Name: extraction and quantification of soluble, radiolabeled inositol polyphosphates from different plant species using sax-hplc
Uploaded: 2020-06-26T15:00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC at JoVE.com

Dette arbejde blev finansieret af Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) under Tysklands excellencestrategi - EXC-2070 – 390732324 (PhenoRob), forskningsuddannelsesgruppen GRK2064 og individuelle forskningsbevillinger SCHA1274/4-1 og SCHA1274/5-1 til G.S.. Vi takker også Li Schlüter og Brigitte Ueberbach for teknisk bistand.

Forfatterne har intet at afsløre.

Her præsenterer vi en alsidig og følsom metode til at kvantificere InsPs herunder OPP-InsPs i planteekstrakter og give praktiske tips om, hvordan man får denne metode etableret. Selvom protokollen generelt er robust, kan der forekomme suboptimale kørsler og analyser. I de fleste tilfælde kan disse kørsler identificeres ved en kraftig reduktion eller endog fuldstændig tab af stærkt fosforylerede InsP'er, især PP-InsP-arterne InsP7 og InsP8. Mulige årsager kan være mikrobielle kontamineringer af plantematerialet og utilstrækkelig deaktivering af endogene plante PP-InsP hydrolaser under udvinding på grund af utilstrækkelig slibning og optøning af plantemateriale, som ikke vil være i umiddelbar kontakt med udvindingsbuffer. Yderligere årsager omfatter unøjagtig pH-justering ved utilstrækkelig eller overdreven tilsætning af neutralisering buffer, eller simpelthen utilstrækkelig prøvemateriale. Sidstnævnte kan gøre det vanskeligt at påvise PP-InsPs, da disse ofte er til stede i meget lave mængder i cellerne. Et overskud af prøvemateriale eller ineffektiv tørring under trin 3.5 kan forårsage fortynding af perchlorsyren, hvilket derfor også fører til utilstrækkelig enzymaktivering og et specifikt tab af InsP6 og PP-InsP. Mængden af plantemateriale samt det radiomærke, der anvendes i denne protokol, blev optimeret baseret på omkostninger og ydeevne og er derfor tæt på den laveste mængde, der stadig er tilstrækkelig til at give optimale resultater. Desuden vil kolonne harpiksen gradvist miste sin opløsningskapacitet. Det første tegn på denne proces er (af grunde, der ikke er helt klart for forfatterne) et specifikt tab af højere fosforylerede InsP arter som PP-InsPs i HPLC spektrum. Med yderligere aldring, vil selv InsP6 ikke blive løst korrekt af kolonnen (Figur 1D). Derfor er brugen af en passende kolonne samt omhyggelig håndtering af prøven og korrekt vedligeholdelse af HPLC-komponenterne afgørende for at sikre nøjagtige resultater.
Når man sammenligner prøver og kørsler, især når de genereres med forskelligt udstyr (f.eks. HPLC-systemer og kolonner) eller på forskellige dage, er det afgørende at normalisere prøverne med hinanden (som beskrevet i trin 7.3) og analysere dem på samme måde. Kun gennem normalisering er det muligt og nøjagtigt at vise flere prøver i samme graf (Figur 3). Ved kvantificering af individuelle InsP'er i forhold til de samlede InsP-arter eller til en anden specifik InsP-art er det ikke nødvendigt at normalisere, så længe der kun vises relative værdier og ikke absolutte værdier. Ideelt set vises både InsP-profilerne og kvantificeringerne. I nogle tilfælde er det dog ikke muligt i tilstrækkelig grad at vise to eller flere kørsler i samme graf. Forskellige opbevaringstider eller forskellige niveauer af baggrundsaktivitet kan gøre det vanskeligt at sammenligne ikke-kvantificerede SAX-HPLC-profiler alene. Det samme gælder, når mange prøver skal sammenlignes. I sådanne tilfælde er det nødvendigt med en yderligere evaluering ved hjælp af en yderligere software (f.eks.
Forfatterne er klar over, at den protokol, der er beskrevet her, kan optimeres og skal tilpasses hvert enkelt forskningsspørgsmål. Selv om der optimeres for Arabidopsis ekstrakter 7,17 i denne protokol, denne metode er alsidig og kan hjælpe med at bestemme InsP profiler af andre plantearter samt. Her er vi et eksempel på denne mulighed ved for første gang at præsentere en InsP-profil for L. japonicus, som ikke krævede ændringer af mærkningsbetingelserne, InsP-ekstraktionen eller SAX-HPLC-kørslen (Figur 2). Især, mens den samlede lignende, forskelle er observeret mellem L. japonicus og Arabidopsis InsP profiler. For eksempel i L. japonicus InsP5 [4-OH] eller dens enantiomeric form InsP5 [6-OH] er mere rigelige end InsP5 [1-OH] eller dens enantiomeric form InsP5 [3-OH] i forhold til Arabidopsis, hvor InsP5 [1-OH] eller dets enantiomeriske form InsP5 [3-OH] er den dominerende InsP5-art. På samme måde forventer vi, at ændringer i mediesammensætningen, [3H]- myo-inositol koncentration, plantealder, miljøforhold (f.eks lys og temperatur), tilsætning af kemiske forbindelser eller analyser af plantemikrobielle interaktioner blandt andre faktorer, kan være nødvendigt at teste og tilpasse.myo
