طريقة حساسة للغاية للكشف عن وقياس البولي فوسفات إينوزيتول في النباتات.

استخراج واستخلاص كمي للذوبان, المشع الإينوزيتول بولي فوسفات من أنواع النباتات المختلفة باستخدام SAX-HPLC

The phosphate esters of myo-inositol, also termed inositol phosphates (InsPs), are a class of cellular regulators playing important roles in plant ...

البروتوكول أظهرت هنا يمكن أن تساعد على توضيح التركيب الحيوي من البولي فوسفاتات إينوزيتول من النباتات والإجابة على الأسئلة المتعلقة بدورها في جوانب معينة من التمثيل الغذائي النباتي والتنمية. هذه الطريقة هي حساسة للغاية لأن استخدام السلائف المسمى إشعاعا من الفوسفات إينوزيتول يسمح للكشف الموثوق بها لجميع أنواع الفوسفات إينوزيتول في النباتات. إن العرض التوضيحي المرئي لهذه الطريقة مهم لأن معظم علماء الأحياء النباتيين غير معتادين على تحليل HPLC والإعداد المطلوب.بالإضافة إلى ذلك، من الصعب اتباع الخطوات الحاسمة لهذا البروتوكول، مثل استخراج الفوسفات الإينوزيتول، دون مظاهرة مناسبة. تبدأ من خلال إعداد نظام يتكون من اثنين من مضخات HPLC مستقلة، واحدة للمخزن A واحد لمضخات B.Both العازلة تحتاج إلى التحكم معا عن طريق جهاز كمبيوتر أو مضخة رئيسية. تنفيذ غسل الختم المكبس لكلا المضخات، إما عن طريق قوة الجاذبية أو من خلال مضخة الضغط المنخفض الثالثة.توصيل كل من مضخات إلى خلاط ديناميكي, ثم توصيل الخلاط لصمام حقن مع حلقة عينة التي لديها على الأقل قدرة ملليلتر واحد. استخدم الشعيرات الدموية لتوصيل صمام الحقن بالعمود والعمود إلى جامع الكسور. زرع بذور اللوتس في صف واحد على أطباق بيتري مربع مليئة وسائل الإعلام نموا الصلبة التي تتكون من 0.8٪ الأجار البكتريولوجية في المياه الأيونية.السماح للبذور إلى تقسيم لمدة ثلاثة أيام على الأقل في أربع درجات مئوية في الظلام. ضع البذور في حاضنة النمو. نقل 10 إلى 20 شتلة في بئر واحد من 12-جيدا واضحة لوحة ثقافة الخلية السفلي مسطحة مليئة مليلترين من محلول ملح التصلب المتعدد نصف القوة التي تستكمل مع 1٪ السكروز وتعديلها إلى درجة حُمر 5.7.إضافة 45 ميكروكوري من 3H ميو-إينوزيتول إلى لوحة ودوامة بلطف. غطي الطبق بغطاء وختمه بشريط جراحي صغير. ثم ضعه مرة أخرى في حاضنة النمو.بعد خمسة أيام من وضع العلامات، وإزالة الشتلات من وسائل الإعلام وغسلها لفترة وجيزة مع المياه ديوند. جففها بمناشف ورقية ونقلها إلى أنبوب ميكروسنتروفوج 1.5 ملليلتر، مع التأكد من عدم الإفراط في ملء الأنبوب. المفاجئة تجميد الأنبوب في النيتروجين السائل وتخزينه في ناقص 80 درجة مئوية حتى الاستخراج.خذ العينات من الفريزر والاحتفاظ بها في النيتروجين السائل حتى تصبح جاهزة للاستخدام. طحن لهم مع أنبوب microcentrifuge آفة حتى تبدأ في الذوبان، ثم إضافة 500 ميكرولترات من الجليد الباردة استخراج العازلة. مواصلة طحن حتى يتم تجانس العينة والحل هو الملونة.أجهزة الطرد المركزي العينات لمدة 10 دقائق في 18،000 مرة G وأربع درجات مئوية. ثم نقل المناط إلى أنبوب 1.5 ملليلتر الطازجة. وتعتبر الأنابيب المستخدمة في الاستخراج نفايات مشعة صلبة وتحتاج إلى التخلص منها وفقا لذلك.إضافة بعناية 300 ميكرولتررس من تحييد العازلة إلى استخراج، والتي سوف تسبب على الفور هطول الأمطار من البروتينات ومحتدما. بعد دقيقة واحدة، اخلطي العينة مع طرف ماص وماصات خمسة ميكروليت على ورق pH للتأكد من أن نسبة الـ PH تتراوح بين سبعة وثمانية. إذا لزم الأمر، إضافة كميات صغيرة من إما تحييد العازلة أو استخراج العازلة حتى يتم الوصول إلى درجة حُكم الاستخلاص المطلوب والسماح للعينات بقية على الجليد لمدة ساعة واحدة على الأقل مع غطاء مفتوح.ثم الطرد المركزي لهم لمدة 10 دقائق ونقل المابير في أنبوب 1.5 ملليلتر الطازجة. تجهيز جامع الكسور مع 96 قنينة صغيرة من التألق وملء كل قارورة مع ملليلترين من كوكتيل التلألؤ مناسبة متوافق مع مخازن درجة ح OH منخفضة وتركيزات عالية من فوسفات الأمونيوم. بدء تشغيل نظام HPLC، ثم تفعيل غسل الختم المكبس والحفاظ على تنشيطه خلال المدى كله.حقن العينة يدويا مع حقنة مناسبة. بدء تشغيل المضخات والتدرج. أثناء تشغيل HPLC مستمر، تحقق من الضغط بانتظام.