En vigtig ulempe ved denne metode, der skal overvejes, er, at mærkningen sker i en (steril) flydende kultur, som ikke repræsenterer et fysiologisk miljø for de fleste jordplanter. På grund af de høje omkostninger ved [³H]- myo-inositol er mærkningsopløsningens volumen og kulturbeholderens størrelse desuden generelt begrænset, hvilket også begrænser størrelsen af de planter, der kan anvendes.myo Dyrkning i flydende kultur kan undgås ved direkte at infiltrere for eksempel blademyoaf jorddyrkede planter med [³H]- myo-inositol og efterfølgende efter den protokol, der er beskrevet her, som tidligere rapporteret10.
Der er flere ulemper ved denne protokol i forhold til alternative metoder, såsom TiO2 pull-down efterfulgt af PAGE eller massespektrometri baserede teknikker. På grund af [3H]- myo-inositol mærkning, kun InsP arter, der direkte stammer fra radioaktivt mærket myo-inositolvil blive opdaget i sidste ende.myo Den metode, der er beskrevet her, er blind for andre Ins isomerer såsom scyllo-inositol og andre isomerer hvoraf nogle er blevet identificeret i visse planter44. Endvidere, myo-InsPsstammer fra andre veje vil blive udelukket, herunder dem syntetiseret af de novo syntese af myo-inositol og myo-inositol-3-fosfatvia isomerisering af glukose-6-fosfat, katalyseret af myo-inositol-3-phosphatsyntase (MIPS) proteiner45. myo Selv om [32P] eller [33P]- ortho-fosfat kan bruges som alternative etiketter, deres anvendelse udgør en stor ulempe, da hver fosfat-holdige molekyle, herunder de rigelige nukleotider og derivater heraf, vil blive mærket.ortho Disse molekyler kan også udvindes med denne protokol og binde sig til SAX kolonne, hvilket vil resultere i et højt niveau af baggrundsaktivitet, der vil forstyrre identifikationen af individuelle InsP toppe5. Desuden kan kvantificering af [32P] - eller [33P] -mærket InsP og P-InsPs være stærkt påvirket af fosfat og pyrophosphat moiety omsætning og kan ikke rapportere en masse udlæsning for inositol arter.
På den anden side, [3H]- myo-inositol specifikt etiketter myo-inositol-holdigemolekyler.myo InsPs, inositol-holdige lipider, såsom fosforinositider, og galactinol er i dette tilfælde mærket. Det er dog kun InsPs, der analyseres med denne protokol, da lipider er uopløselige i ekstraktionsbufferen, og galactinol ikke binder sig til SAX-kolonnen.
Hidtil er forskellene fra en plante InsP profil genereret af [3H]- myo-inositol mærkning sammenlignet med en bestemt af TiO2 pulldown / PAGE er fortsat ukendt, da sådanne sammenligninger ikke er blevet udført i planter.myo En nylig undersøgelse i dyreceller behandlet dette spørgsmål46. I dette værk blev en pulje af InsP6, der er usynlig ved [3H]- myo-inositol mærkning, som derved skulle være direkte afledt af glukose-6-fosfat, identificeret ved at sammenligne SAX-HPLC profiler med PAGE geler af pattedyr cellelinjer.myo 24 h fosfatsultelse resulterede i en 150% stigning i InsP6 ved kvantificering af PAGE geler af InsPs renset ved hjælp af TiO2 pulldown. SAX-HPLC-analyser af [3H]- myo-inositol-mærkede celler, der blev behandlet ens, viste kun en stigning på 15 % af [3H]-InsPmyo6. Som tidligere nævnt, InsPs lavere end InsP5 er målbart med PAGE analyse i de fleste tilfælde. Radiolabeling efterfulgt af SAX-HPLC synes at være den foretrukne metode, så længe massespektrometriske protokoller ikke er optimeret til at detektere denne gruppe af meget negativt ladede molekyler.
En anden tilbageværende udfordring er at skelne mellem enantiomere i SAX-HPLC-analyser (eller i enhver anden metode til InsP-analyse)10,17. Denne udfordring kan løses ved tilsætning af chiral selektorer, dvs enantiopure forbindelser som L-arginin midt, der interagerer med de respektive enantiomeriske molekyler til at danne diastereomeric komplekser, der kan adskilles10. Så langtviden er denne fremgangsmåde kun blevet gennemført for at diskriminere den enantiomeriske InsP5 isomerer InsP5 [1-OH] og InsP5 [3-OH] ved NMR-analyser10. Der er endnu ikke rapporteret om forskelsbehandling af andre enantiomeriske par eller vellykket forskelsbehandling af enantiomere ved hjælp af chiral SAX-HPLC-analyse eller chiral PAGE-baserede metoder, som bør videreudvikles. I betragtning af den bevarede syntese og den bevarede regulering af PP-InsP'er ved hjælp af fosfortilgængelighed forestiller vi os, at især ikke-radioaktive metoder såsom PAGE- eller MS-baserede metoder sammen med næringsstofanalyser vil hjælpe med at justere deektionsdata, der er beregnet til at diagnosticere næringsstofmangleriafgrøderne 17,18,24,25. Men den metode, der præsenteres her, kan i øjeblikket stadig betragtes som guldstandarden for InsP-analyser og vil være medvirkende til at opdage nye funktioner i disse spændende budbringere i planter.

Næsten fire årtier siden, inositol fosfater (InsPs) frem som signalering molekyler, efter Ins (1,4,5)P3 (InsP3)blev identificeret som en anden budbringer, der aktiverer receptor-medieret frigivelse af Ca2 + i dyreceller1,2. Til dato er der ikke identificeret nogen InsP3-receptor (IP3-R) i planter, hvilket sætter spørgsmålstegn ved en direkte signalrolle for InsP3 i planteceller3. Uanset hvad, InsP3 fungerer som en forløber for andre InsP involveret i flere anlæg udviklingsprocesser, herunder regulering af specifikke signalering veje3,4,5, 6,6,7,8. For eksempel kan InsP3 yderligere fosforyleret til InsP6, også kendt som "fytinsyre", som repræsenterer en vigtig kilde til fosfat, myo-inositol og kationer, og viste sig at spille centrale roller i planteforsvar mod patogener, mRNA eksport og fosfat homøostase5,9,10,11,12. myo
Inositol pyrophosphater (PP-InsPs) er en klasse af InsP'er, der indeholder mindst én højenergi di-fosforbinding, der oprindeligt blev identificeret i dyreceller, amøbe og gær, hvor de spiller en afgørende rolle i forskellige cellulæreprocesser 13,14,15. Trods skelsættende arbejde med PP-InsP'er iplanterne 16,17,18,19,20,21,22,23,2424,25,26, er disse molekylers biologiske funktioner og isomeridentitet stadig stadig stort set gådefulde. I modellen plante Arabidopsis thaliana, cellulære InsP8 blev foreslået at regulere forsvar mod insekt planteædere og nekrotrofiske svampe via tilfældighed-påvisning af InsP8 og aktiv jasmonat af ASK1-COI1-JAZ receptor kompleks17. Desuden er der foreslået roller for InsP8 og andre PP-InsPs inden for homøostase og næringsstoffølning samt fosfathomostase17,23,24,25,26.
Uanset det anvendte biologiske system har en stor metodologisk udfordring ved studier af InsPs været den pålidelige detektion og præcise kvantificering af disse molekyler. Massespektrometri-baserede metoder er blevet brugt til at opdage InsPs, herunder PP-InsPs, fra celleekstrakter. Men disse undersøgelser har undladt at skelne særskilte isomerer26,27. En anden tilgang til at analysere InsPs beskæftiger pull-down af InsPs fra celle lysater ved hjælp af TiO2 perler, efterfulgt af polyarylamid gel elektroforese (PAGE) af eluterede InsPs. InsP'erne kan derefter farves af enten toluidinblå eller DAPI24,28,29. Det er dog indtil videre ikke muligt at påvise InsPs, der er lavere end InsP5, fra planteekstrakter ved hjælp af denne metode. For nylig, en metode ved hjælp af [13C]- myo-inositol for nuklear magnetisk resonans (NMR) analyse af InsPs blev offentliggjort som et alternativ til stærk anion udveksling højtydende flydende kromatografi (SAX-HPLC)myo30. Denne teknik er blevet rapporteret for at opnå en lignende følsomhed i forhold til SAX-HPLC og for at gøre det muligt at detektere 5-InsP7samt forskelsbehandling af forskellige ikke-enantiomeriske InsP5 isomerer fra celleekstrakter. Gennemførelsen af NMR-baserede metode kræver imidlertid kemisk syntetiseret og kommercielt ikke tilgængelig [13C]- myo-inositol.myo Derfor er den metode, der anvendes i de fleste tilfælde radiomærkning prøver med [3H]- myo-inositol, efterfulgt af SAX-HPLC31,32,33.myo Denne teknik er baseret på optagelsen af radioaktive myo-inositol i anlægget og dens omdannelse til forskellige InsPs ved den kombinerede aktivitet af dedikerede cellulære kinaser og fosfataser. myo
De [3H]-mærkede InsP'er ekstraheres derefter og fraktioneres ved hjælp af SAX-HPLC. På grund af deres negative ladning interagerer InsP'erne stærkt med den positivt ladede stationære fase af SAX-HPLC-kolonnen og kan elueres med en buffergradient, der indeholder stigende fosfatkoncentrationer for at udkonkurrere InsP'er fra kolonnen. Elution gange afhænger således af ladning og geometri af InsP arter, der skal adskilles. I mangel af chiral kolonner, kun ikke-enantiomeric isomerer kan ved adskilt af denne protokol. Men, radioaktivt mærkede standarder kan bruges til at tildele den isomeric karakter af en bestemt InsP peak. Forskellige laboratorier har tidligere gjort en større indsats for at generere mærkede og ikke-mærkede standarder med (bio)kemiske metoder eller rense dem fra forskellige celler og organismer, har bidraget til at tildele toppe til visse InsP-arter og også at indsnævre den isomeric identitet af de enkelte InsP-arter5,7,21,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43. Den nylige belysning af enzymatiske veje, der fører til dannelsen af PP-InsP'er i planter, samt opdagelsen af en bakteriel type III-effektor med en specifik 1-fytaseaktivitet, giver også oplysninger om, hvordan der kan genereres nyttige standarder for disseanalyser 10,17,18,22,23.
De resulterende fraktioner kan måles i en flydende scintillation tæller på grund β af tritium (3H). Med stigende mærkningstid opnås en stabil isotoplige ligevægt, hvorefter de opnåede InsP-profiler skal repræsentere anlæggets InsP-status31. Den største fordel ved denne protokol i forhold til andre tilgængelige teknikker er den høje følsomhed, der opnås ved at anvende den direkte forløber for InsP'er og målingen af et radioaktivt signal.
SAX-HPLC af prøver udvundet af [3H]- myo-inositol-mærkede planter eller andre organismer er almindeligt anvendt til påvisning og kvantificering af InsP-arter lige fra lavere InsP-arter til PP'er, hvilket udgør et værdifuldt redskab til bedre at forstå insp'ernes stofskifte, funktion og virkningsmåder.myo Hidtil, denne metode er også den mest hensigtsmæssige valg for forskere med særlig interesse i lavere InsP arter. Mens det grundlæggende i denne procedure, som den protokol, der er beskrevet her bygger på, tidligere er blevetbeskrevet 7,21,31,34, mangler der stadig en detaljeret protokol, der er skræddersyet til analysen af plantebaserede insp'er og især af OPP-insP'er. Tidligere publikationer rapporterede om vanskeligheder med pålideligt at opdage de lavt rigelige OPP-insP'er, især InsP8, på grund af en eller flere af følgende faktorer: relativt små mængder plantemateriale, [3H]-myo-inositol med lav specifik aktivitet (> 20 Ci/mmol), brug af ekstraktionsbuffere, der enten ikke er baseret på perchlorsyre eller er mindre koncentreret end 1 M, forskellige neutraliserende buffere samt suboptimale gradienter eller påvisning af [3H] med en onlinedetektor. I forhold til disse undersøgelser er den protokol , der præsenteres her , beregnet til pålidelig påvisning af PP-InsP7,21,34.