ضغط البداية يجب أن يكون حوالي 18 إلى 24 بار وينبغي أن ترتفع ببطء إلى 50 إلى 60 شريط مرة واحدة يتم التوصل إلى 100٪ المخزن المؤقت B. بعد المدى، وإغلاق قوارير بإحكام وهز بقوة الكسور مع كوكتيل التلألؤ لخلط. إذا لم يكن المضي مباشرة مع القياس، والحفاظ على قارورة في وضع مستقيم في الظلام.لقياس الكسور، أدخل القنينات في رفوف مضادة التلألؤ باستخدام رفوف تناسب القنينات الصغيرة وتقيس كل قارورة لمدة خمس دقائق في عداد التلألؤ السائل. قم بإعداد مخطط خطي 2D حيث يتم رسم عدد القياسات في الدقيقة أو CPM مقابل وقت الاحتفاظ. لمقارنة العينات مع بعضها البعض، تطبيع البيانات عن طريق تلخيص CPM من كل كسر مائل من الدقيقة 25 إلى 96 لكل عينة الفردية وعن طريق تقسيم إجمالي CPM من تلك العينة على إجمالي CPM من العينات الأخرى.لتنفيذ القياسات النسبية لبعض قمم البولي فوسفات إينوزيتول، ثم إنشاء الرسوم البيانية شريط التي تحتوي على بيانات من النسخ المتماثل للتحليلات الإحصائية، مواصلة التحليل مع البرامج المتخصصة التي يمكن حساب مناطق الذروة من الكروماتوجرامات. يتم عرض كامل من قبل الإينوزيتول متعدد الفوسفات التي تم الحصول عليها من مقتطفات A.thaliana بعد العد التلألؤ هنا. يتم فصل القمم بشكل جيد ويمكن تعيينها إلى الأيزومرات المختلفة.عندما يتم استخدام عمود العمر, انخفاض واضح من hexakisphosphate إينوزيتول وعدم وجود بيروفوسفات إينوزيتول مرئيا. كما تم إجراء تحليل SAX-HPLC على شتلات L.japonica التي نمت ووصفت في ظل نفس الظروف مثل شتلات Arabidopsis. في حين يفترض أن جميع أنواع البولي فوسفات إينوزيتول والقمم التي تعرف من Arabidopsis يمكن أن ينظر إليه, هناك اختلافات في الكميات النسبية من ايزومرات إينوزيتول متعددة الفوسفات محددة بين النوعين.ولإثبات أن العينات لا يتعين تحليلها مباشرة بعد الاستخراج، تم تقسيم عينة واحدة إلى اثنين ونصفها تم تحليلها في اليوم التالي بعد التخزين عند ناقص 80 درجة مئوية. ولم تكن الاختلافات بين مواصفات SAX-HPLC للعينات الطازجة والمجمدة كبيرة، مما يدل على أن دورة التجميد-ذوبان الجليد الواحدة لا تضر بالعينة وأن الطريقة نفسها تولد نتائج قابلة للاستنساخ. عند محاولة هذا البروتوكول, طحن دائما العينات بدقة, المجمدة ومع العازلة استخراج, وتهدف إلى قريبة من درجة PH محايدة بعد تحييد لضمان أقصى قدر من الانتعاش من الفوسفات إينوزيتول المسمى الراديو لتحليل SAX-HPLC.فمن الممكن لتنقية radio-labeled من تشغيل SAX-HPLC لاستخدامها في وقت لاحق، على سبيل المثال في ردود الفعل المتبادلة عن طريق جمع الكسور دون كوكتيلات التلألؤ وقياس aliquots الصغيرة فقط.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

تصميم تجريبي ليزر تسليخ مجهري RNA تسلسل: دروس من تحليل التنمية الذرة ورقة

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

وهناك طريقة استخراج مجزأة بسيطة للتحليل الشامل من الأيض، والليبيدات، والبروتينات من عينة واحدة

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

مرنا إنتيراكتوم التقاط من بروتوبلاستس النبات

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

والعزلة وقياسات الجهاز التنفسي من الميتوكوندريا من التمويل نبات

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

تجزئة للقرار من الأنواع هونتينجتين القابلة للذوبان وغير قابلة للذوبان

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

نبات رذاذ الكتلي: أسلوب تاين المحيطة سريع مباشرة تقييم نواتج الأيض من الأنسجة النباتية

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

استخراج الكافيين والنشاط الأنزيمي والتعبير الجيني ل Synthase الكافيين من تعليق خلية النبات

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

استخدام الأنابيب الفلورية الرنين نقل الطاقة لدراسة ديناميات البروتين المجمعات في مقياس زمني ميلي ثانية

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

تحليل RNA لطخة للكشف عن و الكم من MicroRNAs النبات

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

تقدير محتوى اللجنين الكتلة الحيوية النباتية باستخدام حمض ثيوغليكوليك (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...