Her præsenterer vi en detaljeret arbejdsgang, der starter fra opsætningen af udstyret til plantedyrkning og mærkning, InsP-udvinding og selve SAX-HPLC-løbet. Selv om metoden blev optimeret til modellen plante A. thaliana, kan det nemt ændres til at studere andre plantearter, som vist her med den første rapporterede InsP profil af modellen bælgplanter Lotus japonicus. Selv om brugen af en anden planteart kan kræve en vis optimering, vi forestiller os, at disse vil være mindre, hvilket gør denne protokol et godt udgangspunkt for yderligere forskning i plante InsPs. For at lette mulige optimeringer angiver vi alle trin i den protokol, hvor ændringer er mulige, samt alle kritiske trin, der kan være udfordrende, når metoden etableres for første gang. Derudover rapporterer vi, hvordan data, der er indhentet ved denne metode, kan bruges til kvantificering af specifikke InsP'er, og hvordan forskellige prøver kan analyseres og sammenlignes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>model: 5430 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diammonium hydrogen phosphate, &#8805;97 %</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>0268.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate, &#8805;99 %, p.a., ACS</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>8043.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 12-well clear flat bottom TC-treated multiwell cell culture plate, with lid, individually wrapped, sterile</td>
			<td>Corning Inc.</td>
			<td>353043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>LAMBDA Instruments GmbH</td>
			<td>model: OMNICOLL single channel collector</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth incubator</td>
			<td>poly klima GmbH</td>
			<td>model: PK 520-LED</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC pumps</td>
			<td>Kontron Instruments</td>
			<td>model: 420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC syringe for Rheodyne valves, 1 mL</td>
			<td>Hamilton Company</td>
			<td>81365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injector for HPLC</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>model: Rheodyne 9725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inositol, myo-[1,2-3H(N)]</td>
			<td>American Radiolabeled Chemicals Inc.</td>
			<td>ART 0261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid nitrogen</td>
			<td>University, Chemistry Department</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid scintillation counter</td>
			<td>PerkinElmer Inc</td>
			<td>model: TRI-CARB 2900TR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro pestle</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>CXH7.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixed cellulose Eester filter, ME range (ME 24), plain, 0.2 &#181;m pore size, 47 mm circle</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>10401770</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer for HPLC</td>
			<td>Kontron Instruments</td>
			<td>model: M 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murashige &#38; Skoog medium, salt mixture</td>
			<td>Duchefa Biochemie</td>
			<td>M0221</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OriginPro software</td>
			<td>OriginLab Corp.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orthophosphoric acid, &#8805;85 %, p.a., ISO</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>6366.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Partisphere 5 &#181;m SAX cartridge column, 125 x 4.6 mm</td>
			<td>Hichrom Limited</td>
			<td>4621-0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perchloric acid, 70 %, 99.999 % trace metals basis</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>311421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish, square, PS, clear, 120/120/17 mm, sterile</td>
			<td>Greiner Bio One International GmbH</td>
			<td>688161</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH-indicator paper pH 5.5 - 9.0, Neutralit</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>109564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phytagel</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8169</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium carbonate</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>P743.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Safe-Lock tubes, 1.5 mL</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>30120086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample loop for 9725 injectors, volume 2 mL, PEEK</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>57648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SNAPTWIST scintillation vial, 6.5 mL</td>
			<td>Simport Scientific Inc.</td>
			<td>S207-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile bench</td>
			<td>LaboGene</td>
			<td>model: ScanLaf MARS 900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, &#8805;99,5 %, p.a.</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>4621.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultima-Flo AP liquid scintillation cocktail</td>
			<td>PerkinElmer Inc</td>
			<td>6013599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure deionized water</td>
			<td>Milli-Q</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wrenchless WVS End Fitting Kit</td>
			<td>Hichrom Limited</td>
			<td>4631-1001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

extraction and quantification of soluble, radiolabeled inositol polyphosphates from different plant species using sax-hplc

Fosfat estere af myo-inositol, også kaldet inositol fosfater (InsPs), er en klasse af cellulære regulatorer spiller vigtige roller i plantefysiologi. myo På grund af deres negative ladning, lav forekomst og modtagelighed for hydrolytiske aktiviteter er detektion og kvantificering af disse molekyler udfordrende. Dette er især tilfældet for stærkt fosforholdige former, der indeholder diphospho-bindinger med "høj energi", også kaldet inositolpyophosphater (PP-Insp'er). På grund af sin høje følsomhed, stærk anion udveksling højtydende flydende kromatografi (SAX-HPLC) af planter mærket med [3H]- myo-inositol er i øjeblikket den foretrukne metode til at analysere disse molekyler.myo Ved at bruge [3H]- myo-inositol til radiolabel plante planter, forskellige InsP arter, herunder flere ikke-enantiomeriske isomerer kan påvises og diskrimineres med høj følsomhed.myo Her beskrives opsætningen af et egnet SAX-HPLC-system samt hele arbejdsgangen fra plantedyrkning, radiomærkning og InsP-udvinding til SAX-HPLC-kørslen og efterfølgende dataanalyse. Den protokol, der præsenteres her, gør det muligt at diskriminere og kvantificere forskellige InsP-arter, herunder flere ikke-enantiomeriske isomerer og af PP-InsPs, InsP7 og InsP8, og kan let tilpasses andre plantearter. Som eksempler, SAX-HPLC analyser af Arabidopsis thaliana og Lotus japonicus planter udføres og komplet InsP profiler præsenteres og diskuteres. Den metode, der er beskrevet her, repræsenterer et lovende redskab til bedre at forstå insps' biologiske roller i planter.

De resultater, der vises her, har til formål at illustrere mulige resultater opnået i henhold til variationer på teknisk og biologisk plan. Den første eksemplificeres ved analyser ved hjælp af nye kontra gamle søjler (figur 1) og friske kontralagrede prøver (figur 3) og den anden ved at evaluere ekstrakter fra to forskellige plantesystemer, A. thaliana (Figur 1, Figur 3) og L. japonicus (Figur 2).
En optimal SAX-HPLC køre er afbildet på figur 1A\u2012C, som viser en komplet inositol polyphosphat spektrum opnået fra A. thaliana ekstrakter efter scintillation optælling. Bemærk, at toppe er pænt adskilt og kan tildeles forskellige isomerer (eller enantiomer-par) baseret på kromatiske mobiliteter beskrevettidligere 5,7.
Figur 2 viser det repræsentative resultat af en SAX-HPLC-analyse af L. japonicus-planter, der blev dyrket og mærket under de samme betingelser som de arabiske frøplanter. Mens formentlig alle InsP arter og toppe, der er kendt fra Arabidopsis kan ses, der er betydelige forskelle med hensyn til den relative (f.eks forholdet mellem isomerer) mængden af specifikke InsP isomerer, når man sammenligner profiler af begge arter. For eksempel, Lotus ekstrakter viste øget InsP3c, InsP4b, InsP5b og reduceret InsP3a, InsP4a, InsP5a og InsP5c i forhold til Arabidopsis, som giver plads til yderligere undersøgelser. Figur 2D illustrerer de forskellige forhold mellem InsP isomerer mellem Arabidopsis og Lotus.
Figur 3 viser to InsP-profiler af en prøve, der blev opdelt efter ekstraktionen. Den første halvdel blev straks analyseret og den anden halvdel en dag senere, efter opbevaring ved -80 °C. Bemærk, at der kun observeres mindre forskelle mellem de forskellige prøver (dvs. sorte og røde linjer i figur 3A\u2012Cog figur 3D). Dette illustrerer, at en fryseoptøningscyklus ikke skader prøven, og at selve metoden giver reproducerbare resultater.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig01.jpg"> Figur 1: Typisk InsP-profil for en vellykket og mislykket SAX-HPLC-analyse, der udføres med denne protokol. (A\u2012C) SAX-HPLC profil af 17-dages gamle vilde-type (Col-0) Arabidopsis planter radioaktivt mærket med [3H]- myo-inositol.myo Global InsP-udvinding og SAX-HPLC-kørsel blev udført samme dag. a) fuld spektre bB, c) Zoom-ins af den profil, der vises i A. Alle synlige toppe er fremhævet og tildelt de tilsvarende InsP arter. Baseret på offentliggjorte kromatografiskemobiliteter 5,7, InsP4a sandsynligvis repræsenterer Ins(1,4,5,6)P4 eller Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a repræsenterer InsP5 [2-OH], InsP5b repræsenterer InsP5 [4-OH] eller dens enantiomeric form InsP5 [6-OH], og InsP5c repræsenterer InsP5 [1-OH] eller dens enantiomeric form InsP5 [3-OH]. Den isomeric karakter af InsP3a-c, InsP4b, InsP7, og InsP8 er stadig ukendt. Panel (D) viser en SAX-HPLC-profil af ensvoksne planter, men ved hjælp af en ældet kolonne (>40 kørsler). En klar reduktion af InsP6 sammenlignet med andre InsP-arter og fraværet af OPP-insp'er er synlig. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig2v2.jpg"> Figur 2: Repræsentativ InsP-profil af L. japonicus-planter. SAX-HPLC profil (A\u2012C) af 17-dages gamle vilde-type (Gifu) L. japonicus planter radioaktivt mærket med [3H]- myo-inositol.myo a) fuld spektre bB, c) Zoom-ins af den profil, der vises i A. Alle synlige toppe er fremhævet og tildelt de tilsvarende InsP arter. Baseret på offentliggjorte kromatografiskemobiliteter 5,7, InsP4a sandsynligvis repræsenterer Ins(1,4,5,6)P4 eller Ins(3,4,5,6)P4, InsP5b sandsynligvis repræsenterer InsP5 [4-OH] eller dens enantiomeriske form InsP5 [6-OH], og InsP5c repræsenterer sandsynligvis InsP5 [1-OH] eller dens enantiomeric form InsP5 [3-OH]. Den isomeric karakter af InsP3a-c, InsP4b, InsP7, og InsP8 er ukendt. d)Sammenligning mellem de enkelte InsP-arter (i % af den samlede aktivitet fra elution 25-u201296) af A. thaliana (data fra figur 1A\u2012C) og L. japonicus (data fra figur 2A-C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig2v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61495/61495fig03.jpg"> Figur 3: InsP-profiler for en opdelt prøve, der illustrerer reproducerbarheden af SAX-HPLC-analyser. (A\u2012C) SAX-HPLC profiler af 17-dages gamle wild-type (Col-0) Arabidopsis planter radioaktivt mærket med [3H]- myo-inositol.myo Inden forsketet blev prøven straks opdelt og den ene halvdel kørt med det samme og den anden halvdel en dag senere efter oplagring ved -80 °C.A) Fuld spektre. bB, c) Zoom-ins af den profil, der vises i A. Alle synlige toppe er fremhævet og tildelt de tilsvarende InsP arter. Baseret på offentliggjorte kromatografiskemobiliteter 5,7, InsP4a sandsynligvis repræsenterer Ins(1,4,5,6)P4 eller Ins(3,4,5,6)P4, InsP5a repræsenterer InsP5 [2-OH], InsP5a repræsenterer InsP5 [2-OH], InsP5b repræsenterer InsP5 [4-OH] eller dens enantiomeric form InsP5 [6-OH], og InsP5c repræsenterer InsP5 [1-OH] eller dens enantiomeric form InsP5 [3-OH]. Den isomeric karakter af InsP3a-c, InsP4b, InsP7, og InsP8 er stadig ukendt. Panel D viser kvantificeringen af InsP6 og PP-InsPs InsP7 og InsP8 i begge kørsler. Værdierne repræsenterer beløbet (i %) af de respektive InsP-arter i forhold til alle InsP (samlet aktivitet fra 25-96). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Supplerende figur 1: Softwareindstillinger for væskescintillationstælling ved hjælp af en let scintillationstæller. Skærmbilleder, der viser softwareversionen, samt indstillinger, der bruges til scintillation optælling af [3H] prøver udført med denne protokol er afbildet. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig01.jpg" target="_blank">Klik her for at downloade dette tal.</a>
Supplerende figur 2: Repræsentativt eksempel på datanedalisering. Et skærmbillede af et regneark viser alle trin og formler, der bruges til at normalisere SAX-HPLC, kører til hinanden. Til forenkling er det kun fraktioner, der viser 25-35 prøver. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig02.jpg" target="_blank">Klik her for at downloade dette tal.</a>
Supplerende figur 3: Spidsbelastning, baggrundsindtraktion og integration ved hjælp af analysesoftware. (A) Data fra SAX-HPLC analyse indlæses i softwaren (minutter 28-96), og peak analysator værktøj er valgt. (B\u2012E) Basislinjen defineres manuelt ved at angive punkter mellem individuelle toppe, og baggrunden trækkes fra. (F) Spidsbelastninger bestemmes manuelt på grundlag af udseende og offentliggjorte kromatografiske mobiliteter5,7. (G) Spidsbelastningsområder defineres manuelt ved hjælp af cpm-værdier. HH) Spidsbelastninger integreres og beregnes som % af alle toppe. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61495/61495supfig03.jpg" target="_blank">Klik her for at downloade dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC at JoVE.com

Extraction and Quantification of Soluble, Radiolabeled Inositol Polyphosphates from Different Plant Species using SAX-HPLC

Her beskriver vi stærk anionudveksling højtydende væskekromatografi af [3H]- myo-inositol-mærkede planter, som er en meget følsom metode til at detektere og kvantificere inositolpolyphosphater i planter.myo

Ekstraktion og kvantificering af opløselige, radioaktivt mærkede inositolpolyfosfater fra forskellige plantearter ved hjælp af SAX-HPLC

The phosphate esters of myo-inositol, also termed inositol phosphates (InsPs), are a class of cellular regulators playing important roles in plant ...

Den protokol, der er demonstreret her, kan bidrage til at belyse biosyntesen af inositolpolyfosfater af planter og besvare spørgsmål vedrørende deres rolle i visse aspekter af plantemetabolisme og udvikling. Denne metode er meget følsom, fordi brugen af den radioaktivt mærkede prækursor af inositolphosphater giver mulighed for pålidelig påvisning af alle inositolphosphatarter i planter. Visuel demonstration af denne metode er vigtig, fordi de fleste plantebiologer ikke er bekendt med HPLC-analyse og den nødvendige opsætning.Desuden er kritiske trin i denne protokol, ligesom udvinding af inositolfosfater, vanskelige at følge uden ordentlig demonstration. Begynd med at oprette et system bestående af to uafhængige HPLC-pumper, en til buffer A og en til buffer B.Begge pumper skal styres sammen via en computer eller en master pumpe. Implementer en stempelforseglingsvask til begge pumper, enten via tyngdekraften eller gennem en tredje lavtrykspumpe.Tilslut begge pumper til en dynamisk mixer, og tilslut derefter mixeren til en injektionsventil med en prøvesløjfe, der har mindst en milliliterkapacitet. Brug kapillærer til at forbinde injektionsventilen til søjlen og kolonnen til brøkopsamleren. Så ud lotusfrø i en række på firkantede petriskåle fyldt med solide vækstmedier bestående af 0,8% bakteriologisk agar i deioniseret vand.Lad frøene stratificere i mindst tre dage ved fire grader Celsius i mørke. Placer frøene i en vækst inkubator. Overfør 10 til 20 frøplanter til en brønd af en 12-godt klar flad bundcellekulturplade fyldt med to milliliter halvstyrke MS saltopløsning, der suppleres med 1%saccharose og justeres til pH 5,7.Tilsæt 45 microcurie af 3H myo-inositol til pladen og hvirvle det forsigtigt. Dæk pladen med et låg og forsegle den med mikroporøs kirurgisk tape. Derefter placere den tilbage i vækst inkubator.Efter fem dages mærkning fjernes planter fra medierne og vaskes kortvarigt med deioniseret vand. Tør dem med papirservietter og overføre dem til en 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør, og sørg for ikke at overfylde røret. Fastfrys røret i flydende nitrogen og opbevar det på minus 80 grader Celsius indtil udvinding.Tag prøverne fra fryseren og hold dem i flydende nitrogen, indtil de er klar til brug. Grind dem med en mikrocentrifuge rør støder, indtil de begynder optøning, derefter tilføje 500 mikroliter af iskold ekstraktion buffer. Fortsæt slibningen, indtil prøven er homogeniseret, og opløsningen er farvet.Centrifuge prøverne i 10 minutter ved 18, 000 gange G og fire grader Celsius. Overfør derefter supernatanten til et friskt 1,5 milliliterrør. De rør, der anvendes til udvinding, betragtes som fast radioaktivt affald og skal bortskaffes i overensstemmelse hermed.Tilsæt forsigtigt 300 mikroliter neutraliseringsbuffer til ekstraktet, hvilket straks vil forårsage udfældning af proteiner og boblende. Efter et minut blandes prøven med en pipettespids og pipetter fem mikroliter på pH-papir for at sikre, at pH-oli er mellem syv og otte. Om nødvendigt tilsættes små mængder enten neutraliseringsbuffer eller ekstraktionsbuffer, indtil den ønskede pH-sikkerhedsrisiko er nået, og lad prøverne hvile på is i mindst en time med et åbent låg.Derefter centrifuge dem i 10 minutter og overføre supernatant i en frisk 1,5 milliliter rør. Udstyre fraktionsopsamleren med 96 små scintillationshætteglas og fyld hvert hætteglas med to milliliter af en egnet scintillationscocktail, der er kompatibel med lave pH-buffere og høje ammoniumphosphatkoncentrationer. Start HPLC-systemet, aktivér derefter stempelforseglingsvasken, og hold den aktiveret under hele kørslen.Injicer prøven manuelt med en egnet sprøjte. Start pumperne og gradienten. Mens HPLC-løbet er i gang, skal du kontrollere trykket regelmæssigt.Starttrykket skal være omkring 18 til 24 bar og bør langsomt stige til 50 til 60 bar, når 100% buffer B er nået. Efter løbet skal hætteglassene lukkes stramt og kraftigt ryste fraktionerne med scintillationscocktailen for at blande. Hvis ikke fortsætter direkte med målingen, skal hætteglassene opbevares oprejst i mørke.For at måle brøken skal hætteglassene indsættes i scintillationstællerstativerne med stativer, der passer til de små hætteglas, og hvert hætteglas måles i fem minutter i en væskescintillationstæller. Forbered et 2D-kurvediagram, hvor de målte optællinger pr. minut eller CPM afbildes i forhold til opbevaringstiden. For at sammenligne prøverne med hinanden normaliseres dataene ved at opsummere CPM fra hver eluteret fraktion fra minut 25 til 96 for hver enkelt prøve og ved at dividere den samlede CPM fra den pågældende prøve med den samlede CPM for de andre prøver.For at udføre relative kvantificeringer af visse inositol polyfosfattoppe og efterfølgende oprette søjlediagrammer, der indeholder data om replikatationer til statistiske analyser, skal du fortsætte analysen med en specialiseret software, der kan beregne spidsbelastningsområder for kromatogrammer. Her vises et komplet inositolpolyfosfatspekt fra A.thalianaekstrakter efter scintillationstælling. Toppene er pænt adskilt og kan tildeles forskellige isomerer.Når en ældet kolonne anvendes, er en klar reduktion af inositol hexakisphosphat og fraværet af inositol pyrophosphat synlig. SAX-HPLC analyse blev også udført på L.japonica planter, der blev dyrket og mærket under de samme betingelser som Arabidopsis planter. Mens formentlig alle inositol polyphosphat arter og toppe, der er kendt fra Arabidopsis kan ses, der er forskelle i de relative mængder af specifikke inositol polyphosphat isomerer mellem de to arter.For at påvise, at prøverne ikke behøver at blive analyseret umiddelbart efter ekstraktionen, blev en prøve opdelt i to og halvdelen af den blev analyseret den næste dag efter opbevaring ved minus 80 grader Celsius. Forskellene mellem SAX-HPLC-profilerne for de friske og frosne prøver var ikke signifikante, hvilket viste, at en fryseoptningscyklus ikke skader prøven, og at selve metoden giver reproducerbare resultater. Når du forsøger denne protokol, skal prøverne altid slibes grundigt, fryses og med ekstraktionsbuffer, og målet er tæt på neutral pH efter neutralisering for at sikre maksimal genvinding af radiomærket inositolphosphat til SAX-HPLC-analyse.Det er muligt at rense radio-mærket fra en SAX-HPLC køre til senere brug, for eksempel i gensidige reaktioner ved at indsamle fraktioner uden scintillation cocktails og måling kun små aliquots.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Experimental Design for Laser Microdissection RNA-Seq: Lessons from an Analysis of Maize Leaf Development

Eksperimentel Design for Laser mikrodissektions RNA-Seq: Erfaringer fra en analyse af Maize Leaf Development

Genes with important roles in development frequently have spatially and/or temporally restricted expression patterns. Often these gene transcripts are not ...

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

En enkel fraktioneret ekstraktionsmetode til den omfattende analyse af metabolitter, lipider og proteiner fra en enkelt prøve

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

MRNA Interactome Capture fra Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Isolation og respiratoriske målinger af mitokondrier fra Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Fraktionering for opløsning af opløselige og uopløselige Huntingtin arter

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Leaf Spray massespektrometri: En hurtig omgivende ionisering teknik til direkte vurdere metabolitter fra plantevæv

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Caffeine Extraction, Enzymatic Activity and Gene Expression of Caffeine Synthase from Plant Cell Suspensions

Koffein udvinding, enzymatisk aktivitet og genekspression af koffein syntase fra plante celle suspensioner

Caffeine (1,3,7-trimethylxanthine) is a purine alkaloid present in popular drinks such as coffee and tea. This secondary metabolite is regarded as a ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Bruger i Vitro fluorescens resonans energioverførsel at studere dynamikken i proteinkomplekser på en millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

RNA Blot Analysis for the Detection and Quantification of Plant MicroRNAs

RNA Blot analyse til påvisning og kvantificering af plantemikrorna'er

MicroRNAs (miRNAs) are a class of endogenously expressed non-coding, ~21 nt small RNAs involved in the regulation of gene expression in both plants and ...

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid (TGA)

Estimation of Plant Biomass Lignin Content using Thioglycolic Acid TGA

Skøn over indholdet af plantebiomasse lignin ved hjælp af thioglykolsyre (TGA)

Lignin is a natural polymer that is the second most abundant polymer on Earth after cellulose. Lignin is mainly deposited in plant secondary cell walls ...